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    miR-33b靶向Myc對T細胞活化的調(diào)控及其在擴張型心肌病中的作用①

    2021-01-27 02:47:34史慧穎王淑男霍艷萍劉燦君那靜濤
    中國免疫學雜志 2020年24期
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示活化

    黃 侃 史慧穎 王淑男 霍艷萍 劉燦君 那靜濤

    (齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院心血管二科,齊齊哈爾 161000)

    擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)屬于原發(fā)性心肌病,其主要特征為心臟收縮功能障礙及左心室擴張,其具有較高的發(fā)病率并可導致患者心力衰竭[1]。目前DCM發(fā)病機制尚未完全闡明,既往研究認為免疫紊亂、自身免疫心肌炎及炎癥損傷等均可導致DCM發(fā)生[2]。故而深入探究DCM患者免疫紊亂機制對尋找DCM治療靶點具有重要意義。CD4+T細胞屬于免疫系統(tǒng)重要細胞亞群,研究發(fā)現(xiàn)DCM患者心臟組織均發(fā)生CD4+T細胞浸潤,CD4+T細胞可促使炎癥介質(zhì)釋放并引起心肌細胞凋亡進而導致心功能惡化[3]。同時相關(guān)報道指出DCM患者外周血中表面活化標記物CD25和CD69表達增加并可促進心衰發(fā)生[4]。以上研究表明DCM患者體內(nèi)存在細胞免疫紊亂并可能促進心功能惡化。

    微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小RNA并可通過調(diào)控靶基因表達進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達,研究顯示miRNA可調(diào)控T淋巴細胞發(fā)育及分化等過程[5]。研究表明 T細胞活化后微小RNA-33b(miR-33b)表達水平明顯降低并可調(diào)控機體免疫系統(tǒng)[6]。CD4+T細胞異?;罨梢l(fā)DCM患者炎癥損傷,miR-33b又可調(diào)節(jié)T細胞活化,但miR-33b與CD4+T細胞在DCM發(fā)病機制中的作用關(guān)系尚未研究。通過生物信息學軟件預測Myc是miR-33b的靶基因,Myc作為多效能轉(zhuǎn)錄因子又可被T細胞中細胞因子激活進而參與細胞增殖及分化過程[7]。因此,本研究通過分析miR-33b對T細胞活化的調(diào)控作用及其在DCM發(fā)生過程中的作用,初步探討其是否通過靶向調(diào)控Myc表達來發(fā)揮作用,為進一步揭示DCM患者免疫活化機制提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1DCM患者一般資料 收集2015年3月至2016年4月本院收治的45例DCM患者為研究對象,作為DCM組,所有患者均符合WHO原發(fā)性擴張性心肌病診斷標準[8]。DCM組患者中男25例,女20例,年齡45~67歲,平均年齡為(52.31±5.52)歲。同時選取同期本院體檢中心健康志愿者30例為正常組,其中男18例,女12例,年齡42~70歲,平均年齡為(53.62±6.17)歲。兩組受試者年齡、性別等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。納入標準:DCM患者左心室舒張期末直徑高于5.5 cm且右心室射血分數(shù)低于45%;未接受類固醇激素等治療者。排除標準:血性心肌病患者;合并高血壓性心臟病及心臟瓣膜病患者;自身免疫性疾病或嚴重感染者;合并嚴重內(nèi)分泌疾病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,受試者知情且簽署同意書。

    1.1.2實驗材料 人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat T購自武漢華連科生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購自杭州仟諾生科技有限公司;雙熒光報告檢測系統(tǒng)購自美國Promega 公司;雙熒光報告檢測試劑盒購自北京白奧萊博科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;anti-CD3、anti-CD28、anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PE抗體、anti-CD69-PE-Cy7抗體購自美國Biolegend公司;白細胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國BD Bio-sciences公司;MTT檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)及其陰性對照購自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司;Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒購自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol試劑與SYBR Green qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;M-MLV Reverse Transcription Kit試劑盒購自美國Invitrogen公司;兔抗人Myc多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自中山金橋生物技術(shù)有限公司;Western blot所需試劑購自上海西寶生物科技股份有限公司;淋巴細胞分離液購自美國MP Biomedicals公司;紅細胞裂解液購自美國eBioscience公司。

