牛白血病病毒抑制奶牛免疫系統(tǒng)功能的研究進展

李思妍，王 雍，連 帥，王建發(fā)，武 瑞*

（1. 黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省牛病防制重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

牛白血病（Bovine leucosis，BL）是由BL 病毒（BLV）引起的一種牛的傳染病，根據該病的流行特點和表現形式分為流行性牛白血?。‥nzootic bovine leukosis，EBL）和散發(fā)性牛白血?。⊿poradic bovine leukosis，SBL）。BLV 感染幾乎遍布世界各地且主要在奶牛中廣泛傳播，其傳播方式有水平傳播、垂直傳播和哺乳傳播。1871 年立陶宛Leisering 等最早報道BLV 后，EBL 開始在世界各地的奶牛中廣泛發(fā)生，最新的調查結果顯示，中國各地區(qū)奶牛群中該病感染率為0～61.7%[1]，呈現出感染率高和發(fā)病率低的特點[2]。

BLV 感染牛后的發(fā)展進程分3 個階段：發(fā)病初期，大多數牛不表現任何臨床癥狀，血清學鑒定為陽性，表現為非淋巴細胞增多癥（Alymphocytosis，AL）；30% 的BLV 感染牛會進一步發(fā)展為持續(xù)性淋巴 細胞增多癥（Persistant lymphocytosis，PL），此時，病毒和機體處于平衡狀態(tài)；最終僅有1%～10%的BLV 感染牛會發(fā)展為淋巴肉瘤（Lymphosarcoma，LS）。研究結果表明，PL 不是惡性增生，只有LS 才屬于惡性增生，并可以在數月后導致患病牛死亡[3]。因此對BLV 感染來說，只有表現出LS 時才可以稱為地方流行型白血病[4]，EBL 潛伏期很長，老齡牛發(fā)病率高。BLV 對牛群造成的經濟損失主要來自產奶量下降，泌乳性能降低，淘汰率升高，國際貿易的限制及屠宰帶有淋巴瘤的牛對銷售價格造成的影響[5]。近年來美國、澳大利亞和阿根廷等國家乳腺癌患者的乳腺組織中接連被檢測出BLV 基因片段，雖然尚無充分證據表明BLV 就是人乳腺癌的元兇[6]，但研究BLV 的感染機制和風險對于闡明逆轉錄病毒的感染機制和防控養(yǎng)牛業(yè)的安全風險意義重大。

BLV 主要感染牛淋巴細胞和外周血單核細胞。在感染期間，BLV 能夠逃避宿主的免疫反應，使宿主的免疫應答發(fā)生變化，繼而導致患病牛存在繼發(fā)其他疾病及免疫失敗等風險。本文綜述BLV 導致宿主細胞免疫和體液免疫功能的異常，旨在為探究BLV 感染引起牛機體的免疫抑制奠定基礎。

1 BLV感染導致宿主細胞免疫功能的異常

1.1 Th1 細胞功能異常Th1 反應的特征性促炎細胞因子主要包括IFN-γ、IL-2 和IL-12，且BLV 感染后這些細胞因子的表達水平均出現了異常（表1）。與正常牛和AL 時期患牛相比，PL 時期患牛體內的外周血單個核細胞（PBMC）中，IL-2 mRNA 的轉錄水平均顯著減少[7]；將不同時期牛的PBMC 同刀豆球蛋白（ConA）共培養(yǎng)后， 結果顯示PL 時期牛的IL-2活性最高[8]，且PL 與AL 時期的牛IL-2 mRNA 轉錄水平均較高[9]。而PL 時期牛的CD4+T 淋巴細胞中，只有較少的IL-2表達，當經ConA刺激后，PL牛IL-2的表達水平則與陰性牛相似[10]，結果表明BLV 在體內可以抑制IL-2 的表達，進而對淋巴細胞的生長、增殖、分化、免疫應答等功能均起到抑制作用。

