丙泊酚對(duì)老年癡呆大鼠AMPK自噬通路及認(rèn)知功能的影響

鄭仲磊，張萬平，蘇玉強(qiáng)，薛 沙，范曉英

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院手麻科，陜西 西安 710038)

老年癡呆患者記憶力和認(rèn)知能力的下降是由于突觸功能喪失，炎癥信號(hào)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激，大腦中的突觸損傷，老年性斑塊增加和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的逐步沉積以及神經(jīng)元變性所致[1]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)分解代謝機(jī)制，在病理?xiàng)l件下(如阿爾茨海默病)自噬對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[2,3]。AMPK的表達(dá)和激活在阿爾茨海默氏病患者的大腦中也增加，抑制AMPK的激活可通過減少β淀粉樣蛋白(Aβ)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)真核延伸因子2(eEF2)來改善海馬突觸可塑性的損害[4]。參與記憶功能的大腦區(qū)域主要依賴于含有N-甲基-D-天冬氨酸受體2B(NR2B)亞基。在產(chǎn)后發(fā)育過程中，NR2B表達(dá)穩(wěn)定下降，NR2B的受體失活更慢，因此與突觸可塑性水平升高有關(guān)。小鼠中NR2B表達(dá)的下調(diào)改善了突觸可塑性和記憶形成，通過改變合成、轉(zhuǎn)運(yùn)或降解而導(dǎo)致NR2B水平降低，其突觸可塑性和記憶力均得到改善[5]。丙泊酚是最常用的靜脈麻醉藥，已顯示出減弱含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)激活和凋亡而具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。本研究擬探討丙泊酚對(duì)老年癡呆大鼠AMPK自噬通路及認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:清潔級(jí)SD(Sprague Dawley)大鼠100只，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，96周齡，體重(520±40)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(云)2019-0006，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(云)2019-0008，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0019695849。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(21±1)℃，濕度(55±5)%。大鼠隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、鹽酸米諾環(huán)素組(50mg/kg)、丙泊酚低劑量組(50mg/kg)、丙泊酚高劑量組(100mg/kg)，每組20只。

1.2主要藥品、試劑與儀器:丙泊酚(原料藥，南京科維思生物科技股份有限公司，純度99.98%，批號(hào)HJ-1587)；鹽酸米諾環(huán)素膠囊(惠氏制藥有限公司，規(guī)格100mg/粒，批號(hào)190513)；β樣淀粉蛋白1-42(β-amyloid protein1-42，Aβ1-42)(美國sigma公司，批號(hào)L2873)；吖啶橙染料、化學(xué)發(fā)光(ECL)Western印跡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)D01339、P0018FM)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、PureLink Micro-toMidi總RNA分離試劑盒(美國Invitrogen公司，批號(hào)FFP36、RRK-10328)；RIPA裂解液、TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(哈爾濱海基生物科技深圳有限公司，批號(hào)KL6379、106734)；Bradford蛋白質(zhì)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所，批號(hào)GL1493)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(美國賽默飛世爾科技公司，批號(hào)SJ-394764)；AMPK一抗、NR2B一抗、GAPDH抗體、HRP偶聯(lián)二抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)ac41789、ac52987、ad33117、ak636548)；PBS-Tween20洗液(上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)BD-8599)；DM500型熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；3900型RNA TaqMan microRNA分析儀(美國Applied Biosystems公司)；qTOWER型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國耶拿分析儀器股份公司)；Epson Perfection 2480型掃描儀(日本長野精工公司)。

1.3動(dòng)物建模及給藥:將Aβ1-42溶解在無菌蒸餾水中，濃度為5μg/L，并在37℃下孵育7d，以獲得聚集形式。模型組、鹽酸米諾環(huán)素組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚高劑量組大鼠腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，將Aβ1-42(1μL=5μg)微量注射到雙側(cè)海馬中。所有微注射均使用10μLHamilton注射器進(jìn)行，將其用26號(hào)不銹鋼針頭緩慢放下。開始注射前，將針頭留在原位3～5min，然后以0.1μL/min的速度緩慢注射，在緩慢拔出針頭之前，將其再留置3～5min[7]。對(duì)照組進(jìn)行相同的操作過程，以相同的立體定位法以0.1μL/min的速率將相同體積的載體溶液(1μLPBS)單次微量注射到海馬的相應(yīng)區(qū)域中。注射后，將頭皮縫合，使大鼠從麻醉中恢復(fù)。模型建立成功后，鹽酸米諾環(huán)素組、丙泊酚低、高劑量組以10mL/kg的灌胃體積給予相應(yīng)藥物灌胃，對(duì)照組、模型組灌胃10mL/kg的生理鹽水。每天給藥1次，持續(xù)4周。