    1.2方法

    1.2.1分離人外周血單個核細胞(PBMCs) 采用肝素鈉抗凝試管收集兩者受試者外周靜脈血5 ml,2 500 r/min離心8 min,收集上層血漿,加入等體積無菌PBS緩沖液,另取10 ml無菌離心管,加入等體積淋巴細胞分離液,緩慢加入外周血,離心機中2 500 r/min離心20 min,取出中間PBMCs層,加入4 ml PBS緩沖液,混勻,1 600 r/min離心6 min,棄上清并收集細胞,加入紅細胞裂解液(2 ml),混勻,室溫靜置2 min,加入PBS緩沖液至8 ml,混勻后離心并收集細胞,采用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞,調(diào)整細胞濃度2×106ml-1,采用免疫磁珠分選法(MACS)分離CD4+T細胞,具體方法參照相關(guān)文獻[9],收集CD4+T細胞置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat T細胞,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),2 d更換培養(yǎng)液,待細胞融合至60%~70%時進行傳代培養(yǎng)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前一天將Jurkat T細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板,每孔分別接種2×105個細胞,同時分別將miRNA陰性對照、miR-33b mimic、anti-miRNA及miR-33b抑制劑溶解于OPYI-MEM培養(yǎng)基(50 μl),混勻后加入2 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,混勻后室溫孵育20 min,向96孔板中每孔加入100 μl上述miRNA配置混合液,分別為miR-con組、miR-33b組、anti-miR-con組 及anti-miR-33b組。采用小RNA干擾技術(shù)沉默Myc表達,分別將Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,轉(zhuǎn)染方法與miR-33b轉(zhuǎn)染方法相同,分別為si-con組、si-Myc組。轉(zhuǎn)染后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),6 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行檢測。

    1.2.3qRT-PCR檢測miR-33b 、Myc mRNA表達 CD4+細胞與Jurkat T細胞均按照Trizol試劑說明書提取總RNA,利用核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度及純度,以A260與A280比值在1.8~2.0之間為RNA濃度測定標準。引物序列:miR-33b正向引物為:5′-ATTCTTTCGAACTGTCTTGG-3′,反向引物為:5′-TTCACCCTCGGCTGTCCTTGACA-3′;Myc正向引物為:5′-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3′,反向引物為:5′-GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,qRT-PCR擴增反應(yīng),擴增條件為95℃ 5 min,95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,共30次循環(huán),72℃終延伸10 min。qRT-PCR反應(yīng)均嚴格按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書操作。miR-33b 、Myc 的溶解曲線見圖1。

    圖1 miR-33b與Myc的溶解曲線Fig.1 Dissolution curve of miR-33b and Myc

    1.2.4Western blot檢測Myc蛋白表達 取各組Jurkat T細胞及CD4+細胞,加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白,經(jīng)電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉60 min,分別加入Myc(1∶200)、GAPDH(1∶1 000)一抗,4℃冰箱內(nèi)保存過夜,次日加入IgG(1∶5 000),室溫孵育1 h,經(jīng)化學發(fā)光試劑顯影,Myc以GAPDH為內(nèi)參,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

    1.2.5流式細胞術(shù)檢測表面活化標記物CD25和CD69的表達 收集各組對數(shù)生長期Jurkat T細胞,用anti-CD3/28刺激Jurkat T細胞24 h,用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti-CD69-PE-Cy7抗體標記后,置于流式細胞儀檢測,采用FlowJo7.6軟件分析CD25和CD69平均熒光強度(MFI)。

    1.2.6MTT檢測細胞增殖 取各組對數(shù)生長期Jurkat T細胞,0.25%胰酶消化,接種至96孔板,每孔細胞密度為5×103個,每孔體積為100 μl,每組設(shè)置4個復孔,放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h、48 h、72 h后分別在每孔加入50 μl MTT試劑,然后加入150 μl DMSO,避光室溫下孵育10 min,利用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的OD值。

    1.2.7檢測T細胞活化功能 分別將Jurkat T細胞鋪于96孔U底板(2×105個/孔),用anti-CD3/28抗體刺激,24 h后收集細胞上清液,采用ELISA法檢測IL-2水平,嚴格按照檢測試劑盒說明書操作。

    1.2.8雙熒光素酶活性檢測 收集呈指數(shù)式生長的Jurkat T細胞,胰蛋白酶消化,制備細胞懸液,以每孔1×105個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板,放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞融合度達到60%左右時進行轉(zhuǎn)染,分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)基,然后在每孔加入300 μl 1×Passive Lysis Buffer,放入4℃冰箱內(nèi),20 min后取出并混勻,吸取40 μl細胞裂解液置于Lockwell maxisorp檢測板,再加入Luciferase Assay Reagent(20 μl),混勻后檢測螢火蟲熒光素酶熒光值,之后加入Stop & Glo Reagent(20 μl/孔),混勻后室溫放置3 min,檢測海腎熒光酶熒光值。

