siRNA 靶向沉默TAK1 基因對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和p38 MAPK 信號通路的抑制作用

張春英, 陰廣維, 尤鳴達,陳 紅，胡耀杰，李巖冰, 陳春悠

（河北醫(yī)科大學附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000）

轉化生長因子β 激活激酶1（TGF-β activated kinase 1，TAK1） 為p38 絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 家族成員，在免疫反應、炎癥反應和纖維化等疾病中發(fā)揮重要作用，其可通過p38 等多種信號通路發(fā)揮生物學作用［1-2］。TAK1 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程：TAK1 可影響肺癌細胞增殖和侵襲過程［3］；食管癌組織中TAK1 呈高表達，其表達水平與食管癌的TNM 分期、浸潤深度和淋巴結轉移有密切關聯(lián)，TAK1 可能成為食管癌的預后評估指標和治療靶 點［4］。LIN 等［5］研 究 發(fā) 現(xiàn)：TAK1 在 甲 狀 腺 癌組織中呈高表達，其表達水平與患者的臨床分期和淋巴結轉移關系密切。p38 MAPK 是甲狀腺癌增殖和遷移的重要調控因子，p38 MAPK 信號通路激活可促進甲狀腺癌細胞增殖和遷移，抑制p38 MAPK信號通路激活可抑制甲狀腺癌細胞增殖和遷移。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 為細胞增殖的指標，可反映細胞增殖狀態(tài)［6］； 基 質 金 屬 蛋 白 酶 2 （matrix metalloproteinase-2，MMP-2） 和 基 質 金 屬 蛋 白 酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 可有效降解細胞外基質，在細胞的侵襲遷移中發(fā)揮重要作用，MMP-2 和MMP-9 表達是細胞侵襲和遷移的關鍵，抑制其表達可抑制細胞侵襲和遷移過程［7-8］。本研究旨在通過小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）靶向沉默甲狀腺癌細胞中TAK1 表達，探討其對甲狀腺癌細胞增殖、侵襲和遷移以及p38 MAPK 信號通路的影響，闡明TAK1 在甲狀腺癌增殖和遷移中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器正常甲狀腺上皮Nthyori3-1 細 胞 和 甲 狀 腺 癌 8505C、 NPA、BCPAP、KMH-2 細胞（中國科學院上海細胞庫）。siRNA-TAK1 和 陰 性 對 照siRNA （TAK1 siRNA正 義 鏈： 5′-GGACAUUGCUUCUACAAAU-3′，反 義 鏈：5′-GAGUGAAUCUGG ACGUUUA-3′）（上海吉瑪公司設計合成），RPMI-1640 培養(yǎng)基、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒、Trizol 試劑、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、LipofectamineTM2000 轉染試劑盒和MTT 試劑盒（美國Sigma 公司），兔抗鼠PCNA 多克隆抗體、兔抗人TAK1 單克隆抗體、兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體、兔抗鼠MMP-9 多克隆抗體和兔抗鼠p38 多克隆抗體和兔抗鼠磷酸化p38（p-p38）多克隆抗體（美國Cell Signaling 公司）。凝膠成像分析儀（上海Bio-Rad 公司），Transwell 小室（美國Corning 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代將正常甲狀腺上皮Nthyori3-1 細 胞 和 甲 狀 腺 癌 8505C、 NPA、BCPAP、KMH-2 細胞置于含胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，每2～3 d換液2 次，待細胞達80% 以上融合時進行傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的第3 代細胞進行后續(xù)研究。

1.3 qRT-PCR 法檢測細胞中TAK1 mRNA 水平收集第3 代正常甲狀腺上皮Nthyori3-1 細胞和甲狀腺癌8505C、NPA、BCPAP、KMH-2 細胞，加入Trizol 裂解液，提取總RNA，以RNA 為模板逆轉錄合成cDNA。進行PCR 擴增，PCR 反應條件：95 ℃、 5 min；95 ℃、45 s，58 ℃、 30 s，72 ℃、50 s，72 ℃、5 min，共40 個循環(huán)，以GAPDH 為內 參。 TAK1 引 物 序 列： 上 游 引 物 5′-ATTCCACAGATACAATGGCTC-3′，下 游 引 物5′-TGTAGTAACAATGCGATTTGCC-3′。 每 組7個復孔。細胞中TAK1 mRNA表達水平以2－ΔΔCt表示。

