抗菌光動力治療的作用機制及其在牙周炎治療中應(yīng)用的研究進展

劉旭旭, 舒萌萌, 王瑞鳳, 劉 敏

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長春 130021）

1900 年光動力治療（photodynamic therapy，PDT）的原理首次被報道，1904 年P(guān)DT 被應(yīng)用于皮膚癌的臨床治療，并報道了細菌的光動力滅活現(xiàn)象。目前，PDT 作為癌癥治療的替代方法已應(yīng)用于臨床實踐，例如光化性角化病和基底細胞癌的治療［1］。PDT 應(yīng)用于癌癥治療的主要原理是導(dǎo)致癌細胞的凋亡和壞死，從而破壞生長異常的活性組織。20 世紀90 年代初，有學(xué)者［2］研究發(fā)現(xiàn)：PDT也可以應(yīng)用于細菌、真菌和病毒感染的治療，被稱為抗菌光動力治療（antimicrobial photodynamic therapy，aPDT）。牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性炎癥，因此aPDT 可以應(yīng)用于牙周炎的治療。近年來，許多學(xué)者對aPDT 的作用機制、不同類型的光源（激光器、發(fā)光二極管和氣體發(fā)電燈等）和光敏劑（photosensitizer，PS）（亞甲基藍、卟啉和姜黃素等）及aPDT 治療牙周炎的效果等進行了大量研究，但目前國內(nèi)外綜述內(nèi)容主要集中于aPDT 在全身疾病治療中的作用機制及研究現(xiàn)狀方面，其在牙周炎治療中的作用及最新研究進展的相關(guān)綜述國內(nèi)尚未見報道?，F(xiàn)將對aPDT 的作用機制及其在牙周炎治療中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 aPDT 的作用機制

aPDT 的作用機制是基于3 種要素的組合：PS、處于激發(fā)PS 光譜范圍的光（通常從可見光到近紅外光譜）和分子氧［3-4］。PS 具有穩(wěn)定的電子配置，其設(shè)置為最低或基態(tài)水平。在一定波長下照射后，PS 吸收光能從基態(tài)提升到激發(fā)態(tài)，即電子重新定位到更高的能量軌道。該單重態(tài)不穩(wěn)定，電子很容易失去多余的能量，并通過發(fā)射光（即熒光）或熱量而返回基態(tài)。此外，電子自旋的變化也可以使分子轉(zhuǎn)變?yōu)楦L壽命的激發(fā)三重態(tài)PS（此過程稱為“系統(tǒng)間交叉”）。三重態(tài)PS 通過2 種不同的途徑與底物反應(yīng)（Ⅰ型反應(yīng)和Ⅱ型反應(yīng)）。Ⅰ型反應(yīng)主要是電子從三重態(tài)PS 轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的有機底物上，產(chǎn)生自由基，在分子水平上與氧相互作用，并產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧化物、羥基自由基和過氧化氫，主要由類芬頓（Fenton-like） 反應(yīng)形成。在Ⅱ型反應(yīng)中，能量在激發(fā)的PS 和基態(tài)分子氧之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生單線態(tài)氧，該單線態(tài)氧可以與細胞中的大量分子相互作用而產(chǎn)生氧化產(chǎn)物。上述2 種類型反應(yīng)發(fā)生的概率取決于所使用的PS 類型以及應(yīng)用aPDT 的環(huán)境［5］。ROS 通過氧化作用攻擊靶細胞結(jié)構(gòu)（細胞膜、線粒體和核酸等），使其發(fā)生氧化損傷，而后通過細胞內(nèi)一系列的級聯(lián)反應(yīng)引起細胞內(nèi)生化功能改變，當氧化損傷累積超過一定閾值時可以殺傷細胞并導(dǎo)致細胞死亡［3，6］。

