發(fā)酵食品微生物檢驗方法及其質(zhì)量控制研究

【摘 ? 要】 ? 傳統(tǒng)發(fā)酵食品檢驗方法因受到死菌細胞和雜質(zhì)顆粒的影響，導(dǎo)致檢驗穩(wěn)定性不高。因為，利用消除法處理活菌圖像中的黑色連通區(qū)域，去除雜質(zhì)顆粒，通過檢測空心去除死菌細胞。根據(jù)處理后的活菌圖像提取活菌特征參數(shù)，將提取到的參數(shù)輸入到BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得到發(fā)酵產(chǎn)物微生物檢驗結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，利用模糊控制技術(shù)設(shè)計反饋控制，通過溫度參數(shù)的反饋實現(xiàn)對發(fā)酵食品微生物的質(zhì)量控制。結(jié)果表明，研究的發(fā)酵食品微生物檢驗方法靈敏度高，精密度滿足檢驗需求，且穩(wěn)定性得到了提升。

【關(guān)鍵詞】 ? 發(fā)酵食品;微生物檢驗;質(zhì)量控制;食品安全;模糊控制

Research on Microbiological Inspection Methods and Quality

Control of Fermented Food

Chi Yufen

（Fuzhou Liming Vocational and Technical College，F(xiàn)uzhou 350109，China）

【Abstract】Due to the influence of dead cells and impurity particles， the traditional inspection methods of fermented food are not stable. The black connected area in the live bacteria image is processed by the elimination method to remove the impurity particles. The dead bacteria cells are removed by detecting the hollow. The characteristic parameters of the live bacteria are extracted according to the processed live bacteria image. The extracted parameters are input into the BP neural network to obtain the microbiological test results of the fermentation products. On this basis， fuzzy control technology is used to design feedback control， through the feedback of temperature parameters to achieve the quality control of fermented food microorganisms. The results showed that the microbial detection method of fermented food had high sensitivity， precision and stability.

【Key words】fermented food; microbiological examination; quality control; food safety; fuzzy control

〔中圖分類號〕 TS207.4 ? 〔文獻標識碼〕 ?A ? ? ? ? ? ? 〔文章編號〕 1674 - 3229（2021）03- 0000 - 00

0 ? ? 引言

發(fā)酵食品主要通過微生物作用制取獲得，該類食品發(fā)展到現(xiàn)在適應(yīng)范圍已經(jīng)非常廣泛，是目前食品工業(yè)中重要分支[1]。隨著發(fā)酵食品的發(fā)展，在給食品工業(yè)添加色彩的同時，也帶來了一些安全問題[2]。由于發(fā)酵工藝本身使用的微生物來源比較廣泛，在培養(yǎng)過程中容易受到污染，菌群形成也比較復(fù)雜，很難控制，發(fā)酵過程中容易混有有害菌株，導(dǎo)致在發(fā)酵食品中存在一些有害的代謝產(chǎn)物;另外，在發(fā)酵過程中如果對雜菌含量控制不當，也會出現(xiàn)培養(yǎng)基或反應(yīng)過程中含有有害菌，影響發(fā)酵食品質(zhì)量[3-5]。對于這種情況，發(fā)酵食品的微生物在線檢驗受到越來越多的重視。

現(xiàn)階段，國內(nèi)外已經(jīng)有了一些自動的微生物分析技術(shù)問世，如基于高通量測序的檢驗方法和基于擴增子測序的檢驗方法，但以上兩種方法受到死菌細胞和雜質(zhì)顆粒的影響，對于活菌的檢驗存在靈敏度低，精密度不高的情況[6-8]。因此，提出一種新的發(fā)酵食品微生物檢驗方法，同時研究其質(zhì)量控制，解決傳統(tǒng)檢驗方法中存在問題，為發(fā)酵食品的安全發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 ? ? 發(fā)酵食品微生物檢驗方法設(shè)計

1.1 ? 提取活菌圖像特征參數(shù)

