宿主因子ZFAT 影響抗流感病毒固有免疫因子MxA 表達(dá)的研究

黃海翔，宋洋銘，施建忠，趙東明，楊孝樸，陳化蘭*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

世衛(wèi)組織截止2020 年1 月20 日的實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，H5N1 高致病性禽流感病毒（Highlypathogenic avian influenza，HPAI）的累計致死率高達(dá)52.85%[1]，而流感病毒在水禽和哺乳動物之間的跨物種傳播能力則是這一疾病周期性在人群中爆發(fā)的原因之一，長期的病原-宿主共進(jìn)化使得不同物種體內(nèi)表達(dá)的MxA 均具有廣譜抑制RNA 病毒復(fù)制的能力，而哺乳動物體內(nèi)表達(dá)的黏病毒抵抗蛋白（Myxo?virus resistance protein A，MxA）則對H5N1 高致病性禽流感病毒（HPAIV）有較高的敏感性[2-3]。流感病毒的感染過程中通常存在病毒蛋白與宿主因子相互結(jié)合并拮抗或增強(qiáng)特定生物學(xué)功能的情況，例如流感病毒NS1 與宿主DOK6 蛋白的相互作用使得NS1 蛋白抑制干擾素表達(dá)的功能受到拮抗[4-5]，因而這一過程中流感病毒密切參與并影響了宿主的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[6-7]。參照生物學(xué)通用互作庫數(shù)據(jù)集（BioGrid，https://thebiogrid.org/），本實驗利用組學(xué)映射數(shù)據(jù)篩選的方法取得了流感病毒感染進(jìn)程相關(guān)的蛋白-蛋白互作（PPI）結(jié)果，通過富集運(yùn)算篩選了互作組因子以后重點分析了包含抗流感免疫因子的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)包含AT 鉤結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白（Zinc-finger and AT hook domain containing protein，ZFAT）可能調(diào)控MxA 表達(dá)活性的信息。ZFAT 最早由Shirasawa[8]等人在甲狀腺自身免疫病模型中鑒定并發(fā)表，因其在造血干細(xì)胞分化調(diào)控和外周血淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制中的基礎(chǔ)性作用而受到關(guān)注[9]，盡管目前未有詳細(xì)闡明ZFAT 參與抗流感免疫機(jī)制的報道，但是ZFAT 與其他多個抗流感因子在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的密切聯(lián)系使得ZFAT 極有可能參與了抗流感免疫進(jìn)程，本實驗擬利用siRNA 干擾技術(shù)下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)，檢測ZFAT 沉默對流感病毒復(fù)制的影響，并在流感病毒感染條件下檢測ZFAT 沉默對MxA 和干擾素等其他固有免疫因子表達(dá)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料總RNA 提取試劑盒（DP419）購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑HiS?cript III RT SuperMix for qPCR（+g DNA wiper）（R323）及qPCR 試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Primestar DNA 聚合酶（R045A）購自TaKaRa 公司；轉(zhuǎn)染試劑Li?pofectamine LTX and Plus Reagent（15338100）、 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（13778）、Ham's-F12-K、Opti-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基以及胎牛血清均購自賽默飛世爾科技公司；環(huán)乙酰亞胺（Cyclohexi?mide,CHX，GC17198）購自GlpBio 公司；siRNA 合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；4×蛋白上樣緩沖液（P1015）購自Solarbio；鼠抗ZFAT 單克隆抗體（sc-398058）購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，兔抗MxA（37849S）、GAPDH（2118）多抗以及DyLight 800 近紅外熒光染料偶聯(lián)二抗（5151，5257）購自CST公司。

1.2 細(xì)胞系、病毒以及雞胚A549 以及HEK293T細(xì)胞系由本實驗室保存；流感病毒A/Anhui/2/2005（AH05）（H5N1）由禽流感國家參考實驗室鑒定及保存；10日齡SPF雞胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供