1.1 aPDT 的光源

目前，應(yīng)用于aPDT 中激活PS 的可見光源可分為3 種：激光器，如摻雜氬、二極管或釹的激光器，摻雜釔、鋁或石榴石［Nd∶YAG］ 激光器；發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）；氣體放電燈，如石英鎢鹵素燈或氙氣放電燈。應(yīng)用激光器的優(yōu)勢主要在于其發(fā)出激光的單色性及光譜穩(wěn)定性而不是其他特性（相干性、平行光束傳播和窄空間強度），因此容易耦合到單個光纖中并安裝在不同的光傳輸設(shè)備上。LED 的主要優(yōu)點為體積小、使用壽命長且引起熱量較低。與激光器比較，LED的發(fā)射光譜略寬，成本更低［7］。氣體放電燈的優(yōu)勢在于可以進行光譜過濾以匹配任何PS，但其不能有效地耦合到光纖束或液體光導(dǎo)中，且與激光和LED 比較，其熱量較高［8］。對于在人體內(nèi)進行aPDT 的任何臨床應(yīng)用，必須考慮由給定光源引起的發(fā)熱。由于照射時間和所用的光源不同，所施加的能量劑量過大可能導(dǎo)致溫度升高，從而可能導(dǎo)致組織損傷［9］。例如，用鹵素燈照射牙齒45～60 s，可使牙本質(zhì)溫度升高約5℃，而溫度升高5.5℃會對牙髓產(chǎn)生不利影響［10］。

總之，對于某一特定PS 的激活，其發(fā)射的光譜、光源強度及光傳輸方式（通過光纖傳輸或直接傳輸）比光源本身的類型（激光器、LED 或氣體放電燈）更為重要。

1.2 aPDT 的PS

目前應(yīng)用于牙周炎治療的PS 根據(jù)其結(jié)構(gòu)和來源分為合成染料、四吡咯結(jié)構(gòu)和天然光敏劑。

1.2.1 合成染料 目前最常用的合成染料亞甲基藍和甲苯胺藍為吩噻嗪類染料，屬于陽離子二代PS［11］。吩噻嗪類染料由具有環(huán)色側(cè)基的三環(huán)π 系統(tǒng)組成，帶有一個正電荷，并且單線態(tài)氧量子產(chǎn)率低于0.5，因此主要是由Ⅰ型反應(yīng)起作用，在紅色光譜（波長位于600～680 nm）中顯示出較強的吸收性，由于較長波長的光可以更好地穿透組織，且具有陽離子電荷，對于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有很高的親和力，因此可以用于牙周炎的治療。雖然吩噻嗪類染料有很好的抑菌作用，但是其會在短期內(nèi)對口腔中正常組織細胞產(chǎn)生光毒性，并且具有致癌風險。

1.2.2 四吡咯類化合物 四吡咯類化合物是由4 個吡咯環(huán)通過亞甲基相連形成的具有18 個電子體系的雜環(huán)-大環(huán)化合物。四吡咯類化合物中的酞菁和卟啉常用于牙周炎的治療。其中，鋅酞菁對革蘭陽性菌有較好的殺菌效果，對革蘭陰性菌是否有效仍存在爭議。但有研究［12］表明：當鋅酞菁與多黏菌素聯(lián)合使用時，對革蘭陰性菌有一定效果。目前尚無關(guān)于酞菁應(yīng)用于牙周炎治療的臨床研究報道。

卟啉是廣泛存在于自然界及生物體內(nèi)的內(nèi)源性PS，波長為405 nm 藍光激發(fā)卟啉的單態(tài)氧量子產(chǎn)率為0.5～0.8，因此主要由Ⅱ型反應(yīng)起作用。細菌內(nèi)源性卟啉是一種芳香族分子，是亞鐵血紅素在體內(nèi)合成的前體，多數(shù)組織細胞及細菌都可合成亞鐵血紅素，故在體外僅用可見光照射就能成功滅活細菌［13］。眾所周知，有些口腔細菌會在代謝過程中形成內(nèi)源性卟啉，例如牙齦卟啉單胞菌（附著、凝集因子及組織破壞雙重作用）、普氏桿菌（組織破壞作用）和產(chǎn)黑色素的放線菌聚合桿菌屬（降低宿主抵抗力、骨組織破壞和分泌白細胞毒素等多種毒性作用）。但藍光激發(fā)內(nèi)源性卟啉的活性氧產(chǎn)量較高，其光敏反應(yīng)強烈，在應(yīng)用其治療時常有明顯疼痛感。