奶牛感染BLV 后， IFN-γ 在病牛體內的變化趨勢與IL-2 類 似， PL 與AL 時期牛的PBMC 中，IFN-γ mRNA 轉錄水平與陰性牛相比均降低。在PBMC 中加入ConA 刺激后，PL 和AL 時期牛之間，IFN-γ mRNA 的轉錄水平無差異，但患病牛的IFN-γ mRNA 轉錄水平均顯著高于陰性牛。體外培養(yǎng)的PBMC 經ConA 刺激后，3 個時期牛的IFN-γ 均具有相同的轉錄趨勢[9]。在BLV 感染的免疫應答期，漿細胞樣樹突細胞（pDC）活化時，IFN-γ 的表達量顯著增加，但在經典樹突細胞（cDC）中，IFN-γ 的表達量減少[11]。

表1 BLV 陽性牛異常的Th1 型細胞因子

IL-12 作為Th1 型細胞免疫反應的特征性細胞因子，在BLV 感染后其mRNA 轉錄水平顯著升高，但在BLV 陽性牛之間IL-12 mRNA 轉錄水平無顯著差異[12]。 IL-12 具有不同亞基成分，這些成分在淋巴瘤中的轉錄水平也不盡相同， PL 期牛的PBMC中， IL-12（p40）mRNA 轉錄水平減少，而AL 期牛的PBMC 中， IL-12（p40）mRNA 轉錄水平卻是升高的[13]。在BLV 感染期間，單細胞來源的樹突細胞（MoDC）群體均被活化， IL-12 p40 和IL-12 p70 的表達量均減少，由此推進了BLV 對機體的感染[14]。

PD-L1 作為一種T 細胞抑制因子，在BLV 陽性牛體內表達PD-L1 的B 細胞要明顯多于陰性牛，PD-L1 的表達被阻斷后陽性牛PBMC 中的IL-2 和IFN-γ 的表達量均顯著增加，表明PD-L1 在細胞因子的表達中發(fā)揮負調控作用[15]。 T 細胞中淋巴細胞活化基因3（LAG3）和T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim3）的表達量均增加， B 細胞中PD-L1 的表達量增加，T 細胞IFN-γ 的表達量減少，均表明BLV感染牛的經典T 細胞的活性受到了抑制。將表達Tim3 的細胞作為配體誘捕劑添加到細胞中培養(yǎng)12 h后， BLV 陽性牛PBMC IFN-γ 的表達量顯著增加，表明BLV 可以通過增加Tim3 表達水平而降低T 細胞的反應性[16]。

1.2 CD8+ T 細胞功能異常與陰性牛相比，BLV陽性牛與CD8+T 細胞活化和增殖相關的負調節(jié)因子mRNA 轉錄水平均顯著增加，如LAG3[17]、Tim3[15]和Gal9。BLV陽性牛的CD8+T也會表現出一些異常的活性，當體外培養(yǎng)牛的PBMC 經 IL-2 刺激10 d～12 d后， AL 牛PBMC 的γδT 細胞數量較其他兩個時期顯著增加， CD8+T 細胞的比例則顯著降低[10]。在BLV陽性牛體內分離的T 細胞中， MHC-Ⅱ類分子和CD25 表面受體的表達與陰性牛相比無顯著差異[18]，盡管如此， BLV 陽性牛經典的T 細胞活性也明顯受到抑制，CD8+T 細胞的活化和增殖均受到抑制，這為BLV 在機體內的免疫逃避提供了機會。

1.3 單核細胞和巨噬細胞功能異常BLV 雖是一種以感染B 淋巴細胞為主的反轉錄病毒，但也可以從單核細胞或巨噬細胞中分離出其原病毒DNA。 BLV感染對PBMC 和巨噬細胞表面抗原的表達也會產生影響。

