2 株雞源血清4 型禽腺病毒的分離鑒定及致病性研究

祝常椿，錢 焱，滿成連，劉 源，杜銀平，秦 濤，陳素娟，彭大新

（揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

心包積水-肝炎綜合征是由禽腺病毒（Fowl ade?novirus，F(xiàn)AdV）引起的一種傳染病，F(xiàn)AdV 可以感染雞、鴨[1]、鵝等多種家禽，既可水平傳播，又可垂直傳播。該病特征性剖檢變化主要表現(xiàn)為心包積液，肝臟腫大出血伴有壞死灶[2]，組織學研究表明病雞的肝細胞出現(xiàn)脂肪變性和壞死，肝細胞內(nèi)可見特征性的核內(nèi)包涵體[3]。該病最早于巴基斯坦的安卡拉地區(qū)爆發(fā)和流行，因此又稱安卡拉病、心包積水綜合征（HPS）[4]。隨后在北美洲、墨西哥、印度和韓國等地爆發(fā)和流行[5]。2014 年之前，HPS 在我國散發(fā)，2015 年開始在我國山東地區(qū)流行，逐漸蔓延至山西、湖北、黑龍江和江蘇等地，目前呈全國性流行趨勢，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的損失。該病多發(fā)于3 周齡～5 周齡的肉雞，死亡率在30%～70%，最高可達80%。隨著雞日齡的增大，該病的死亡率也隨著降低。

五鄰體蛋白（Penton）、六鄰體蛋白（Hexon）和纖維蛋白（Fiber），共同構成FAdV 的衣殼。Hexon 蛋白是禽I 群腺病毒的主要結構蛋白，攜帶主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇，Hexon 基因高度保守，能夠準確區(qū)分FAdV 的類型。每個五鄰體基底上伸出一條或兩條纖突即Fiber蛋白，與FAdV 的毒力和抗原性相關。Hexon 和Fi?ber2 基因編碼的氨基酸差異會影響FAdV 的致病性[6]。本研究對采集自江蘇養(yǎng)雞場疑似感染FAdV 的病雞病料樣品進行病原的分離與鑒定，對病毒株的致病性進行初步分析，為進一步探究FAdV 的致病性差異和毒力演變提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及主要實驗材料病死雞來源于江蘇東臺13 個不同養(yǎng)雞場，病雞精神沉郁，排黃綠色稀糞，對病死雞剖檢可見肝臟腫脹、出血、心包內(nèi)有膠凍樣積液，肺臟水腫、瘀血，腎臟腫大出血。采集病死雞的心臟、肝臟和脾臟等病變組織樣品，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雞肝癌細胞（LMH）由本實驗室保存；SPF 雞胚購自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司，由本實驗室孵育，飼養(yǎng)至4 周齡。Mix 購自Vazyme 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司；Alu I 限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；

1.2 引物的設計與合成參考GenBank中登錄的血清4型FAdV（FAdV-4）代表株HB1510株（KU587519.1）的Hexon 和Fiber2 全基因序列，應用Premier 5.0 設計Hexon 基因和Fiber2 全基因的引物：Hexon-F：5'-ATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3'/Hexon-R：5'-GCGTT GCCTGTGGCGAAA-3'（2 814 bp），F(xiàn)iber2-F：5'-CG GATATCAATATGCTCCGGGCCCCTAA-3'/Fiber2-R：5'-AGAATGCGGCCGCTATTTTACGGGAGGGAGGCCG-3'（1 440 bp）。鑒定引物參照王穎[7]等的引物，F(xiàn)：5'-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3'/R： 5'-TGGC GAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3'（500 bp）。引物合成和測序由南京擎科新業(yè)技術有限公司完成。

1.3 病料樣品的PCR 檢測將采集的13 份病料組織無菌剪碎置于5 mL的研磨管，分別與病毒保存液以1∶4 的比例混合；用生物樣品勻質儀以6 500 r/min 的速度勻漿、研磨；將研磨管放置于-70 ℃及37 ℃水浴反復凍融3 次后以8 000 r/min 離心10 min，分別取上清500 μL，采用蛋白酶K/氯仿抽提法提取樣品DNA，然后用核酸蛋白檢測儀測定DNA 濃度和純度后-80 ℃保存?zhèn)溆?。以提取的DNA 為模板，使用鑒定引物對樣品分別進行PCR 鑒定。