在提取活菌圖像特征參數(shù)之前，采用中速定量濾紙去掉絕大部分的雜質(zhì)顆粒，但是處理完成后在活菌圖像中還是存在一部分雜質(zhì)顆粒[9]。因此，在提取活菌圖像中的特征參數(shù)之前，需要采取一定的手段將非菌體的部分剔除掉?？紤]到絕大多數(shù)的活菌體內(nèi)部存在空心這一特點，采用大區(qū)域消除法去除掉黑色連通區(qū)域面積過大的雜質(zhì)顆粒，將連通區(qū)域中的所有像素值置為白色，消除該區(qū)域。并且在消除完成后，通過掃描空心去除死菌影響[10]。

掃描去除黑色連通區(qū)域的活菌圖像，假設(shè)剩余連通區(qū)域的[X]軸和[Y]軸坐標的最大值分別為[Xmax]、[Ymax]，最小值為[Xmin]、[Ymin]，利用公式計算出中心點坐標，計算公式如下：

[Ox=Xmax-Xmin2Oy=Ymax-Ymin2] （1）

通過計算的中心坐標，結(jié)合周圍八個方向點的像素值之和，判斷出該連通區(qū)域是否為空心。如果以上9個點之和不為零，說明該連通區(qū)域是空心的，反之，則是實心區(qū)域。當判斷出連通區(qū)域為實心區(qū)域，則將該區(qū)域所有像素值置為白色，消除該區(qū)域，去除死菌影響。消除結(jié)果如圖1所示。

為了更準確地提取出活菌圖像中的特征參數(shù)，對二值圖像掃描，找到第一像素值為0的點，以該點為起始點進行順時針輪廓跟蹤，直到回到起始點，此時跟蹤結(jié)束[11]。將跟蹤后形成的區(qū)域填充為灰色，完成單個菌體細胞的空洞填充，待掃描完成后，將所有灰色區(qū)域填充為黑色。

利用公式計算出利用鏈碼進行跟蹤時的菌體面積，計算公式如下：

[S0=i=1nκixyi-1+12κiy] （2）

公式中[n]表示鏈碼總數(shù)，[i]表示8個方向，[y]表示縱坐標，[κiy]表示縱坐標上對應(yīng)點的坐標，如圖2所示。

完成填充后，提取活菌圖像中的特征參數(shù)。根據(jù)微生物細菌的形態(tài)學(xué)特征，提取的參數(shù)特征包括菌體區(qū)域面積、菌體邊界長度、形狀因子和偏心率[12]。其中菌體區(qū)域面積計算公式如公式（2）所示。菌體邊界長度是鏈碼所圍細菌細胞區(qū)域的周長，上述中鏈路為8連通區(qū)域，在此情況下，默認垂直和水平的步幅為1，則其對角幅為[2]，則周長[L]計算公式為：

[L=nr+nu2] （3）

公式中，[n]表示鏈碼的偶數(shù)碼的數(shù)目，[u]表示鏈碼中的奇數(shù)碼的數(shù)目。在所有特征參數(shù)中，形狀因子主要用來描述菌體細胞區(qū)域與圓形偏離、以及菌體表面褶皺的程度[13]。該特征參數(shù)計算公式如下：

[G=L24πS0] （4）

當活菌體呈現(xiàn)標準形狀時，計算出的[G]值為1，當菌體形狀與標準形狀偏離得越嚴重，形狀因子[G]偏離1越遠。計算特征參數(shù)中的偏心率，需要先計算出長軸長和短軸長[14]。計算公式如下：

[Pw=maxv=1iκvx+x0-minv=1iκvx+x0Ph=maxv=1iκvy+y0-minv=1iκvy+y0] （5）

公式中，[κv]表示活菌圖像上的任意一點，[κvx]表示橫坐標上的分量，[κvy]表示縱坐標上的分量，[x0]與[y0]表示起始點的坐標。則長軸長和短軸長分別為：