AL 時期牛新鮮分離的外周血白細胞（PBL）及單核細胞表面表達的CD11b 和CD32 相對百分含量與另外兩個時期患牛相比呈增加趨勢，但單核細胞CD14 和MHC-Ⅱ類分子的表達量則相對減少[18]，表明AL 時期牛的抗原遞呈能力受到抑制。有數據表明，雖然BLV 陰性牛單核細胞的CD11b 和MHC II 類分子的的總表達量更多，但單個單核細胞的這兩種蛋白的表達水平均低于正常牛。與陰性牛的單核細胞相比，從AL 時期牛中分離的單核細胞對大腸桿菌的吞噬活性顯著降低[19]。在培養(yǎng)的巨噬細胞中發(fā)現AL 時期牛表達CD11b 和CD14 的細胞百分比顯著降低，表明它們的功能在BLV 感染后出現異常。CD11b、CD32 和CD14 這些表面受體是單核細胞和巨噬細胞的主要標志物，其中CD11b 對細胞粘附和遷移起到重要作用；CD32 是單核細胞與B 淋巴細胞共有的受體，對調節(jié)抗體水平很重要[20]； CD14 是一種能夠結合細菌脂多糖（LPS）的受體。雖然在患牛體內BLV 對CD11b、CD32和CD14的表達水平造成了影響（表2），但在體外培養(yǎng)的單核細胞中加入BLV刺激后則不會對這幾種受體的表達量造成影響[21]，表明單核細胞或巨噬細胞的功能異常可能不是BLV感染的直接結果。

表2 BLV 陽性牛單核/巨噬細胞表面主要受體的異常表達

2 BLV感染導致的體液免疫功能異常

2.1 B 細胞功能異常當機體受到抗原刺激時，吞噬細胞首先發(fā)揮作用，對其進行攝取和處理以暴露出抗原決定簇，然后經T 細胞遞呈給B 細胞，受抗原刺激的B 細胞增殖分化產生漿細胞和記憶細胞，從而產生特異性體液免疫反應，發(fā)揮免疫功能，但由于AL 期牛不表現臨床癥狀，所以對該期牛B 細胞功能異常的研究相對較少。

與陰性牛最主要的區(qū)別是BLV 感染后B 細胞的異常增殖，CD5+B 細胞是BLV 原病毒整合的主要靶點， BLV所引起的B細胞增殖主要就發(fā)生在這一細胞亞群中（PL 期B 細胞的CD5 表達量達90.5%）[22]。在人和小鼠中，CD5+B 細胞代表一種獨特的非經典B 細胞譜系，主要來源于胎兒肝臟，對T 細胞非依賴性抗原有反應，產生天然免疫球蛋白M（IgM），又被稱作B-1a 細胞。而所有動物中的CD5+IgM+B 細胞群體均比其他細胞群體具有更高的BLV 前病毒載量[23], 表明CD5+B 細胞可能是BLV 所引起機體免疫抑制的關鍵因素之一。

在PL 期牛新鮮分離的IgM+細胞中，MHCⅠ和MHC Ⅱ類分子mRNA 的轉錄水平與另外兩個時期的患牛相比均無明顯差異，但與正常牛相比， BLV 陽性牛PBMC 中的MHC Ⅱ類分子表達水平增加[8]，且表達MHC Ⅱ類分子B 細胞的比例明顯更高[18]。有趣的是，在體外培養(yǎng)的PBMC 中， IL-2 刺激可以提高正常牛B 細胞表面MHC Ⅱ類分子的表達[24]，但IL-2的刺激對PL 牛B 細胞MHC Ⅱ類分子的表達無影響。表明BLV 可能破壞了患牛體內的抗原遞呈能力。

從BLV 陽性牛分離的B 細胞中， CD25 受體的表達量較陰性牛顯著減少[18]，但體外培養(yǎng)20 h 后，無論是否用ConA 刺激， PL 時期牛分離的B 細胞表面CD25 的表達量均增加[18]。在培養(yǎng)的PBMC 中加入IL-2 刺激后， PL 時期牛B 細胞CD25 的表達量顯著提高，但若單獨培養(yǎng)B 細胞用IL-2 刺激后，則不能上調CD25 的表達量[9]。利用商陸絲裂原（PWN）刺激PBMC 后，陰性牛及PL 期牛B 細胞CD25 的表達量均顯著增加，且PL 期牛B 細胞表面CD25 受體表達量的上調更加明顯[25]。CD25 是IL-2 受體的α 鏈，其表達量的降低表明細胞對IL-2 的識別能力降低；且體外分離的B 細胞脫離BLV 感染牛的體內環(huán)境后，經藥物刺激增殖后，CD25 的表達量上升，表明CD25表達量的降低可能是BLV 間接調控所引起的。