1.4 Western blotting 法檢測細胞中TAK1 蛋白表達水平收集第3 代正常甲狀腺上皮Nthyori3-1 細胞和甲狀腺癌8505C、NPA、BCPAP、KMH-2 細胞，加入RIPA 裂解液孵育30 min，提取總蛋白，BCA 法進行蛋白定量測定，將蛋白和loading buffer煮沸變性，取30 μg 蛋白樣品加入上樣孔中，電泳2 h；從玻璃板中取出凝膠，將PVDF 膜放甲醇中孵育10 s，在4℃中轉膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗兔抗人TAK1 單克隆抗體（1∶300），過夜孵育；加入二抗（1∶2 000） 孵育2 h，ECL 發(fā)光，掃描圖像，Image J 分析條帶灰度值。以β-actin 為內參，每組7 個復孔。TAK1 蛋白表達水平=TAK1 蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。選擇TAK1 mRNA 和蛋白表達水平最高的甲狀腺癌細胞（KMH-2 細胞）進行后續(xù)研究。

1.5 細胞分組和處理將第3 代KMH-2 細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組和siRNA-TAK1 組。將各組KMH-2 細胞置于含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉染前1 d 將細胞接種到6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔5×105個細胞，細胞達80%貼壁生長時，按照LipogectamineTM2000 轉染試劑盒說明書進行轉染，陰性對照組細胞轉染陰性對照siRNA，siRNA-TAK1 組細胞轉染TAK1 siRNA，空白對照組細胞不轉染。轉染48 h 時，采用qRTPCR 和Western blotting 法檢測細胞轉染效率（測定細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平），方法同“1.3”和“1.4”。

1.6 MTT 法檢測各組細胞增殖活性將轉染48 h各組KMH-2 細胞接種到24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞，分別培養(yǎng)24、48 和72 h，每孔加入10 μL MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后取出，酶標儀測定各孔波長570 nm 處的吸光度（A）值，代表細胞增殖活性。

1.7 Transwell 小室實驗檢測各組細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)侵襲細胞數(shù)：將Matrigel 基質膠移到4℃冰箱中過夜融化，將Mateigel 基質膠覆蓋在Transwell 小室上室中，放置1 h。將各組細胞濃度調整為1×104個/100 μL，加入到小室上室，每組設7 個復孔，下室加入RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后取出小室，去掉基質膠，甲醛固定1 h，HE 染色，200 倍顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)，即侵襲細胞數(shù)。遷移細胞數(shù)：小室上室不用基質膠包被，其余步驟同侵襲細胞數(shù)測定。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p38 和p-p38 蛋白表達水平取各組轉染48 h 細胞，分別以兔抗鼠PCNA 多克隆抗體、兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體、兔抗鼠MMP-9多克隆抗體、兔抗鼠p38 多克隆抗體和兔抗鼠p-p38 多克隆抗體，檢測各組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p38 和p-p38 蛋白表達水平，方法同“1.4”。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平，細胞增殖活性，侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)，各組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p38 和p-p38蛋白表達水平經檢驗均符合正態(tài)分布，均以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 甲狀腺癌細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平與正常甲狀腺上皮Nthyori3-1 細胞比較，甲狀腺 癌8505C、 NPA、 BCPAP 和KMH-2 細 胞 中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見 表1 和 圖1。取TAK1 mRNA 和 蛋 白 表達水平最高的KMH-2 細胞進行后續(xù)研究。

表1 正常甲狀腺上皮細胞和甲狀腺癌細胞中TAK1 mRNA和蛋白表達水平Tab. 1 Expression levels of TAK1 mRNA and protein in normal thyroid epithelial cells and thyroid cancer cells

圖1 Western blotting 法檢測正常甲狀腺上皮細胞和甲狀腺癌細胞中TAK1 蛋白表達電泳圖Fig.1 ElectrophoregramofexpressionsofTAK1protein in normal thyroid epithelial cells and thyroid cancer cells detected by Western blotting method

2.2 siRNA-TAK1 的轉染效率與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA-TAK1 組KMH-2 細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，陰性對照組KMH-2 細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2 和圖2。

2.3 各組KMH-2 細胞增殖活性與空白對照組和陰性對照組比較，不同時間點siRNA-TAK1 組KMH-2 細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，不同時間點陰性對照組KMH-2細胞增殖活性差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組KMH-2 細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of TAK1 mRNA and protein in KMH-2 cells in various groups

表2 各組KMH-2 細胞中TAK1 mRNA 和蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of TAK1 mRNA and protein in KMH-2 cells in various groups

*P＜0.05 compared with black control group；△P＜0.05 with negative control group.