1.4大鼠神經(jīng)認(rèn)知功能檢測:Morris水迷宮試驗(yàn)測定逃避潛伏期時(shí)間、經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限停留的時(shí)間[8]。

1.5大鼠海馬神經(jīng)元病理結(jié)構(gòu)觀察:頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠海馬組織，常規(guī)脫水、包埋，制作切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察神經(jīng)元病理結(jié)構(gòu)變化。

1.6大鼠海馬神經(jīng)元自噬檢測:吖啶橙(10mg/L)37℃染色海馬組織，持續(xù)30min，于熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元自噬水平(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)若出現(xiàn)酸性紅色自噬小體說明發(fā)生自噬；隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中自噬小體個(gè)數(shù))。

1.7大鼠海馬組織AMPK、NR2B mRNA表達(dá)水平的測定:使用PureLink Micro-toMidi總RNA分離試劑盒提取大鼠海馬組織總RNA，使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在RNA TaqMan microRNA分析儀將(20 ng)RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?6℃退火30min，然后在42℃延伸30min。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測AMPK、NR2B的表達(dá)，引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。引物序列如下：AMPK正向引物：5'-CCTAAGGATCCAGGGAATCCCAT-3'，反向引物：5'-CGGTATACGACCAAATCCGCCGA-3'；NR2B正向引物：5'-CCGACGCCAATCTTGTCTCCTGGA-3'，反向引物：5'-CGGATCCTGTTCGACAGTCACAAC-3'；U6正向引物：5'-TGGAGTCCCTTGTGGTTCTGGAGTC-3'，反向引物：5'-CGTGGGACTGACTGTTCGACCTGGA-3'。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在一式三份的孔中進(jìn)行循環(huán)PCR。程序?yàn)椋?5℃下變性15s，60℃下退火和延伸1min。使用SDS軟件確定循環(huán)閾值(Ct)熒光值。采用2-△△Ct法計(jì)算AMPK、NR2B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參基因。

1.8大鼠海馬組織AMPK、NR2B蛋白表達(dá)水平的測定:將海馬組織樣本在RIPA裂解液中進(jìn)行裂解，然后在4℃下以12000×g離心20min。使用Bradford蛋白質(zhì)檢測試劑盒來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。樣品(每泳道60μg)通過8%SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用5%脫脂牛奶將膜封閉2h，并在4℃加入AMPK一抗(1∶500稀釋)、NR2B一抗(1∶500稀釋)、GAPDH抗體(1∶1000稀釋)。GAPDH被用作對(duì)照。將膜在PBS-Tween20洗液中洗滌10min，將其與HRP偶聯(lián)二抗(1∶4000稀釋)孵育2h。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)Western印跡檢測試劑盒將印跡的蛋白條帶可視化，并用X射線膠片曝光。使用Epson Perfection 2480型掃描儀將沖洗過的膠片數(shù)字化，使用Glyko Bandscan軟件獲得光密度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較:模型組逃避潛伏期時(shí)間較對(duì)照組明顯升高，經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限停留的時(shí)間較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；鹽酸米諾環(huán)素組和丙泊酚低、高劑量組逃避潛伏期時(shí)間較模型組明顯降低，經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限停留的時(shí)間較模型組明顯升高(P<0.05)；丙泊酚低劑量組逃避潛伏期時(shí)間較鹽酸米諾環(huán)素組明顯升高，經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限停留的時(shí)間較鹽酸米諾環(huán)素組明顯降低(P<0.05)；丙泊酚高劑量組與鹽酸米諾環(huán)素組相比無明顯改變(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較

表2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元自噬小體水平比較

2.2各組大鼠海馬組織神經(jīng)元自噬小體水平比較:模型組神經(jīng)元自噬小體水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；鹽酸米諾環(huán)素組和丙泊酚低、高劑量組神經(jīng)元自噬小體水平較模型組明顯升高(P<0.05)；丙泊酚低劑量組神經(jīng)元自噬小體水平較鹽酸米諾環(huán)素組明顯降低(P<0.05)；丙泊酚高劑量組與鹽酸米諾環(huán)素組相比無明顯改變(P>0.05)。見表2。