1.3 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測利用BioGrid 互作組學(xué)數(shù)據(jù)庫獲取ZFAT 和MxA 相關(guān)的一、二級映射網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 軟件中制作圖譜，將合并網(wǎng)絡(luò)依據(jù)CytoHubba 插件計算得出的各節(jié)點degree值并分級排布，最后通過富集分析獲取抗流感免疫的宿主因子名單，經(jīng)融合后篩選MxA 相關(guān)互作鏈條并將包含ZFAT 及中間節(jié)點的最簡網(wǎng)絡(luò)選出，單獨繪圖以方便后續(xù)驗證及分析。

1.4 qPCR 引物設(shè)計與合成依據(jù)GenBank 中人源ZFAT（57623）、MxA（4599）、IFNA1（3439）、IFNB1（3456）、IFNL1（282618）、IRF3（3661）、IRF7（3665）、IRF9（10379）mRNA 序列，利用Primer-BLAST 設(shè)計qPCR 引物（表1），引物由吉林庫美生物技術(shù)有限公司合成。

表1 qPCR 引物Table 1 Primers for qPCR

1.5 ZFAT siRNA 的設(shè)計與篩選依據(jù)GenBank 人源ZFAT（57623）mRNA 序列設(shè)計3 條獨立的siRNA（表2），每條siRNA 取20 pmol 加入50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后加入1.5 μL RNA iMAX 試劑，滴狀混勻，室溫靜置孵育15 min，懸浮干擾A549 細(xì)胞后37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h。試驗設(shè)scrambled siRNA 干擾后的A549細(xì)胞為對照，通過qPCR 和western blot 試驗檢測上述siRNA 干擾對ZFAT 的轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制效果并選取最佳siRNA用于后續(xù)實驗。

表2 siRNA 序列Table 2 siRNA sequence

收獲經(jīng)ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，按照總RNA 提取試劑盒說明提取RNA，測量樣品濃度后每份樣品取1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄，利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進(jìn) 行qPCR 檢測，選取表1 中ZFAT-qPCR-F/R 引物對按照表3 程序檢測ZFAT 的轉(zhuǎn)錄活性，GAPDH-qPCR-F/R 引物對用于檢測A549 細(xì)胞內(nèi)參基因GAPDH 的轉(zhuǎn)錄活性，通過相對定量計算2-ΔΔCt值得到目的基因表達(dá)差異，利用GraphPadPrism 7進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

表3 qPCR 反應(yīng)程序Table 3 qPCR program

收獲經(jīng)ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，制備western blot 檢測樣品，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂乳封閉后，以稀釋的鼠抗ZFAT 和GAP?DH 抗體（1∶1 000）4 ℃過夜孵育，次日經(jīng)室溫孵育近紅外熒光染料偶聯(lián)二抗（1∶500）1.5 h 后，western blot檢測ZFAT和GAPDH 的條帶亮度，采用ImageJ 軟件進(jìn)行相對灰度值分析。

1.6 流感病毒復(fù)制的滴定試驗流感病毒原液經(jīng)倍比稀釋后以MOI 0.001 感染經(jīng)ZFAT siRNA 和scram?bled siRNA 干擾的A549 細(xì)胞，37 ℃孵育1 h 后吸凈上清并用PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基置于37 ℃孵育，24 hpi、48 hpi 分別收獲培養(yǎng)基上清并接種于10日齡SPF雞胚中測定EID50。