    2 結(jié)果

    2.1擴張型心肌病患者CD4+細胞中miR-33b和Myc的表達 通過qRT-PCR法檢測DCM患者CD4+細胞中miR-33b及Myc mRNA表達水平,結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細胞中miR-33b表達水平相較于正常組顯著降低(t=10.528,P<0.000 1),Myc mRNA表達水平顯著升高(t=11.238,P<0.000 1),見圖2A、B。Western blot檢測結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細胞中Myc蛋白表達水平顯著高于正常組(t=8.718,P<0.000 1),見圖2C。采用Pearson法分析DCM患者CD4+細胞中miR-33b與Myc蛋白表達水平的相關(guān)性,結(jié)果顯示miR-33b與Myc呈負相關(guān)(F=14.091,P<0.05),見圖2D。

    圖2 DCM患者CD4+細胞中miR-33b和Myc的表達Fig.2 Expression of miR-33b and Myc in CD4+ cells from DCM patientsNote:A.Down-regulation of miR-33b expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group;B.Upregulation of Myc mRNA expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group;C.Upregulation of Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group;D.Negative correlation between Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients.Compared with Normal group,*.P<0.05.

    2.2miR-33b對Jurkat T細胞活化的影響 分別將miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR法檢測Jurkat T細胞中miR-33b表達,結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中miR-33b表達水平顯著高于miR-con組,anti-miR-33b組Jurkat T細胞中miR-33b表達水平顯著低于anti-miR-con組(F=219.514,P<0.000 1),見圖3A。提示轉(zhuǎn)染效果良好可用于后續(xù)研究。用anti-CD3/28刺激Jurkat T細胞24 h,流式檢測表面活化標記物CD25和CD69的表達,結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于miR-con組,anti-miR-33b組Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著高于anti-miR-con組(FCD25=32.532,F(xiàn)CD69=75.971,F(xiàn)IL-2=38.084,P<0.000 1),見圖3B~D。結(jié)果表明miR-33b過表達可抑制Jurkat T細胞活化,抑制miR-33b表達可促進Jurkat T細胞活化。

    圖3 miR-33b調(diào)控Jurkat T細胞活化Fig.3 miR-33b regulates Jurkat T cell activationNote:A.Detection of miR-33b expression in Jurkat T cells 48 h after transfection;B,C.After 48 h transfection,Jurkat T cells were stimulated with anti-CD3/28 for 24 h,and the expression of surface activation markers CD25 and CD69 were detected by flow cytometry;D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant.Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

    2.3miR-33b對Jurkat T細胞增殖的影響 MTT檢測Jurkat T細胞增殖能力,結(jié)果顯示miR-33b 組Jurkat T細胞增殖活性顯著低于miR-con組,anti-miR-33b組Jurkat T細胞增殖活性顯著高于anti-miR-con組(F=23.044,P<0.000 1),見圖4。結(jié)果表明miR-33b過表達可抑制Jurkat T細胞增殖,抑制miR-33b表達可促進Jurkat T細胞增殖。

    圖4 miR-33b調(diào)控Jurkat T細胞增殖Fig.4 miR-33b regulates Jurkat T cell proliferationNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

    2.4miR-33b靶向Myc調(diào)控其表達 靶基因預測軟件預測出miR-33b與Myc 3′UTR存在結(jié)合位點,見圖5A。分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con組共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,檢測Jurkat T細胞熒光活性,結(jié)果顯示野生型WT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性比WT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性顯著降低(t=6.507,P=0.03),突變型MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染相較于MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性差異無統(tǒng)計學意義(t=1.905,P=0.130),見圖5B。Western blot法驗證miR-33b對Myc蛋白表達的調(diào)控作用,結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),anti-miR-33b組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖5C。結(jié)果表明miR-33b可負向調(diào)控靶基因Myc表達。

    圖5 miR-33b靶向Myc mRNA調(diào)控其蛋白表達Fig.5 miR-33b targets Myc mRNA to regulate its protein expressionNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

    2.5沉默Myc抑制Jurkat T細胞活化和增殖 將Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞,轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot驗證轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著低于si-con組(F=43.279,P<0.000 1),見圖6A,提示轉(zhuǎn)染成功。進一步分析沉默Myc表達對Jurkat T細胞活化和增殖的影響,結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組(FCD25=67.278,F(xiàn)CD69=30.855,F(xiàn)IL-2=208.496,P<0.05),Jurkat T細胞活性明顯降低(F=13.838,P=0.006),見圖6B~E。結(jié)果表明沉默Myc 表達可抑制Jurkat T細胞活化并降低細胞增殖能力。

    圖6 Myc表達對Jurkat T細胞活化和增殖的影響Fig.6 Effect of Myc expression on activation and proliferation of Jurkat T cellsNote:A.Detection of Myc expression in Jurkat T cells after 48 hours of transfection;B,C.Expression of surface activation markers CD25 and CD69;D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant;E.Detection of Jurkat T cell proliferation.Compared with si-con group,*.P<0.05.