[fc=maxPw，Phfi=minPw，Ph] （6）

偏心率計算公式為：

[η=fcfi] （7）

公式中，[fc]表示區(qū)域長軸，[fi]表示區(qū)域短軸，在實際計算中偏心率的值會略大于實際值，這是因為活菌圖像數(shù)字化會產(chǎn)生邊角效應(yīng)[15]。通過以上過程區(qū)分出菌體細胞和雜質(zhì)顆粒，從中提取出能夠描述細菌的形狀特征作為微生物檢驗參數(shù)，以便用于后續(xù)的微生物檢驗。

1.2 ? 檢驗分類器設(shè)計

以提取出的特征參數(shù)作為輸入，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)發(fā)酵食品微生物檢驗。設(shè)計BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時，以提取的特征參數(shù)作為輸入層的神經(jīng)元，輸出層包含一個神經(jīng)元，設(shè)置細菌的導(dǎo)師信號是0.9，非細菌的導(dǎo)師信號為0.1。隱含層中的神經(jīng)元數(shù)通過計算獲得：

[n1=β+ω+α] （8）

公式中，[β]表示輸出神經(jīng)元數(shù)，[ω]表示輸入神經(jīng)元數(shù)，[α]表示常數(shù)，[α∈1，10]。使用雙曲正切[S]型函數(shù)將神經(jīng)元的輸入范圍為[-∞，+∞]映射到[-1，1]，當各個神經(jīng)元采用[S]型函數(shù)時，使用兩個隱含層即可實現(xiàn)任意輸入的任意函數(shù)，檢驗出發(fā)酵食品中各類微生物。[S]型函數(shù)表示為：

[Sx=11+e-x] （9）

將提取的特征參數(shù)輸入到設(shè)計的BP網(wǎng)絡(luò)中后，采用[S]型函數(shù)，使用任意兩個隱含層即可實現(xiàn)發(fā)酵食品微生物的檢驗。

2 ? ? 發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制設(shè)計

發(fā)酵食品微生物質(zhì)量與發(fā)酵溫度息息相關(guān)，微生物發(fā)酵過程中主要分為菌體生長和產(chǎn)物生產(chǎn)兩個階段，只有在最優(yōu)溫度的環(huán)境條件下，使微生物質(zhì)量符合最優(yōu)溫度條件，才能得到最佳產(chǎn)物。

在發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制中，采用模糊控制，以溫度作為反饋參數(shù)，通過溫度的反饋控制質(zhì)量的變化。溫度的控制則通過調(diào)節(jié)冷卻水流量來實現(xiàn)。模糊控制結(jié)構(gòu)如圖3所示。

在發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制過程中，首先設(shè)定一個溫差閾值[T']，通過比較實際溫差絕對值與溫差閾值實現(xiàn)控制。當[T>T']時，采用模糊控制加快響應(yīng)速度，調(diào)節(jié)環(huán)境溫度;當[T=T']時，采用控制器實現(xiàn)反饋，控制微生物質(zhì)量。

3 ? ? 發(fā)酵食品微生物檢驗方法及質(zhì)量控制實驗研究

3.1 ? 實驗材料及設(shè)備

發(fā)酵食品種類比較多，在實驗研究中選擇一種比較典型的蔬菜發(fā)酵制品酸菜作為研究目標，酸菜主要以大白菜為原料，利用天然的微生物進行乳酸發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，微生物群落不斷變化，情況比較復(fù)雜。因此，使用酸菜作為實驗?zāi)繕?，對不同檢驗方法的對比分析具有重要意義。使用不同的微生物檢驗方法在相同的實驗條件下分析其靈敏度以及精密度。實驗中使用的試劑如表1所示。

實驗中使用的設(shè)備有生物傳感器、電熱手提式壓力蒸汽消毒器、電子天平、生化培養(yǎng)箱、pH計、離心機、熒光定量PCR儀以及分光光度計。

3.2 ? 細菌培養(yǎng)及材料制備

準備液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，使用酵母、NaCl和胰蛋白胨溶于去離子水中，待粉末完全溶解后，使用NaOH溶液調(diào)整pH值到7.4，制成液體培養(yǎng)基，待滅菌操作后，放入無菌操作臺待用。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入瓊脂粉，高壓滅菌后備用。