1.7 流感病毒同步感染試驗與ZFAT 沉默后對MxA和干擾素等其他固有免疫因子表達(dá)活性的檢測流感病毒以MOI 1 感染CHX 處理后的ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾A549 細(xì)胞，4 ℃孵育1 h 吸凈上清并用PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基置于37 ℃孵育，分別于6 hpi、12 hpi收獲細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為對照，選取表1 中除ZFATqPCR-F/R 以外的所有引物對，GAPDH-qPCR-F/R 用于檢測細(xì)胞內(nèi)參基因，參考1.5 所示方法，收獲流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞樣品，利用表3 所示程序通過qPCR 檢測抑制ZFAT 表達(dá)在流感病毒感染前后對MxA、 IFNA1、 IFNB1、 IFNL1、 IRF3、 IRF7、IRF9、JAK1 以及STAT1 轉(zhuǎn)錄活性的影響，同時參照1.5 所示western blot 方法，利用兔抗MxA 一抗檢驗下調(diào)ZFAT表達(dá)后對MxA翻譯的影響。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測BioGrid 互作組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)融合和富集算法處理后，在Cytoscape 軟件中利用Cyto?Hubba 插件將節(jié)點分級排列，選取以MxA 和ZFAT 為中心的一級和二級網(wǎng)絡(luò)單獨繪圖（圖1），圖示中ZFAT 與MxA 處于同一個互作關(guān)系網(wǎng)，節(jié)點顏色表示與該節(jié)點蛋白存在直接互作的蛋白數(shù)量，紅色越深則表示該節(jié)點參與的互作關(guān)系越復(fù)雜，其中熱休克蛋白B1（HSPB1）及與之直接互作的干擾素刺激基因15（ISG15）、三聯(lián)基序蛋白25（TRIM25）均有參與抗流感免疫的報道[10-12]，因而該網(wǎng)絡(luò)可以被簡單劃分為相對獨立的兩個部分，即以MxA 表達(dá)調(diào)節(jié)為核心功能的PPI 網(wǎng)絡(luò)和以ZFAT 為中心的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中HSPB1 是與ZFAT 存在直接互作的3 個蛋白之一，在連接兩個網(wǎng)絡(luò)的同時也體現(xiàn)出ZFAT 具有參與固有免疫進(jìn)程的潛在可能，考慮到MxA 通常是受到固有免疫信號調(diào)控的下游效應(yīng)分子，推測ZFAT 可能對MxA 的表達(dá)或功能具有調(diào)控作用。

圖1 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果Fig. 1 Bioinformatical prediction for ZFAT influencing MxA expression

2.2 ZFAT siRNA-3 干擾后ZFAT 蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果ZFAT siRNA 和scrambled siRNA 干擾后的A549細(xì)胞經(jīng)37 ℃孵育36 h 后收獲細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 設(shè)為條件對照，通過qPCR 及western blot 試驗檢測ZFAT siRNA-1、ZFAT siRNA-2、ZFAT siRNA-3在A549 細(xì)胞上的干擾效果。qPCR 結(jié)果顯示，siRNA干擾A549細(xì)胞中ZFAT的2-ΔΔCt值相比對照細(xì)胞分別下調(diào)了2.97%、73.73%（p＜0.01）和91.33%（p＜0.01），其中ZFAT siRNA-3 干擾效果最佳（圖2）。Western blot結(jié)果顯示ZFAT 在ZFAT siRNA-3 干擾的A549 細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)抑制現(xiàn)象，ZFAT 條帶的相對灰度值相比對照下調(diào)了77.10%（圖3），表明通過ZFAT siRNA-3干擾A549細(xì)胞可以有效降低ZFAT的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性。

圖2 ZFAT 影響MxA 表達(dá)的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果Fig. 2 Bioinformatical prediction for ZFAT influencing MxA expression

圖3 ZFAT siRNA-3 干擾抑制ZFAT 蛋白表達(dá)Fig. 3 ZFAT protein expression inhibited by ZFAT siRNA-3 interference

2.3 下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)對流感病毒復(fù)制影響結(jié)果將流感病毒以MOI 0.001 感染ZFAT siRNA-3和scrambled siRNA干擾后的A549細(xì)胞，24 hpi、48 hpi分別收獲無血清培養(yǎng)基上清，通過接種雞胚測定EID50。結(jié)果顯示病毒滴度在24 hpi 和48 hpi 相比對照分別降低了2.61 倍（p＜0.05）和8.25 倍（p＜0.01）（圖4），表明ZFAT沉默可以顯著抑制流感病毒復(fù)制。

