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    靈芝提取物對(duì)4種人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制研究①

    2021-01-27 02:47:30劉星含許玉君趙樹(shù)立侯亞義
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年24期
    關(guān)鍵詞:靈芝細(xì)胞株細(xì)胞周期

    劉星含 許玉君 厲 怡 趙樹(shù)立 侯亞義

    (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南京 210093)

    癌癥是威脅人類生命健康的主要疾病,目前以西醫(yī)治療為主,但其治療代價(jià)較高、副作用較大[1]。我國(guó)人口眾多,且老齡化逐漸嚴(yán)重,導(dǎo)致癌癥的發(fā)病率和死亡率上升[2]。盡管近年癌癥篩查技術(shù)、治療方式和預(yù)后護(hù)理等方面取得了重大進(jìn)展,但癌癥及其治療措施所導(dǎo)致的負(fù)效應(yīng)仍嚴(yán)重威脅人類健康、生活質(zhì)量和心理健康。

    中藥在提高老年人群生活質(zhì)量方面具有不可替代的作用,且隨著中醫(yī)藥理研究的深入,其獨(dú)特的功效不斷被發(fā)現(xiàn)。靈芝是常用的腫瘤輔助治療中藥,屬靈芝科,已被列入《美國(guó)草藥藥典》和《中國(guó)藥典》。據(jù)《中國(guó)藥典》記載,靈芝可治療氣虛、咳嗽和哮喘[3]。靈芝最具吸引力的特性是其不僅是一種與功能性食品同源的多用途植物藥,還具有調(diào)節(jié)免疫力和抑制腫瘤活性的作用[4]。近年體內(nèi)和體外研究表明,靈芝具有抗炎、抗氧化、降低血糖及抗?jié)兊茸饔肹5]。靈芝可用于腫瘤放化療的輔助治療,發(fā)揮其增效減毒作用,特別是減少放化療的不良反應(yīng),已被多項(xiàng)臨床研究初步證實(shí)[6]。靈芝水提物不僅能提高小鼠的免疫功能,還可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。靈芝的主要活性成分為靈芝多糖和靈芝三萜,分別是靈芝極性和非極性提取物的主要成分[8,9]。靈芝三萜類化合物是各類靈芝酸的總稱,靈芝酸可影響腫瘤的多種信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變,但具體作用機(jī)制尚未闡明[10]。本研究利用超臨界二氧化碳結(jié)合乙醇提取靈芝提取物(ganoderma lucidum extracts,GLE),通過(guò)高壓液相色譜分析表明其主要成分為靈芝酸,以4種人腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,從細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及周期等方面初步探討GLE的抗腫瘤活性。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1藥物及細(xì)胞株 GLE由南京中科集團(tuán)股份有限公司提供,用乙醇配制為20 mg/ml儲(chǔ)存液,4℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、人胃癌細(xì)胞株HGC27、人胰腺癌細(xì)胞株SW1990及人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)于江蘇凱基生物有限公司。

    1.1.2試劑 CCK8 試劑(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司);Bax、Bcl2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP及cleaved PARP抗體(CST公司,5023S、15071S、9668S、9664S、9532S、5625S);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司);McCoy′s 5A培養(yǎng)基(江蘇凱基生物有限公司);胎牛血清(四季青公司);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司);細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)。

    1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);低溫高速離心機(jī)(天美科技有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 4種腫瘤細(xì)胞株分別用含5%胎牛血清、0.1%雙抗的完全培養(yǎng)基、37℃、5% CO2培養(yǎng),A549、SW1990及SKOV3細(xì)胞株采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),HGC27采用McCoy′s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1.2.2細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549、SW1990、 SKOV3及HGC27細(xì)胞分別以2×103、2×103、1×103、2×103個(gè)/孔接種于96孔板,貼壁12~24 h。用不同濃度的GLE溶液(0、50、100、150、200 μg/ml)和順鉑(5 μg/ml,作為陽(yáng)性對(duì)照)處理12、24和48 h,棄上清,加入100 μl CCK8工作液1∶10培養(yǎng)1.5 h后,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力。

    1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 4種腫瘤細(xì)胞分別以合適濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿,用不同濃度的GLE溶液和順鉑(5 μg/ml)處理24、48 h,加入不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后離心棄上清,依次加入195 μl結(jié)合緩沖液,5 μl FITC標(biāo)記的Annexin-V和10 μl碘化丙啶染色液室溫避光染色20 min,加入200 μl結(jié)合緩沖液輕輕振蕩混勻,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