Group Black control Negative control siRNA-TAK1 FP TAK1 mRNA 1.00±0.08 0.98±0.09 0.41±0.06*△130.215＜0.01 TAK1 protein 0.92±0.13 0.94±0.12 0.26±0.07*△86.862＜0.01

圖2 Western blotting 法檢測各組KMH-2 細胞中TAK1 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of TAK1 protein in KMH-2 cells in various groups detected by Western blotting method

表3 不同時間點各組KMH-2 細胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of KMH-2 cells in various groups at different time points

表3 不同時間點各組KMH-2 細胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of KMH-2 cells in various groups at different time points

*P＜0.05 compared with blank control group； △P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control siRNA-TAK1 FP Proliferation activity(t/h)24 0.412±0.033 0.415±0.030 0.327±0.025*△20.055＜0.01 48 0.784±0.041 0.779±0.043 0.461±0.038*△144.586＜0.01 72 1.273±0.044 1.268±0.046 0.691±0.038*△427.743＜0.01

2.4 各組KMH-2 細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA-TAK1 組KMH-2 細胞中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，陰性對照組KMH-2 細胞中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4、圖3 和圖4。

表4 各組KMH-2 細胞中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)Tab. 4 Number of invasion and migration cells of KMH-2 cells in various groups

表4 各組KMH-2 細胞中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)Tab. 4 Number of invasion and migration cells of KMH-2 cells in various groups

*P＜0.05 compared with blank control group； △P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control siRNA-TAK1 FP Number of invasion cells 378.46±37.35 382.19±41.26 153.26±35.49*△82.852＜0.01 Number of migration cells 215.68±28.49 214.94±31.02 92.13±25.18*△44.111＜0.01

2.5 各組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA-TAK1 組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，陰性對照組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5 和表5。

2.6 各組KMH-2 細胞中p38 和p-p38 蛋白表達水平各組KMH-2 細胞p38 蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA-TAK1 組KMH-2 細胞中p-p38 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，陰性對照組KMH-2 細胞中p-p38 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6和圖6。

3 討 論

圖3 Transwell 小室實驗檢測各組KMH-2 細胞侵襲能力（結晶紫，×200）Fig.3 Invasion abilities of KMH-2 cells in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet,×200)

圖4 Transwell 小室實驗檢測各組KMH-2 細胞遷移能力（結晶紫，×200）Fig.4 Migration abilities of KMH-2 cells in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet,×200)

圖5 Western blotting 法檢測各組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of PCNA,MMP-2, and MMP-9 proteins in KMH-2 cells in various groups detected by Western blotting method

表5 各組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab. 5 Expression levels of PCNA, MMP-2 and MMP-9 proteins in KMH-2 cells in various groups

表5 各組KMH-2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab. 5 Expression levels of PCNA, MMP-2 and MMP-9 proteins in KMH-2 cells in various groups

*P＜0.05 compared with blank control group； △P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control siRNA-TAK1 FP PCNA 0.43±0.08 0.45±0.09 0.21±0.05*△21.906＜0.01 MMP-2 0.28±0.06 0.30±0.07 0.13±0.03*△19.287＜0.01 MMP-9 0.33±0.05 0.34±0.06 0.15±0.04*△31.182＜0.01

表6 各組KMH-2 細胞中p38 和p-p38 蛋白表達水平Tab.6 Expression levels of p38 and p-p38 proteins in KMH-2 cells in various groups

表6 各組KMH-2 細胞中p38 和p-p38 蛋白表達水平Tab.6 Expression levels of p38 and p-p38 proteins in KMH-2 cells in various groups

*P＜0.05 compared with blank control group； △P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control siRNA-TAK1 FP p38 0.59±0.09 0.57±0.10 0.62±0.12 0.409 0.670 p-p38 0.28±0.05 0.29±0.06 0.10±0.02*△36.938＜0.01

圖6 Western blotting 法檢測各組KMH-2 細胞中p38 和p-p38 蛋白表達電泳圖Fig. 6 Electrophoregram of expressions of p38 and p-p38 proteins in KMH-2 cells in various groups detected by Western blotting method