產生響應病原侵襲的抗體是B 細胞的關鍵免疫功能之一，也是BLV感染宿主后免疫系統(tǒng)產生應答的方式之一。BLV感染牛產生某些特定抗體的功能會出現異常，如正常情況下，牛機體產生抗體IgM∶IgG 為1∶10，但BLV 感染牛產生的抗體比例并不穩(wěn)定，如將合成抗原接種PL 牛時，其產生的抗體水平是正常牛的兩倍。BLV 感染的牛，多種抗體的轉錄水平會產生異常，如BLV 感染牛的PBMC 中Igμ mRNA的轉錄水平增加，而IgA 的轉錄水平則會降低；BLV 感染牛的血清IgM 水平在短暫升高后呈降低趨勢，IgG 水平則無明顯變化。當BLV 感染牛接種J5大腸桿菌疫苗后，其血清中抗原特異性IgG2 顯著減少，IgG2 抗體作為抗大腸桿菌感染最有效的調理素，其顯著減少表明了BLV 陽性?？贵w水平的異常很可能會下調疫苗對機體的保護功能，使BLV 感染?？赡苊媾R免疫失敗的風險[26]。

2.2 Th2 型細胞功能異常BLV 感染后，會造成Th2 型細胞IL-4、IL-10 和IL-6 細胞因子的異常表達（表3），而對AL 牛Th2 型細胞功能的相關研究結果較少。在BLV 感染牛的PBMC 中， IL-4 mRNA 的轉錄水平較低。但在體外培養(yǎng)的PBMC中，BLV陽性牛IL-4 的轉錄水平與正常牛趨勢相同，且加入ConA 共培養(yǎng)后，3 個時期患牛IL-4 的轉錄水平無差異[9]。在PL 期牛的CD4+T 淋巴細胞中，IL-4 mRNA 轉錄水平降低，用ConA 刺激后PL 牛IL-4 的轉錄水平與陰性牛相似[7]，表明IL-4 不是受BLV 直接調控的細胞因子，其變化可能是BLV 對機體免疫功能造成的間接影響。

表3 BLV 陽性牛Th2 型細胞因子的異常表達水平的變化

與IL-4 相反的是，牛體內IL-10 的表達量隨著BLV 感染的發(fā)展則呈增加趨勢。IL-10 具有免疫抑制作用，可以抑制BLV 在PBMC 中復制時Tax 和pol mRNA 的轉錄水平，體外試驗也證實了其確實可以抑制BLV 的復制[27]。PL 時期牛的PBMC 被ConA 刺激后， IL-10 mRNA 的轉錄水平顯著增加[9]；BLV 感染后，患牛的cDC 和MoDC 中IL-10 的轉錄水平也呈顯著增加趨勢[11]，表明IL-10 在BLV 感染過程中具備成為檢測靶標的可能。

IL-6 也是機體參與調節(jié)免疫系統(tǒng)功能的重要細胞因子之一，在PL 時期牛的血清中，IL-6 轉錄水平顯著升高。在體外同ConA、細胞內毒素（LPS）、BLV gp-51 抗原共培養(yǎng)的PBMC 中， PL 期比另外兩個時期牛IL-6 的轉錄水平更高，流式細胞術測定結果也顯示，在BLV 陽性牛MoDCs 群體中，促炎細胞因子IL-6 的分泌量顯著升高[11]。表明BLV 感染導致機體發(fā)生了炎癥反應。

IL-4 是機體Th2 和體液免疫反應的特征性細胞因子， IL-10 可以調節(jié)并抑制促炎免疫反應，IL-6可以誘導T 細胞活化和B 細胞發(fā)育為成纖維細胞。PL 牛的PBMC 對IL-6 的親和力較低，這也恰好解釋了為什么PL 牛體內的IL-6 水平要高于陰性牛。大多數細胞因子的功能都是廣泛的，牛體內炎癥因子表達量的改變對牛外傷感染病原的清除、疫苗反應、組織重塑及牛體內炎癥的發(fā)生都有著不同且廣泛的影響。