2.4 下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)對MxA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性影響結(jié)果將ZFAT siRNA-3 和scrambleds iRNA 干擾后的A549 細(xì)胞進(jìn)行流感病毒同步感染后6 hpi、12 hpi 分別收集細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為條件對照，通過qPCR和western blot 檢測ZFAT表達(dá)抑制在流感病毒感染前后對MxA 轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響。qPCR 結(jié)果顯示：在ZFAT 表達(dá)受到抑制的情況下，MxA 的2-ΔΔCt值 在 未 感 染、6 hpi 以 及12 hpi 的A549 細(xì)胞中相比對照分別上調(diào)了3.32 倍（p＜0.01）、1.68 倍（p＜0.01）以及1.42 倍（p＜0.01）（圖5），western blot 結(jié)果顯示，ZFAT 沉默后的MxA 蛋白表達(dá)在未感染、6 hpi 以及12 hpi 的A549 細(xì)胞中相比對照出現(xiàn)上調(diào)，MxA 條帶的相對灰度值分別上調(diào)了1.90 倍、1.15倍和1.19 倍（圖6）。表明抑制ZFAT 的表達(dá)可以顯著提升A549細(xì)胞中MxA的表達(dá)。

圖4 ZFAT 表達(dá)沉默抑制流感病毒的復(fù)制Fig. 4 Silencing of ZFAT expression leads to the inhibition of influenza virus replication

圖5 ZFAT siRNA-3 干擾在流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞中上調(diào)MxA 轉(zhuǎn)錄活性Fig. 5 MxA transcription activity in A549 cells upregulated by ZFAT siRNA-3 interference before or after influenza virus infection

圖6 ZFAT siRNA-3 干擾在流感病毒感染前后的A549 細(xì)胞中激活MxA 蛋白表達(dá)Fig. 6 MxA protein expression in A549 cells induced by ZFAT siRNA-3 before or after influenza virus infection

2.5 下調(diào)ZFAT 表達(dá)對干擾素及下游信號分子的轉(zhuǎn)錄活性影響結(jié)果將ZFAT siRNA-3 和scrambled siR?NA 干擾后的A549 細(xì)胞進(jìn)行流感病毒同步感染后分別收集6 hpi、12 hpi的細(xì)胞樣品，將scrambled siRNA 干擾設(shè)為對照，通過qPCR 檢驗ZFAT 的表達(dá)抑制在流感病毒感染前后對干擾素及下游信號因子轉(zhuǎn)錄活性的影響。qPCR 結(jié)果顯示，ZFAT 沉默使得A549 細(xì)胞在6 hpi 相比對照表現(xiàn)出I 型、III 干型擾素以及下游信號分子IRF3、IRF7、IRF9轉(zhuǎn)錄活性的顯著上調(diào)，其中IF?NA1、IFNB1 和IFNL1 的2-ΔΔCt值分別相比對照上升了2.02 倍、1.84 倍以及1.42 倍（p＜0.05）；IRF9、JAK1、STAT1 的2-ΔΔCt值在12 hpi 相比對照呈現(xiàn)顯著抑制，分別降低了0.52 倍、0.29 倍以及0.37 倍（p＜0.01）（圖7）。表明下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)可以廣泛影響干擾素及其干擾素受體下游信號分子的轉(zhuǎn)錄活性。

圖7 對干擾素及其下游信號分子轉(zhuǎn)錄活性的qPCR 檢測結(jié)果Fig. 7 Transcriptional activity of IFNs and downstream molecules detected by qPCR

