用于CRISPR 文庫篩選的N2a-Cas9 細胞系的構建

張紀文，王露露，李 芳，劉 杏，趙東明，步志高

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于細菌或古生細菌中的一種抵御外源DNA侵入的適應性免疫反應系統(tǒng)[1]。目前，CRISPR/Cas9作為一種能夠對哺乳動物細胞基因組進行精準修飾的技術，被廣泛應用在功能性基因的篩選[2]。最近，利用CRISPR/Cas9 高通量篩選技術研究基因功能、基因治療、藥物研發(fā)、疾病作用機理和病毒宿主相互作用的關鍵分子篩選等方面取得了重大進展[3-6]?？袢∈且环N急性致死性的人獸共患傳染??；病毒在細胞內寄生，具有嚴格的嗜神經性[7]。當前尚未見基于CRISPR/Cas9 高通量篩選研究狂犬病病毒（RV）感染神經細胞的報道，因此本研究構建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的N2a-Cas9 單克隆細胞系，為基于CRISPR/Cas9全基因組高通量篩選技術探究神經細胞內關鍵宿主基因調控RV 嗜神經性提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞株人胚胎腎細胞（Human embo?rynic kidney cell，HEK293T）、鼠神經瘤母細胞（N2a）細胞株由本實驗室保存。LentiCas9-Blast 質粒、pXPR-011 質粒、慢病毒pMD2.G、pSPA X2 骨架質粒購自Addgene 公司。

1.2 主要試劑大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；兔源Cas9 單克隆抗體（MAb）和HRP 標記山羊抗兔IgG 抗體（IgG-HRP）購自Abcam 公司；Polybrene、殺稻瘟菌素（Blasticidin）、Puromycin 購自Sigma 公司；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 購自Promega 公司；TransIT?-Len?ti Transfection Reagent 購自Mirus 公司。

1.3 慢病毒的包裝和感染劑量的確定按照TransIT?-Lenti Transfection Reagent 說明書方法，將LentiCas9-Blast、pMD2.G 和pSPA X2 共 轉 染 至HEK-293T，包裝慢病毒。72 h 后收集慢病毒上清液并離心，再用0.45 μm 濾器過濾。將慢病毒按照不同劑量（320 μL、160 μL、80 μL、40 μL、20 μL、10 μL、5 μL）感染N2a 細胞，設不加慢病毒及無殺稻瘟菌素的細胞對照組。慢病毒感染24 h 后，換為含有20 μg/mL 殺稻瘟菌素的完全培養(yǎng)基。對于無抗生素選擇的對照孔，換為完全培養(yǎng)基。在不同的感染劑量下分析存活細胞數的差異來確定最佳慢病毒感染劑量。

1.4 慢病毒轉染和N2a 表達Cas9 蛋白細胞系的獲得將含LentiCas9-Blast 慢病毒的上清液以MOI 0.3感染N2a 細胞，加入含10 μg/mL Polybrene DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，更換為新鮮的選擇培養(yǎng)基。陰性對照組細胞全部死亡時，初步篩選出陽性細胞。采用終點稀釋法對陽性細胞株亞克隆并擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后取細胞，用RIPA 裂解液裂解細胞，取細胞裂解液進行SDS-PAGE（7.5%），之后將蛋白質轉印至0.2 μm PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉，以兔源Cas9 MAb（1∶1 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000）為二抗孵育。采用化學發(fā)光系統(tǒng)檢測N2a 細胞系表達的Cas9 蛋白，最終獲得N2a-Cas9 細胞系。

1.5 表達Cas9 蛋白的N2a 細胞切割活力檢測按照1.3 的步驟將質粒pXPR-011 包裝成慢病毒。用pXPR-011 包裝的慢病毒感染N2a 和N2a-Cas9 細胞系（MOI 1）。48 h 后，更換含有2 μg/mL 嘌呤霉素完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。14 d 后，將N2a 細胞系和轉導pXPR-011 的N2a 細胞系分別作為陰性和陽性對照，用流式細胞儀CytomicsTMFC 500對樣本進行分析。

1.6 N2a-Cas9 細胞活力檢測將處于對數生長期的N2a 和N2a-Cas9 細胞計數，使細胞數約為5×104個/100 μL，每種細胞設4 個復孔，接種到96 孔不透明細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。按照CellTiter-Glo 試劑盒操作步驟檢測細胞的增殖活力，最后用Glomax96 microplate luminometer 檢測發(fā)光信號值，比較分析兩種細胞系的活力差異。