1.2.3 天然PS 天然PS 是從植物和其他生物體內(nèi)提取的天然化合物，例如金絲桃素、核黃素、竹紅菌素、姜黃素和二氫卟吩等。近年來，對天然PS 的研究主要局限于抗癌PDT，對aPDT 的研究較少，目前應(yīng)用于牙周炎治療的天然光敏劑為姜黃素和二氫卟吩。姜黃素是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取到的PS，最近的研究［14］表明：姜黃素對耐藥菌株有一定的光滅活作用，此外姜黃素還具有抗氧化、抗炎和促進創(chuàng)面愈合的功能，因此姜黃素可以用于牙周炎的治療。二氫卟吩（chlorine e6，Ce6） 是從天然葉綠素中提取的性能優(yōu)良的PS，具有光動力反應(yīng)能力強和不良反應(yīng)少等優(yōu)點，在紅色光譜（波長約630 nm） 中顯示出較強的吸收性，因此可以更好地穿透組織，應(yīng)用于牙周炎的治療。

2 aPDT 在牙周炎治療中應(yīng)用的研究進展

牙周炎是常見的慢性感染性疾病，可造成牙周軟硬組織的破壞，菌斑生物膜是牙周炎的始動因子。菌斑生物膜形成過程中，大量細菌可在齦下牙面積累，早期的菌落為后期的菌落提供附著底物，因此，消除齦下菌斑生物膜是治療牙周炎的首要治療手段［15］。目前消除齦下菌斑生物膜的方法主要是機械清創(chuàng)，然而隨著牙周袋深度的增加，由于牙齒解剖形態(tài)復(fù)雜（牙根深部凹陷和根分叉）、器械外形難以貼合牙面和臨床醫(yī)生經(jīng)驗不足等原因，很難有效清除齦下菌斑［16］。此外，牙周袋深度治療能增加手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)后并發(fā)癥（菌血癥）的風險。對于晚期牙周炎和較深的牙周袋，機械清創(chuàng)不能取得很好的治療效果，研究者提出應(yīng)用抗生素可作為其輔助治療［17］，然而長期應(yīng)用抗生素易引起耐藥菌株的出現(xiàn)和細菌耐藥性增加，殺菌效果較差。最近的一項研究［18］顯示：74.2%的慢性牙周炎患者表現(xiàn)出對一種或多種抗生素耐藥，55.0%、43.3%、30.3%和26.5%的慢性牙周炎患者分別對強力霉素、阿莫西林、甲硝唑和克林霉素具有耐藥性。此外，全身和局部應(yīng)用抗生素作為牙周炎的輔助治療有多種不良反應(yīng)，例如過敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)及腎損傷等。近年來，為了完善現(xiàn)有的抗菌措施，研究者嘗試將aPDT 應(yīng)用于牙周炎的治療。

2.1 aPDT 應(yīng)用于牙周炎的基礎(chǔ)研究

已有研究［19］表明：在亞甲基藍和甲苯胺藍作為PS 的情況下，有些牙周病原菌對紅色激光敏感，例如牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌等。有學(xué)者［20］認為：亞甲基藍和甲苯胺藍介導(dǎo)的aPDT 對處于浮游狀態(tài)的牙周致病菌敏感性較強，但對從天然牙菌斑中提取的生物膜敏感性較差，可能與PS失活、生物膜中的細菌處于低生長狀態(tài)、亞甲基藍在生物膜中滲透性較差以及細菌可通過多重耐藥泵排出亞甲基藍有關(guān)。因此，近年來許多學(xué)者［21］嘗試通過化學(xué)修飾來增強亞甲基藍和甲苯胺藍介導(dǎo)的aPDT 對生物膜的敏感性，例如新亞甲基藍和二甲基 亞 甲 基 藍 等。KLEPAC-CERAJ 等［22］使 用 聚 乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］納米顆粒作為亞甲基藍的載體從而改善亞甲基藍的給藥方式，增強其對生物膜的敏感性。研究［23］顯示：將亞甲基藍和6-羧基蝶呤同時作為aPDT 的PS，兩者可以互補波長吸收范圍，提高多色輻射的使用效率，從而根除耐多藥菌肺炎克雷伯菌的成熟生物膜。