1.4 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定參照文獻方法[7]，將上述經(jīng)PCR 鑒定為陽性的病料樣品上清液100 μL 接種到LMH 細胞，每天觀察細胞狀態(tài)，待其出現(xiàn)明顯的病變后收集病毒液。待病毒液形成穩(wěn)定的細胞病變后繼續(xù)傳5 代，使用1.2 合成的鑒定引物對收集的病毒液進行PCR 鑒定并對得到的病毒液進行TCID50的測定。

1.5 分離病毒的Hexon基因和Fiber2基因擴增及序列分析提取1.4 中鑒定為FAdV 陽性細胞上清液的DNA 為模板，分別采用引物Hexon-F/R 和Fiber2-F/R PCR 擴增FAdV Hexon 和Fiber2 基因。PCR 反應程序：95 ℃5 min；95 ℃45 s、57 ℃45 s、72 ℃2 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，并利用MegAlign 和MEGA7.0 軟件對Hexon 基因進行核苷酸同源性及遺傳進化分析，同時對Fiber2 基因進行Alu 酶譜分析。

1.6 SPF 雞的回歸試驗將30 只4 周齡的SPF 雞隨機分成3 組，每組10 只。其中兩組分別接種鑒定為FAdV-4 的2 株病毒，每只雞注射0.1 mL 含有106TCID50的病毒液；第3 組以相同途徑和劑量接種無菌PBS 作為陰性對照。在相同條件下隔離飼養(yǎng)，接種后每12 h 觀察一次，連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計雞的發(fā)病和死亡情況。解剖病死雞，觀察剖檢病理變化，同時采集病死雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織，用4%甲醛溶液固定，48 h 后，制作切片觀察組織病變情況，同時將采集的組織按照1.4方法進行分離培養(yǎng)與鑒定。

2 結果與討論

2.1 病料樣品的PCR 鑒定結果以Hexon 基因鑒定引物對13 份病料樣品提取的DNA 進行PCR 擴增，結果顯示9 份在約500 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預期大小一致（圖略），初步判斷這9 份病料樣品為FAdV-4 陽性。

2.2 病毒的分離與鑒定結果將9 份陽性病料樣品研磨液接種單層的LMH 細胞，2 份出現(xiàn)了典型的細胞病變，細胞皺縮，逐漸變圓，折光性增強，細胞間距增大，突觸消失有的多個細胞聚集在一起，隨后成簇或成葡萄串狀。樣品1 在接種細胞60 h 后產(chǎn)生病變，樣品2 在接種細胞48 h 后產(chǎn)生病變。病毒連續(xù)穩(wěn)定傳代，將第5 代細胞上清液用鑒定引物進行PCR 鑒定為FAdV-4 核酸陽性。兩個樣品分別命名為DT 和AN。2 株病毒分別接種LMH 細胞，收獲病毒，按照Reed-Muench 法計算得出DT 和AN 的效價分別為106.12TCID50/0.1 mL和106.78TCID50/0.1 mL。

2.3 分離病毒的Hexon基因和Fiber2基因PCR 擴增及序列分析提取DT 和AN 株病毒的DNA，分別使用Hexon-F/R 引物和Fiber2-F/R 引物擴增Hexon 基因和Fiber2基因，結果顯示，2株病毒在約2 800 bp處均出現(xiàn)Hexon 基因目的條帶（圖1A），在約1 400 bp 處均出現(xiàn)Fiber2 基因目的條帶（圖1B），條帶與預期大小一致。

圖1 Hexon 和Fiber2 基因全長的PCR 擴增Fig. 1 PCR amplification of the full-length Hexon and Fiber2 genes

序列測定顯示兩株分離株的Hexon 基因全長為2 814 bp，編碼937 個氨基酸。通過MegAlign 軟件比對顯示，兩株分離株Hexon 核苷酸的同源性為99.9%，與I 群FAdV-4 核苷酸同源性為98.6%～100%，其中DT 和AN 株與中國病毒株（SDNY1-15、PDS株）的親緣關系最近。Hexon 核苷酸同源性分別為99.9%和100%。與印度分離株（PK-01）Hexon 核苷酸同源性為99.8%，與韓國（Kr-Changnyeong）和俄羅斯（Krasnodar）分離株Hexon 核苷酸同源性為98.6%～99.1%。遺傳進化顯示，分離株與FAdV-4 親緣關系最為接近，屬于同一個分支，與其他血清型相對較遠，進一步確定DT 和AN 株為I 群基因C 型FAdV-4（圖2）?；贖exon 基因編碼的氨基酸遺傳進化分析顯示，DT 株與其他病毒株氨基酸同源性為98.3%～99.9%，AN 株與其他病毒株氨基酸同源性為98.4%～100%。兩株分離病毒與印度分離株的氨基酸同源性最高，與韓國病毒株相比，兩株病毒第189 位氨基酸由Ⅰ突變成R，與韓國、俄羅斯病毒株相比兩株病毒第196 位氨基酸由E 突變成Q。