    1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 不同濃度的GLE和順鉑(5 μg/ml)處理4種腫瘤細(xì)胞24 h,收集上清和胰酶消化的細(xì)胞,PBS洗1次,加入70%乙醇混勻,4℃固定12~24 h。1 000 g 離心5 min,棄上清,PBS洗1次,加入500 μl碘化丙啶染色液(染色緩沖液、50倍濃度的RNaseA及20倍濃度的碘化丙啶染色液以500∶10∶25配制為碘化丙啶染色液),37℃避光染色30 min,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

    1.2.5RT-PCR檢測(cè)GLE對(duì)腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響 4種腫瘤細(xì)胞用不同濃度的GLE和順鉑(5 μg/ml)處理24 h后,TRIzol法提取總RNA,DEPC溶解,-80℃保存。將1 μg RNA、5倍HiScript Ⅱ qRT SuperMix 4 μl及適量水配制為總體積為20 μl的體系,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋10倍置于-20℃?zhèn)溆?。取適量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng),各反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,40個(gè)循環(huán),以GAPDH為內(nèi)參,測(cè)定反應(yīng)管熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)的Ct值,2-ΔΔCt法計(jì)算,引物序列見(jiàn)表1。

    1.2.6Western blot檢測(cè)GLE對(duì)腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的GLE和順鉑(5 μg/ml)處理4種腫瘤細(xì)胞24 h,棄上清,PBS潤(rùn)洗1次,加入適量蛋白裂解液,4℃搖床裂解30 min,刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管。4℃下12 000 r/min離心15 min,取上清。BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量后加入適量體積蛋白上樣緩沖液,99℃加熱10 min,-80℃保存待用。SDS-PAGE電泳法分離蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,4℃孵育過(guò)夜,洗滌后加入二抗室溫孵育2 h,化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行定量分析。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用兩樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析數(shù)據(jù),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1GLE抑制腫瘤細(xì)胞增殖 不同濃度GLE(0、50、100、150、200 μg/ml)作用于A549、SW1990、SKOV3和HGC27細(xì)胞12、24和48 h后,4種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力均隨給藥濃度升高和干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低,呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(圖1)。

    2.2不同濃度GLE可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 GLE作用于SW1990、SKOV3和HGC27細(xì)胞24、48 h時(shí),與對(duì)照組相比,100、150、200 μg/ml GLE處理組細(xì)胞總凋亡率上升(P<0.05)。但A549細(xì)胞GLE作用24 h時(shí)僅200 μg/ml 干預(yù)組總凋亡率明顯上升,干預(yù)48 h時(shí),100、150、200 μg/ml GLE顯著提高A549細(xì)胞凋亡率(圖2)。

    圖2 GLE以時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡Fig.2 GLE induced apoptosis of tumor cells in a time and dose-dependent mannerNote:**.P<0.01 vs control group.

    2.3GLE促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期阻滯 GLE作用 24 h時(shí),隨藥濃度升高,與對(duì)照組相比,A549、SW1990細(xì)胞處于G0/G1期細(xì)胞增加,HGC27細(xì)胞僅200 μg/ml干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加。SKOV3細(xì)胞100、150 μg/ml干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增加,200 μg/ml干預(yù)組G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖3)。

    2.4GLE在mRNA水平下調(diào)Bcl2/Bax比值,改變細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá) GLE干預(yù)4種腫瘤細(xì)胞24 h后,RT-PCR結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,隨著給藥濃度增加,Bcl2/Bax比值下降(圖4)。100、150、200 μg/ml GLE干預(yù)A549、SW1990、SKOV3細(xì)胞24 h后,細(xì)胞周期相關(guān)基因E2F-1、CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA2、CyclinB1及CyclinE1表達(dá)不同程度地降低,p21表達(dá)上調(diào)(圖3)。與流式結(jié)果相似,200 μg/ml GLE干預(yù)導(dǎo)致HGC27細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)基因E2F-1、CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA2、CyclinB1及CyclinE1表達(dá)降低,100、150 μg/ml GLE干預(yù)導(dǎo)致HGC27細(xì)胞E2F1、CDK2、CyclinA2、CyclinB1及CyclinE1表達(dá)不同程度地降低(圖3)。

    圖3 GLE不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of GLE on cell cycle arrest of tumor cells and expressions of cell cycle related genesNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group.