由于亞甲基藍和甲苯胺藍等合成染料具有致癌風險并對口腔正常組織細胞產(chǎn)生光毒性，因此開始著重于細菌內(nèi)源性卟啉的研究。細菌內(nèi)源性卟啉介導(dǎo)的aPDT 對處于浮游狀態(tài)的牙周致病菌具有很強的敏感性。YOSHIDA 等［24］和CIEPLIK 等［25］分別采用藍光激發(fā)牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌的內(nèi)源性卟啉產(chǎn)生ROS，達到了很好的抑菌效果，但內(nèi)源性卟啉作為PS 的aPDT 同樣對生物膜狀態(tài)的細菌敏感性較差。有學(xué)者［26］發(fā)現(xiàn)：aPDT 可以去除種植體周圍炎相關(guān)生物膜的黏液層，但仍需使用進一步的方法完全去除被削弱或破壞的生物膜基質(zhì)成分。CARRERA 等［27］研究了內(nèi)源性卟啉介導(dǎo)的aPDT 對牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌的殺菌效果，結(jié)果顯示：aPDT 對處于浮游狀態(tài)的細菌殺菌效果較好，而對兩者構(gòu)成的生物膜殺菌效果較差。此外，牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌中內(nèi)源性卟啉和亞鐵血紅素的含量受培養(yǎng)時間的影響較大，因此在進行內(nèi)源性卟啉介導(dǎo)的aPDT 試驗時，需要更多的標準化培養(yǎng)方案，以避免不同的培養(yǎng)條件下aPDT 目標PS—內(nèi)源性卟啉的濃度差異過大［28］。

姜黃素和Ce6 作為aPDT 的PS 具有許多優(yōu)勢。其中姜黃素可以明顯減少菌斑的發(fā)生風險，并對牙齦炎、牙周炎和種植體周圍炎的治療有一定的作用。有研究［29］顯示：姜黃素能夠殺死牙周炎的致病菌伴放線聚集桿菌，通過光滅活效應(yīng)抑制耐藥細菌菌株的生長，還可以通過抗炎作用促進牙周組織的恢復(fù)。但天然的姜黃素在生理pH 值條件下水溶性差，將姜黃素應(yīng)用于臨床仍需要進一步的研究［30］。Ce6 的組織穿透能力使其可以很好地清除位于牙周袋深處及根分叉處的細菌，因此有學(xué)者將Ce6 引入牙周炎的治療。SUN 等［31］合成了含Ce6、香豆素6 和四氧化三鐵（Fe3O4） 的多功能納米粒子作為PS，該納米粒子在630 nm 的紅光激發(fā)下，對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和梭核桿菌有很好的抑制作用。

2.2 aPDT 應(yīng)用于牙周炎的臨床研究

在慢性牙周炎患者的治療中，aPDT 可發(fā)揮一定的作用。BETSY 等［32］將90 例未經(jīng)治療的慢性牙周炎患者（男性39 例，女性51 例）隨機分為實驗組（aPDT 作為齦下刮治術(shù)和根面平整術(shù)的輔助治療） 和對照組（僅使用齦下刮治術(shù)和根面平整術(shù)），結(jié)果表明：在短期的慢性牙周炎療效維護中，aPDT 是齦下刮治和根面平整的有效輔助治療手段。

對于侵襲性牙周炎的患者，aPDT 效果明顯。CHITSAZI 等［33］對24 例臨床診斷為侵襲性牙周炎的患者進行對照實驗觀察發(fā)現(xiàn)：aPDT 聯(lián)合機械清創(chuàng)能有效抑制伴放線聚集桿菌的生長，并且患者的牙周袋探診深度降低，探診出血位點減少。MOREIRA 等［34］研 究 顯 示：aPDT 作 為 根 面 平 整的輔助方法，在侵襲性牙周炎患者單根牙深牙周袋的治療中，對減少探診出血、改善菌斑指數(shù)和增強免疫力等方面均有益處。