在實驗之前，取出一定量的液體培養(yǎng)基，在無菌操作臺上接入大腸桿菌菌種，將其放入搖床中，設(shè)置好轉(zhuǎn)速與溫度，經(jīng)過一定時間的處理，得到飽和的菌懸液;選取一定量的酸菜發(fā)酵液，通過過濾去除掉液體中的雜質(zhì)，得到無雜質(zhì)的濾液，經(jīng)過高壓滅菌后，將菌懸液注入到滅菌酸菜液中，混合搖勻后，得到實驗樣品，根據(jù)實驗需求將其分組，其中一組用于驗證，另外三組用于檢驗。

3.3 ? 靈敏度實驗及分析

采用熒光定量分析方法進行檢驗，根據(jù)檢驗結(jié)果的吸收峰圖譜，分析不同檢驗方法的靈敏度。實驗結(jié)果如下所示。

對比觀察圖中結(jié)果可知，圖a中顯示五種菌株反應(yīng)基本相同，沒有檢驗出發(fā)酵乳酸產(chǎn)物，其靈敏度差;相比之下，圖b中菌株05的檢出限得到了提高，但是依然沒有檢驗出發(fā)酵乳酸產(chǎn)物，其靈敏度較高;圖c中顯示五種菌株中只有菌株05出現(xiàn)陽性吸收峰，菌株05對發(fā)酵乳酸才有產(chǎn)物生產(chǎn)，其靈敏度更高。這說明所提發(fā)酵食品微生物檢驗方法在檢驗過程中沒有受到死菌細胞和雜質(zhì)顆粒的影響，在實驗樣品中準確地檢驗出了發(fā)酵乳酸產(chǎn)物。

3.4 ? 精密度實驗及分析

精密度實驗主要根據(jù)不同檢驗方法對實驗樣品中不同菌種的檢出率，計算出回歸方程，根據(jù)標準的回歸方程和相關(guān)參數(shù)分析不同檢驗方法的精密度。精密度實驗結(jié)果如表2所示。

從表中結(jié)果可以看出，傳統(tǒng)的檢驗方法中不同菌種的峰面積跨度比較大，RSD值也比較高，說明兩種檢驗方法精密度不夠;而設(shè)計的檢驗方法不同菌種之間峰面積相差不大，并且RSD值比較低，說明該方法的精密度比較高。結(jié)合靈敏度實驗結(jié)果可知，所提發(fā)酵食品微生物檢驗方法的靈敏度高，精密度能夠滿足檢驗需求，說明所提方法優(yōu)于傳統(tǒng)的發(fā)酵食品微生物檢驗方法。

4 ? ? 結(jié)語

食品微生物發(fā)酵是一個比較復(fù)雜的過程，具有較高的不確定性，研究發(fā)酵食品衛(wèi)生檢驗方法及其質(zhì)量控制可以在很大程度上保證食品安全。本文針對傳統(tǒng)的檢驗方法中的問題，設(shè)計具有針對性的處理方法，以達到解決相關(guān)問題的目的。通過對比實驗證明了提出的方法的穩(wěn)定可靠。但是研究過程中發(fā)現(xiàn)了一些問題，提出的檢驗方法自動化程序不夠高效，需要消耗一定的人力資源成本，在后續(xù)的研究中可從這一方面進行深入研究。

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[收稿日期] ? 2021-02-12

[基金項目] ? 2019年福建省中青年教師教育科研項目“基于高職藥物制劑技術(shù)專業(yè)的就業(yè)情況調(diào)查與人才培養(yǎng)的研究”（JAS19743）

[作者簡介] ? 池玉芬（1985- ），女，碩士， 福州黎明職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，研究方向：食品營養(yǎng)與檢測。