    2.5GLE在蛋白水平降低Bcl2/Bax的比值,上調(diào)c-caspase-3、c-PARP/PARP表達(dá) 100、150、200 μg/ml GLE作用24 h后,相比于對(duì)照組,A549、SKOV3和HGC27細(xì)胞隨GLE濃度增加,Bcl2/Bax蛋白表達(dá)下調(diào),cleaced caspase-3表達(dá)上升,cleaved PARP占總PARP比值上升(圖4)。SW1990細(xì)胞株僅150和 200 μg/ml GLE處理組cleaved caspase-3、cleaved PARP占總PARP比值上升(圖4)。

    圖4 不同濃度GLE對(duì)腫瘤細(xì)胞Bcl/Bax、c-PARP/PARP比值及caspase-3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of GLE on ratio of Bcl/Bax and c-PARP/PARP and expressions of caspase-3 signaling related proteinsNote:*.P<0.05,**.P<0.01 vs control group.

    3 討論

    手術(shù)治療是早期癌癥患者的首選,放射治療和全身性治療,包括化療、靶向治療、激素治療和免疫治療,更適合晚期和侵襲性癌癥患者,但副作用較多,如疲勞、疼痛、生育能力受損及復(fù)發(fā)。近年來(lái),因毒副作用較小,靈芝及其提取物在抗腫瘤、增強(qiáng)放化療敏感性等方面的作用引起廣泛關(guān)注[11-14]。Su等[15]將靈芝多糖和紫杉醇聯(lián)用顯著抑制小鼠4T1乳腺癌模型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),調(diào)節(jié)腫瘤代謝和腸道菌群。Yu等[16]將靈芝多糖和硫化鉍納米粒子結(jié)合,發(fā)現(xiàn)結(jié)合產(chǎn)物可增加放療敏感性,顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),減少轉(zhuǎn)移。除作為腫瘤輔助治療藥物外,靈芝及其提取物本身也具有顯著的抗腫瘤活性。研究表明,靈芝酸A可通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng),減弱其遷移、侵襲能力,誘導(dǎo)凋亡和自噬,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明雪靈芝粗多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,但對(duì)細(xì)胞增殖(CyclinD1、PCNA、Ki67)和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子(Bcl2、Bax)表達(dá)無(wú)顯著影響[17]。

    凋亡是以細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞收縮、核碎裂、染色質(zhì)濃縮等為特征的程序性細(xì)胞死亡,包括細(xì)胞受體和線粒體介導(dǎo)2種途徑,均通過(guò)半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)活化介導(dǎo)。半胱天冬酶是凋亡機(jī)制的關(guān)鍵,大致可分為啟動(dòng)子(caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10),執(zhí)行子(caspase-3、caspase-6、caspase-7)和炎癥半胱天冬酶(caspase-1、caspase-4、caspase-5)[18]。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑主要通過(guò)細(xì)胞色素c的傳遞和caspase-9的激活控制。另外,Bcl2家族成員是調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c釋放至細(xì)胞質(zhì)的重要參與者。細(xì)胞色素c激活caspase-9產(chǎn)生凋亡小體,激活caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期調(diào)控是復(fù)雜的過(guò)程,已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞周期進(jìn)展異常與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān),如食管癌、胃癌和結(jié)腸癌[19]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是絲氨酸-蘇氨酸激酶,受調(diào)節(jié)性細(xì)胞周期蛋白的正調(diào)控和CDK抑制劑的負(fù)調(diào)控,在細(xì)胞周期進(jìn)程中起重要作用,如CDK1/2-CyclinA和 CDK1-CyclinB分別對(duì)S和G2/M期過(guò)渡具有重要作用。CDK4/6-CyclinD和CDK2-CyclinE通過(guò)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)的順序磷酸化促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期過(guò)渡至S期[20]。目前多種CDK抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

    本研究發(fā)現(xiàn)GLE以時(shí)間和劑量依賴性降低4種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力,細(xì)胞周期相關(guān)基因E2F-1、CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA2、CyclinB1及CyclinE1表達(dá)降低,p21表達(dá)升高,說(shuō)明GLE可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GLE以時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)隨給藥劑量增加,抑制凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax比值降低,caspase-3活化形式(cleaved caspase-3)表達(dá)升高,凋亡標(biāo)志蛋白PARP被切割為cleaved-PARP,進(jìn)一步從分子層面提示GLE通過(guò)caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

    GLE可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯,提示GLE對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)和caspase-3信號(hào)通路發(fā)揮作用。

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