Masaji 等對Fiber2 基因進行Alu 酶切分析，可以區(qū)分致病性FAdV-4 和非致病性FAdV-4[8]。Fiber2基因全長1 400 bp，編碼479 個氨基酸。用Alu 酶譜分析可將兩株分離株Fiber2 基因切成1 202 bp、142 bp、102 bp 和51 bp 大小的片段，與致病性病毒株一致?；谠摶蚓幋a的氨基酸分析顯示，兩株分離株在aa11～aa16 位均為ENGKPE，與國內(nèi)致病性病毒HB1510 株（KU587519.1）相同，與非致病性病毒株ON1（GU188428.1）、KR5（HE608152.1）相比有不同程度的插入和突變。與致病性和非致病性的突變位點相比，分離株Fiber2 基因編碼的氨基酸位點具有致病性病毒株的特點，但與HB1510 株相比，AN 株也在179 位由I 突變?yōu)門，DT 株在209 位由N突變?yōu)镾、385 位由M 突變?yōu)镮。這些突變位點是否與兩株分離病毒的毒力差異有關需進一步研究。

圖2 Hexon 基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Hexon genes

2.4 動物回歸試驗結果接種DT 和AN 株病毒組的SPF 雞在經(jīng)肌肉注射后第2 d 開始出現(xiàn)食欲不振，精神萎靡，被毛雜亂，扎堆等異常癥狀，隨后在第4 d兩組SPF 雞分別開始出現(xiàn)了死亡。解剖病死雞，兩組雞心臟均出現(xiàn)心包積液，AN 組病死雞較DT 組病死雞嚴重一些；兩組肝臟均有腫大出血，顏色變黃褐色；肺部有少量的瘀血；脾臟腫大出血；腎臟腫大出血，腦組織樹枝狀充血。7 d 之后感染組雞均沒有再出現(xiàn)死亡。DT 組的死亡率為50%，AN 組死亡率為90%，陰性對照組的SPF 雞表現(xiàn)正常。將病料樣品研磨液接種單層的LMH 細胞，可以出現(xiàn)與2.2 相同的典型細胞病變，用鑒定引物對提取的細胞樣品DNA 進行PCR 鑒定，結果在約500 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預期大小一致（圖略）。

病理組織學結果顯示，AN 組較DT 組雞心臟內(nèi)出現(xiàn)少量中性粒細胞浸潤。兩組均可見肝臟局灶性壞死，肝細胞脂肪變性，核內(nèi)可見數(shù)量較多的嗜堿性包涵體；脾臟內(nèi)毛細血管怒張，充血，脾竇內(nèi)巨噬細胞數(shù)量增多；肺臟間質內(nèi)巨噬細胞及少量異嗜性粒細胞浸潤；腎臟皮質部腎小管之間有數(shù)量不等的淋巴細胞和少量異嗜性粒細胞浸潤，甚至個別腎小管上皮壞死，管腔內(nèi)可見蛋白尿管型。腦未見明顯病變（圖3）。

圖3 FAdV-4 感染雞的組織病理學變化Fig. 3 Histopathologic changes of FAdV-4 infected chickens

Sun 等通過肌肉注射和口服兩種方式，將禽腺病毒感染10 日齡和20 日齡的SPF 雞，解剖結果均出現(xiàn)典型的心包積液和肝炎[9]。本研究動物實驗表明分離株均能致死4 周齡SPF 雞，死亡雞剖檢病變主要集中在肝臟和心臟，尤其是感染后的第5 d 病變最嚴重。心包積液是主要的病變之一，可能是急性炎癥反應導致[10]。根據(jù)病理變化并結合文獻資料報道[11]，進一步證明引起SPF 雞死亡的病原是FAdV-4。病理組織學變化為肝細胞核內(nèi)可見嗜堿性包涵體，含有包涵體的肝細胞核明顯大于正常肝細胞核，肺臟間質內(nèi)存在巨噬細胞及少量異嗜性粒細胞浸潤，與Bouquet 的研究結果一致[12]。除了肝臟、心臟有典型的病變之外，在脾臟、腎臟和肺臟也有不同程度的病變，這可能和病毒可在不同器官的淋巴組織中分布有關[13]。

本實驗分離鑒定出兩株I 群FAdV-4，發(fā)現(xiàn)了兩株病毒株致病力存在一定差異，為進一步探究FAdV 毒力演變以及致病機理奠定了基礎。