對于種植體周圍炎的患者，aPDT 聯(lián)合機械清創(chuàng)具有同樣治療效果。研究［35］表明：aPDT 聯(lián)合機械清創(chuàng)可減少探診出血，降低牙周袋深度。另外CARCIR 等［36］通 過 臨 床 試 驗 發(fā) 現(xiàn)：aPDT 聯(lián) 合 機械清創(chuàng)可以促進種植體與周圍骨質(zhì)的結(jié)合。但要確定aPDT 聯(lián)合機械清創(chuàng)與其他治療方式（應(yīng)用抗生素等）的治療效果的優(yōu)勢，仍需要進一步的臨床試驗觀察。

與單獨的機械治療比較，輔助aPDT 在牙周炎患者減少探診出血和降低探診深度方面有更好的短期臨床治療效果。但aPDT 作為牙周炎輔助治療的方法，其長期療效如何仍缺乏數(shù)據(jù)支持［37］。對于伴有系統(tǒng)性疾病的牙周炎患者（糖尿病患者和自身免疫性疾病患者等），aPDT 聯(lián)合機械清創(chuàng)的臨床治療效果如何，需要進一步的臨床試驗觀察。

2.3 aPDT 抗性的研究

目前，對于應(yīng)用aPDT 的細菌是否會產(chǎn)生耐藥性的研究大多局限于處于浮游狀態(tài)的細菌［38］。LAURO 等［39］的研究結(jié)果表明：用卟啉-聚賴氨酸共軛物作為PS 的伴放線聚集桿菌和消化鏈球菌在經(jīng)過10 個傳代之后，對抗生素和aPDT 的敏感性并未發(fā)生改變。TAVARES 等［40］用卟啉衍生物對費氏弧菌和大腸桿菌進行了10 個aPDT 循環(huán)后，也未發(fā)現(xiàn)其敏感性有明顯變化。STREET 等［41］研究了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌耐藥菌株（MSSA 和MSRA）在重復(fù)使用亞甲基藍的情況下，是否會對aPDT 產(chǎn)生抗性，其中大腸桿菌經(jīng)過11 個傳代，MSSA 和MSRA 經(jīng)過25 個傳代后，對aPDT 的敏感性并未發(fā)生明顯的變化。但是當細菌處于固著的生物膜狀態(tài)時，產(chǎn)生抗藥性的風險通常更高?？紤]到生物膜感染是由多種微生物共同引起的，生物膜內(nèi)的潛在抗性可以通過“水平基因轉(zhuǎn)移”在不同物種間轉(zhuǎn)移，使生物膜狀態(tài)的細菌對抗生素的耐受性較處于浮游狀態(tài)的細菌強1 000 倍。最新的研究［42］表明：處于生物膜狀態(tài)的細菌在經(jīng)過10 個aPDT 循環(huán)后，對抗生素和aPDT 的敏感性未發(fā)生改變。

另外，當細菌長時間持續(xù)暴露于低劑量的抗生素時，才會產(chǎn)生耐藥性，而目前的實驗設(shè)計大多是短時間的暴露，因此有學(xué)者認為應(yīng)該將細菌長時間持續(xù)暴露于亞抗菌水平的aPDT 中來檢測其耐藥性。CASSIDY 等［43］檢測了處于亞抗菌水平aPDT下金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對aPDT 和抗生素的敏感性，結(jié)果表明：將卟啉和亞甲基藍作為PS 的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌暴露于亞抗菌水平的aPDT 72 h，細菌對抗生素和aPDT 的敏感性均未發(fā)生改變。

2.4 稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換納米粒子（up-conversion nanoparticles，UCNPs）的應(yīng)用

傳統(tǒng)aPDT 中牙周炎致病菌大多通過紫外光或可見光照射達到最佳的激發(fā)狀態(tài)，從而殺傷細菌，但由于紫外光和可見光的組織穿透深度較淺不足以達到牙周袋深處，無法取得良好的治療效果。而近紅外光（波長700～2 500 nm） 組織穿透能力強、無光毒性和光損傷等不良反應(yīng)，但殺菌效果較差［44］。如果應(yīng)用UCNPs 將近紅外光轉(zhuǎn)換為可見光和紫外光，可以突破傳統(tǒng)aPDT 的局限性。