RNA 干擾是利用激活siRNA，對靶基因產生特異性抑制作用［9］，siRNA 通過“短發(fā)夾”形式整合到慢病毒載體，通過慢病毒載體感染細胞將siRNA 整合到細胞染色體中，發(fā)揮沉默目的基因的作用［10-11］。本研究采用siRNA 沉默甲狀腺癌細胞中TAK1 表達，探討下調TAK1 水平對甲狀腺癌細胞的影響，結果顯示：多種甲狀腺癌細胞中TAK1呈高表達，siRNA 沉默可有效降低甲狀腺癌細胞中TAK1 水平，抑制甲狀腺癌細胞增殖和侵襲遷移，降低PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平。TAK1 是在MAPK 信號通路研究中發(fā)現(xiàn)的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，為MAP3K 家族成員之一，其可被轉化生長因子β1 等細胞因子激活而得名。TAK1與炎癥、應激和纖維化關系密切，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。TAK1 在多種惡性腫瘤存在異常表達，在惡性腫瘤的發(fā)病中也發(fā)揮重要作用［12］，TAK1 參 與 卵 巢 癌［13］、膀 胱 癌［14］和 結 直 腸 癌［15］等的發(fā)生發(fā)展過程。給予TAK1 抑制劑治療對癌癥具有治療作用［16-17］。TAK1 抑制劑可抑制TAK1 表達，siRNA 干擾具有沉默TAK1 基因的作用，也可抑制TAK1 表達。本研究中通過沉默TAK1 抑制甲狀腺癌細胞中TAK1 表達，進而抑制甲狀腺癌細胞增殖和遷移。PCNA 水平升高表明細胞增殖能力增強。癌細胞的侵襲遷移與細胞外基質的降解關系密切，細胞外基質包括各種膠原、層黏連蛋白和明膠，細胞外基質降解主要依賴蛋白酶的水解作用，MMPs 家族中的MMP-2 和MMP-9 可以有效降解細胞外基質，在細胞的侵襲遷移中發(fā)揮重要作用，MMP-2 和MMP-9 表達是細胞侵襲遷移的關鍵，MMP-2 和MMP-9 水平降低表明細胞侵襲和遷移能力下降。本研究中下調甲狀腺癌細胞中TAK1 表達水平也可抑制細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 表達，進一步表明抑制TAK1 表達可抑制甲狀腺癌細胞的增殖和遷移過程。由此可見，TAK1 在甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲遷移過程中具有重要作用，TAK1 有望成為甲狀腺癌治療的新靶點。

甲狀腺癌細胞的增殖和遷移過程受多種信號通路的影響，多種信號通路的激活可促進甲狀腺癌細胞的增殖和遷移過程。本研究結果顯示：siRNA 沉默甲狀腺癌細胞中TAK1 表達可抑制細胞p38 MAPK 信號通路的激活。p38 MAPK 信號通路是參與惡性腫瘤細胞增殖和遷移的主要信號通路之一，在惡性腫瘤中，抑制p38 MAPK 信號通路激活可抑制惡性腫瘤的增殖和遷移過程。p38 MAPK 信號通路在甲狀腺癌的增殖、侵襲和遷移中也發(fā)揮重要作用，在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中，p38 MAPK 信號通路激活，抑制p38 MAPK 信號通路激活可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移［18-19］。TAK1 可通過多種信號通路發(fā)揮作用，TAK1 為MAPK 通路的上游調控分子，可通過激活p38 MAPK 信號通路參與炎癥反應及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程［20］，在乳腺癌細胞中，TAK1 可通過p38 MAPK 途徑抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力［21］；在肝癌細胞中，TAK1 可通過MAPK 信號通路增加肝癌細胞的放射敏感性［22］。結合上述研究，本研究結果表明：TAK1 通過p38 MAPK 信號通路參與甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移過程。本研究中，抑制甲狀腺癌細胞中TAK1 表達可抑制p38 MAPK 信號通路的激活，表明TAK1 在甲狀腺癌細胞中也可通過調控p38 MAPK 信號通路的活性發(fā)揮作用。

綜上所述，TAK1 在甲狀腺癌細胞中高表達，siRNA 沉默甲狀腺癌細胞中TAK1 表達可能通過p38 MAPK 信號通路抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移過程，TAK1 有望成為甲狀腺癌治療的新靶點。