    3 討論

    CD4+T細胞介導免疫炎癥反應(yīng)可促進DCM發(fā)生及發(fā)展,DCM患者外周血CD4+T細胞異?;罨蓳p傷機體免疫功能[10]。miRNA與T細胞激活及分化密切相關(guān),T細胞激活可通過增加細胞代謝進而調(diào)節(jié)免疫功能,同時還可調(diào)控miRNA表達并間接調(diào)控靶基因表達進而促進T細胞增殖,miRNA異常表達還可通過調(diào)控靶基因表達進而促進T細胞增殖[11-13]。miR-33b在食管鱗狀細胞癌中呈低表達并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程,研究表明miR-33可通過調(diào)控ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白表達進而調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[14,15]。關(guān)于miR-33b在DCM發(fā)生過程中的作用尚未有相關(guān)研究報道,本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細胞中miR-33b表達水平低于正常組,說明miR-33b可能參與DCM發(fā)生過程。提示miR-33b表達水平異??赡芡ㄟ^引起機體免疫系統(tǒng)紊亂進而導致DCM發(fā)生。通過靶向預測軟件得出Myc與miR-33b基因序列存在結(jié)合位點,研究顯示抑制Myc表達可抑制T細胞活化及增殖,同時Myc表達水平升高還與白血病病毒感染有關(guān)[16,17]。本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細胞中Myc mRNA及蛋白表達水平顯著高于正常組,miR-33b與Myc呈負相關(guān),提示miR-33b與Myc異常表達可促進DCM發(fā)生及發(fā)展。但Myc與miR-33b是否存在直接靶向關(guān)系及其對DCM患者T細胞活化及增殖的調(diào)控作用如何均需進行深入研究。

    CD69可作為T淋巴細胞表面活化的早期標志,抗原刺激T淋巴細胞時CD69表達上調(diào)[18]。CD4+T細胞早期免疫活化標志物CD25、CD69表達增加可能是DCM患者免疫激活的重要因素[19]。研究發(fā)現(xiàn)IL-2是Myc轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用中的重要因子,IL-2可誘導CD4+T細胞合成相關(guān)miRNA,miRNA又可通過靶向抑制Foxol因子表達進而促進CD4+T細胞增殖[20,21]。提示IL-2在CD4+T細胞活化及增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究選用T淋巴細胞系Jurkat T細胞為實驗細胞,通過體外實驗探討miR-33b、Myc與T淋巴細胞活化及增殖的關(guān)系。本實驗將miR-33b過表達及抑制表達后,結(jié)果顯示miR-33b過表達后Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細胞增殖能力均顯著降低,抑制miR-33b表達后Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細胞增殖能力均顯著升高,說明miR-33b表達水平升高可有效抑制Jurkat T細胞活化及增殖。提示Jurkat T細胞中miR-33b表達水平降低可促進免疫活化及增殖。同時本研究熒光素酶檢測結(jié)果顯示Myc是miR-33b的靶基因,miR-33b可負向調(diào)控靶基因Myc表達。提示miR-33b、Myc表達異??赡芘cDCM過度免疫激活有關(guān)。通過沉默Myc表達進一步驗證其對T細胞活化的調(diào)控作用,結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組,Jurkat T細胞活性明顯降低,說明降低Myc表達可有效抑制T細胞活化。提示miR-33b可能通過負向調(diào)控Myc表達并減少IL-2分泌量進而抑制T細胞增殖及活化。

    綜上所述,DCM患者CD4+T細胞中miR-33b表達下調(diào)并可促進Myc表達進而促使T細胞異?;罨?,這可能是DCM發(fā)病機制之一,為提高DCM治療效果提供潛在靶標基因。但CD4+T細胞活化及增殖過程較為復雜,涉及轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、多種miRNA等調(diào)控過程,因而需進一步探究miR-33b與Myc對T細胞活化及增殖的調(diào)控機制。

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