3 小結與展望

BLV 可以通過多種途徑造成動物機體免疫抑制（圖1）和免疫紊亂。首先，在B 細胞方面， BLV 可直接引起牛MHC Ⅱ類分子的表達量增多，使B 細胞的抗原遞呈能力異常，從而引起機體免疫抑制；同時BLV 感染后，T 細胞和B 細胞表面CD25 受體的表達量顯著升高。CD25 作為IL-2 受體的α 鏈，影響IL-2 高親和力受體的表達水平，結合惡變的B 細胞表面會表達IL-2 高親和力受體這一現象，表明BLV可能通過B 細胞惡變使機體出現免疫抑制。在T 細胞方面， BLV 感染牛后體內的CD4+T 細胞和CD8+T細胞的活化和增殖能力均降低；B 細胞中的PD-L1表達量增多，阻斷了T 細胞表面的PD-1 對腫瘤細胞的識別，導致機體的細胞免疫功能下降。在細胞因子方面，在患病牛體內，IL-2表達水平呈下降趨勢，IFN-γ 的表達水平整體呈上升趨勢，表明機體內Th1型細胞因子在BLV感染后出現紊亂，機體細胞免疫功能失調；而作為Th2 型細胞因子的IL-4 的表達量在BLV 感染后下調，IL-6和IL-10的表達量則均上調，Th2型細胞因子功能出現紊亂。因此，BLV 感染后牛體內的細胞免疫和體液免疫功能均出現異常。

圖1 BLV 造成牛體內免疫抑制的多條途徑

綜上所述：（1）BLV 在機體內可以通過多個途徑對機體免疫功能造成影響，從而造成機體的免疫抑制。（2）由于BL 的臨床癥狀不明顯，因此該病的診斷一直是難點[28]?？梢酝ㄟ^綜合分析牛體內細胞因子的變化水平，在此基礎上將特異變化的細胞因子作為BL 的診斷標志物，可以為該早期的診斷提供參考。（3）研究顯示BLV 患病牛原代B 細胞淋巴瘤中的病毒基因會出現轉錄沉默，無法檢測到病毒的mRNA 和蛋白質，但可以檢測到BLV 編碼的mi?croRNA（miRNA），這種只能檢測到BLV miRNA 的淋巴細胞仍會呈現免疫抑制[29]，因此，可以考慮從沉默BLV miRNA 的角度開發(fā)只具有感染性而不具有致瘤性的BLV 活疫苗。

重大傳染病和生物安全風險事關國家安全和發(fā)展、社會大局的穩(wěn)定。BLV 在我國廣泛流行，可造成患牛免疫系統(tǒng)功能下降，降低牛奶質量。研究表明，BLV 可跨物種致使黑猩猩等動物發(fā)生白血病，BLV 還可能是導致乳腺癌發(fā)生的重要風險因素，BLV 編碼的miRNA 還可跨界調控多個人類基因[30]。在無BLV 商品化疫苗可供使用的情況下，一旦無BLV 國家以此作為乳制品國際貿易的營銷賣點，我國奶業(yè)將可能遭受比三聚氰胺事件更加嚴重的打擊。本研究室目前正在探究BLV 對荷斯坦牛乳脂乳蛋白合成機制的影響；由于BLV miRNA 具有跨界調控人源基因的風險性，本研究室將考慮針對BLV 與宿主受體互作、逃避宿主識別、誘導宿主免疫損傷、跨細胞類型傳遞等BLV 持續(xù)性潛伏感染形成和維持的關鍵環(huán)節(jié)，系統(tǒng)開展BLV 結合受體阻斷療法、共刺激信號激活療法、免疫損傷修復療法、阻斷跨細胞類型傳遞療法等的研究，探究多靶點協(xié)同干預的奶牛體內BLV 儲存庫的清除策略。該研究既有助于保障奶牛免疫系統(tǒng)功能、提升牛奶質量及安全，又對防范和化解潛在的公共衛(wèi)生風險具有重要意義。