3 討 論

流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制過程始終受到固有免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和抗病毒免疫機(jī)制的抑制[13-14]，病原-宿主共進(jìn)化使得病原不斷獲得有效的免疫逃逸機(jī)制來完成自身的復(fù)制[11]。相比于其他亞型的流感病毒，哺乳動物表達(dá)的MxA 對H5N1 禽流感病毒具有更強(qiáng)的特異性和敏感度，同時MxA 表達(dá)活性受到I 型、III 型干擾素的嚴(yán)密調(diào)控[15]，MxA 通過抑制病毒vRNP 復(fù)合體的入核進(jìn)程與聚合酶功能達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用[2]。宿主與病原長期斗爭的歷史使得雙方不斷發(fā)生適應(yīng)性的進(jìn)化，然而生物復(fù)雜的進(jìn)化歷史又使得任何適應(yīng)性背后的分子機(jī)制無法成為絕對獨立的單元，蛋白互作組學(xué)使得研究者有機(jī)會通過分子之間的共軛結(jié)合辨析一個復(fù)雜系統(tǒng)中特定因子可能發(fā)揮的作用[16]。

本實驗通過蛋白互作組預(yù)測ZFAT 可能參與了固有免疫因子MxA 的表達(dá)調(diào)控，而驗證實驗表明下調(diào)ZFAT 蛋白表達(dá)可以顯著提高M(jìn)xA 的轉(zhuǎn)錄與翻譯活性，并抑制H5N1 HPAIV 在A549 細(xì)胞中的復(fù)制，在細(xì)胞受到感染以前，下調(diào)ZFAT 表達(dá)促使A549 細(xì)胞提前進(jìn)入“抵抗?fàn)顟B(tài)”，所以當(dāng)感染發(fā)生時活躍的MxA 表達(dá)及其抗病毒效應(yīng)將持續(xù)抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制；H5N1 HPAIV感染后，下調(diào)ZFAT表達(dá)使得細(xì)胞在顯著提升干擾素及其下游信號分子轉(zhuǎn)錄活性的同時具有了更強(qiáng)的MxA表達(dá)活性與抗病毒能力。

MxA的表達(dá)激活是固有免疫信號通路末端效應(yīng)的一部分，正常細(xì)胞受到病毒感染以后誘導(dǎo)表達(dá)大量的I 型和III 型干擾素，α 干擾素受體發(fā)出的下游信號使得大量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）以二聚體磷酸化形式入核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，大幅提升干擾素應(yīng)答元件（ISRE）中包括MxA 在內(nèi)的所有效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄活性，以此使得細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗病毒能力[17-18]，固有免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大量I 型和III 型干擾素是誘導(dǎo)MxA 表達(dá)的必要條件[15]。然而本研究中ZFAT 沉默卻可以抑制未被流感病毒感染的A549 細(xì)胞中I 型干擾素的轉(zhuǎn)錄活性，效應(yīng)分子MxA 與干擾素表達(dá)活性在ZFAT 表達(dá)下調(diào)后表現(xiàn)出的分化提示ZFAT 可能在正常生理條件下參與了兩類固有免疫因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，即在維持I 型干擾素轉(zhuǎn)錄水平的同時，抑制III 型干擾素以及MxA 等干擾素效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)病毒感染發(fā)生時，能夠協(xié)助流感病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的NS1 蛋白等病毒因子可能會與ZFAT 通過相互作用強(qiáng)化對MxA 等固有免疫效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄抑制作用；而在ZFAT 表達(dá)下調(diào)的情況下，這一免疫逃逸機(jī)制受到抑制并使得MxA 的表達(dá)高于對照細(xì)胞，進(jìn)而影響流感病毒的復(fù)制，后續(xù)實驗可以驗證ZFAT 與H5N1 HPAIV 的相互作用并嘗試找到ZFAT 鋅指結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)合位點，進(jìn)一步證實ZFAT 在流感病毒感染進(jìn)程中發(fā)揮的作用，相信隨著固有免疫研究的深入，更多的真相將會被一步步揭示出來。