2 結果與討論

2.1 慢病毒感染劑量的確定將含慢病毒上清液進行倍比稀釋，使病毒以不同劑量感染N2a 細胞系。在抗生素加壓篩選72 h后，當不加病毒對照組的細胞全部死亡，且無抗生素對照組細胞密度為80%～90%。使用Logos Luna Ⅱ自動細胞儀計數細胞數量。結果顯示慢病毒感染劑量與細胞存活率存在劑量依賴關系（圖1）。為了保證每個細胞僅感染一個慢病毒，本實驗選取感染率為30%作為最佳慢病毒感染劑量。結果表明，40 μL 慢病毒為理想的病毒感染劑量，經計算病毒滴度為1.8×106TU/mL。感染率=抗生素選擇條件下的細胞數量/無抗生素選擇下的細胞數量，病毒滴度（TU/mL）=（初使感染細胞數×感染率）/（每孔感染病毒體積）×1 000。

2.2 表達Cas9 蛋白N2a 細胞系的獲得用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，以N2a 細胞裂解液為陰性對照。Western blot 結果顯示，2 號和9 號細胞系的Cas9 蛋白表達水平較高（圖2）。表明2 號和9 號比較適合后續(xù)N2a 細胞系Cas9 蛋白切割活力的檢測。

圖2 Western blot 分析N2a 細胞表 達的Cas9 蛋白Fig. 2 Western blot analysis for the expression of Cas9 protein in N2a cells

2.3 表達Cas9 蛋白的N2a 細胞切割活力檢測結果質粒pXPR-011 同時含有GFP 和針對GFP 的gRNA 序列，細胞內Cas9 蛋白會在gRNA 的引導下對GFP 基因進行切割，因此細胞表達的GFP 越少，說明Cas9 蛋白的切割活力越高。采用質粒pXPR-011包裝成的慢病毒分別感染N2a 和N2a-Cas9 細胞系14 d 后，利用流式細胞儀CytomicsTMFC 500 對樣本進行分析。結果顯示，2 號單克隆細胞系表達的GFP較少，Cas9 切割活力較好，且Cas9 蛋白能在N2a 細胞中穩(wěn)定表達（圖3）。表明2 號N2a-Cas9 細胞系可以用于CRISPR 文庫篩選。

2.4 N2a-Cas9 細胞系活性的測定結果采用CellTiter-Glo 試劑盒檢測N2a 和2 號N2a-Cas9 細胞系的增殖活力。結果顯示，在相同的條件下，與對照細胞相比兩者無差異（圖4）。結果表明，Cas9 蛋白不影響細胞的增殖活性。

RV 侵入宿主細胞是由細胞受體介導的膜吸附啟動的感染過程[8]。目前，一些研究人員已經發(fā)現了多種受體在病毒吸附階段發(fā)揮了重要作用，但這些均不是嚴格意義上的特異性受體[9]。有學者以小鼠N2a 細胞為模型研究RV 感染過程中的嗜神經性，發(fā)現在感染過程中細胞伴侶蛋白CCTγ 能夠促進RV 復制[10]?；谀軌蜻M行多重測序的二代測序技術，可以利用構建的N2a-Cas9細胞，結合Addgene上的鼠全基因組sgRNA 文庫以及本實驗室構建的ERA-GFP 報告病毒，在單細胞水平上進行大規(guī)模干擾表型實驗，篩選能調控RV 侵染宿主細胞的關鍵宿主因子[11]。因此，本研究利用慢病毒轉導系統(tǒng)構建了穩(wěn)定表達Cas9 蛋白的N2a-Cas9 單克隆細胞系，為基于CRISPR/Cas9 全基因組高通量篩選技術鑒定RV 嗜神經性相關特異性受體及探究病毒與宿主蛋白相互作用機制提供研究基礎。

圖3 檢測N2a 細胞Cas9 蛋白的切割活力Fig. 3 Detection of Cas9 protein cleavage activity in N2a cells

圖4 N2a-Cas9 細胞系中Cas 基因的表達對細胞增殖活性的影響Fig. 4 The analysis of cell proliferation activity on N2a-Cas9 cell line with the expression of Cas