UCNPs 通過反斯托克斯發(fā)射過程，吸收長波長的低能量光子而發(fā)射出短波長的高能量光子，將近紅外光轉(zhuǎn)換為可見光和紫外光，從而激活PS［45］。此外，UCNPs 的光學(xué)特性穩(wěn)定，具有發(fā)射帶較窄、壽命較長和發(fā)射位置穩(wěn)定等特點，更重要的是，應(yīng)用于牙周炎治療的激發(fā)光主要位于生物學(xué)的第一窗口（波長700～1 100 nm），不僅組織穿透能力較強，而且對組織損傷較小［46］。在PDT 中應(yīng)用UCNPs 的主要原理：UCNPs 的發(fā)射峰與鄰近的PS 吸收峰重合，UCNPs 作為PS 的能量給體實現(xiàn)能量傳遞，激活PS 產(chǎn)生ROS 殺傷腫瘤細胞。WANG 等［47］將Ce6 負載在聚合物包覆的UCNPs上，形成UCNP-Ce6 超分子復(fù)合物，在980 nm 近紅外光照射下被間接激活產(chǎn)生ROS 殺死癌細胞，獲得良好的治療效果。

最近研究［48］表明：UCNPs 也可以應(yīng)用于針對微 生 物 的aPDT。有 學(xué) 者［49］合 成 了 含UCNPs（NaYF4∶Mn/Yb/Er）、亞甲基藍及CuS-殼聚糖的多功能納米粒子。UCNPs 將980 nm 的近紅外光轉(zhuǎn)換為650～670 nm 的可見光激活亞甲基藍，殺菌效果可達99%。ZHANG 等［50］首次將近紅外光激發(fā)的UCNPs 引入牙周病的治療，突破了在aPDT 中激發(fā)光穿透組織深度的限制，Ce6 與UCNPs 結(jié)合，形成一種新的PS，在近紅外光的照射下，aPDT 對牙齦卟啉單胞菌等3 種細菌及其生物膜的作用明顯增強。QI 等［51］的實驗闡明了UCNPs@二氧化鈦（TiO2） 的合成路線及其在近紅外光激發(fā)的aPDT中的作用機制：在980 nm 的近紅外光的激發(fā)下，UCNPs 將近紅外光轉(zhuǎn)化為紫外光，紫外光誘導(dǎo)TiO2殼層，電子從價帶轉(zhuǎn)移到導(dǎo)帶，導(dǎo)致產(chǎn)生空穴-電子對，從而引發(fā)氧化還原反應(yīng)生成活性氧導(dǎo)致細胞膜通透性改變和DNA 損傷，最終細菌死亡。

考慮到牙周感染總是位于牙周袋深處、根分叉和牙齒表面不規(guī)則區(qū)域［51］，如果近紅外激發(fā)aPDT可以增加組織穿透深度，應(yīng)用UCNPs 將近紅外光轉(zhuǎn)換為可見光和紫外光，將可能作為一個重要的方法來解決當前的瓶頸問題，在牙周疾病的治療中具有重要的應(yīng)用前景。

3 展 望

應(yīng)用aPDT 治療牙周病具有創(chuàng)傷小、速度快和殺菌能力強等特點，但仍處于開發(fā)和測試的試驗階段，為了達到aPDT 的最佳治療效果，仍需要開發(fā)新的PS 和優(yōu)化光傳遞系統(tǒng)，并進行進一步的臨床研究。aPDT 對牙周炎致病菌有較強的敏感性，特別是在避免細菌產(chǎn)生耐藥性及有效清除細菌方面，與機械清創(chuàng)和應(yīng)用抗生素等治療手段比較具有較強的優(yōu)越性和較少的操作時間。因此，aPDT 是治療牙周炎的最新方法，在牙周疾病的治療中具有重要研究價值及應(yīng)用前景。