2.3各組大鼠海馬神經(jīng)元病理結(jié)構(gòu)比較:對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較多，排列整齊；模型組海馬區(qū)見片狀神經(jīng)元壞死，數(shù)目減少，核固縮明顯；丙泊酚低劑量組壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少；鹽酸米諾環(huán)素組、丙泊酚高劑量組海馬區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。見圖1。

2.4各組大鼠海馬組織AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平比較:模型組AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；鹽酸米諾環(huán)素組和丙泊酚低、高劑量組AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.05)；丙泊酚低劑量組AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平較鹽酸米諾環(huán)素組明顯升高(P<0.05)；丙泊酚高劑量組與鹽酸米諾環(huán)素組相比無明顯改變(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠海馬組織AMPK NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

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圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理結(jié)構(gòu)圖(HE染色，400倍)

圖2 各組大鼠海馬組織AMPK、NR2B蛋白表達(dá)印跡圖

3 討 論

老年癡呆主要病理變化是神經(jīng)原纖維纏結(jié)，老年斑沉積和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。Aβ已被證明是老年斑中的關(guān)鍵成分，而tau蛋白的過度磷酸化可促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)[9]。有研究表明自噬對(duì)老年癡呆具有有益作用[10]。Aβ1-42或β樣淀粉蛋白1-40(Aβ1-40)及其前體淀粉樣前體蛋白(APP)和β切割的APP的羧基末端結(jié)構(gòu)域富含自噬空泡(AVs)在自噬中異常積累。AVs積累和溶酶體蛋白水解缺陷的自噬-溶酶體途徑功能失調(diào)發(fā)生在老年癡呆腦神經(jīng)中。AV的大量積累是老年癡呆癥中Aβ產(chǎn)生的原因，因此，自噬缺陷有助于異常的老年癡呆進(jìn)程。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組逃避潛伏期時(shí)間高于對(duì)照組，經(jīng)過原平臺(tái)位置次數(shù)、原平臺(tái)象限留時(shí)間、神經(jīng)元自噬小體水平低于對(duì)照組；鹽酸米諾環(huán)素組和丙泊酚劑量組逃避潛伏期時(shí)間明顯低于模型組，經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)、原平臺(tái)象限停留的時(shí)間、神經(jīng)元自噬小體水平高于模型組，且隨著丙泊酚給藥劑量的增加，呈劑量依賴性。這說明丙泊酚能降低老年癡呆大鼠神經(jīng)認(rèn)知功能損害，增加海馬神經(jīng)元自噬水平。大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)病理學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組海馬區(qū)見片狀神經(jīng)元壞死，數(shù)目減少，核固縮明顯；丙泊酚低劑量組壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少；鹽酸米諾環(huán)素組、丙泊酚高劑量組海馬區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。這提示丙泊酚能明顯減輕老年癡呆大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度。

AMPK通路的激活在自噬中具有重要作用。AMPK是一種能量傳感器，可以調(diào)節(jié)急性和慢性腦損傷中的炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激和突觸可塑性?；罨腁MPK通過下調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(PI3K/p38)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子kappa B(NF-kB)和Nod -類受體蛋白3(NLRP3)的產(chǎn)生[11]。手術(shù)后老年大鼠海馬中的AMPK激活增強(qiáng)，而成年幼鼠海馬中的AMPK激活增強(qiáng)，這與認(rèn)知障礙發(fā)生的年齡依賴性有關(guān)[12]。此外，抑制AMPK激活不僅顯著改善了老年大鼠的認(rèn)知障礙，而且還限制了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，NR2B表達(dá)的下調(diào)以及手術(shù)后老年大鼠海馬中Tau和Tau磷酸化表達(dá)的上調(diào)[13]。這些數(shù)據(jù)表明AMPK可能是上游信號(hào)分子，啟動(dòng)了認(rèn)知障礙的病理過程。本研究結(jié)果顯示：模型組AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；鹽酸米諾環(huán)素組和丙泊酚低、高劑量組AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，且隨著丙泊酚給藥劑量的增加，AMPK、NR2B mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈劑量依賴性。這提示丙泊酚抑制AMPK信號(hào)通路誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元自噬來削弱老年癡呆大鼠神經(jīng)損傷。

綜上所述，丙泊酚能增加老年癡呆大鼠神經(jīng)元自噬水平進(jìn)而明顯減輕海馬神經(jīng)元損傷程度，其機(jī)制與丙泊酚抑制AMPK信號(hào)通路誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元自噬來削弱老年癡呆大鼠神經(jīng)損傷有關(guān)。