雙刺參膠囊總皂苷的提取、含量測定及體外活性

邸松，戴鸝瑩，鐘方麗，王曉林，鄭郡，崔澤偉

吉林化工學院化學與制藥工程學院（吉林 132022）

雙刺參膠囊由刺玫果、刺五加及人參的醇提物經(jīng)干燥粉碎后加入少量淀粉制成。刺玫果屬薔薇科植物成熟果實[1]、人參[2]及刺五加[3]均為五加科植物。三者在東北地區(qū)分布廣泛，且均具有較為豐富的化學成分，如皂苷、黃酮、氨基酸等[4-6]。

由于現(xiàn)今社會發(fā)展迅速，繁忙的學習、工作及生活壓力使人長期處于疲勞性亞健康狀態(tài)。該狀態(tài)是一種處于健康和疾病之間的第三狀態(tài)[7]，其表現(xiàn)大體可以分為軀體性[8]和精神性[9]兩大類。長時間處于虛弱、疲勞等亞健康狀態(tài)下，會發(fā)展成為其他疾病[10]。中醫(yī)學上對于疲勞的論述最早出現(xiàn)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》[11]，經(jīng)后世醫(yī)者補充得以完善。中醫(yī)講氣血耗損所引起的“虛勞”即為疲勞[12]，補中益氣、固本培元的中藥材如人參[13]、黨參[14]、刺五加[15]、黃芪[16]等，可以在一定程度上調(diào)理疲勞。近年來，受中國飲食、醫(yī)藥文化的影響，藥食同源類功能性保健食品受到越來越多人的青睞[17]。經(jīng)文獻查閱，刺玫果[18]、刺五加[19]及人參[20]提取物中的皂苷成分具有較好的抗疲勞作用，且三者均為藥食同源類中藥材。課題組選用三者，按照一定比例混合后進行提取、干燥、粉碎、制粒、裝囊，制備抗疲勞保健食品雙刺參膠囊。

研究建立了雙刺參膠囊中總皂苷含量的檢測方法，并以總皂苷提取率作為指標，采用正交試驗的方法優(yōu)選出提取的最佳工藝，為雙刺參膠囊的進一步研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

齊墩果酸（純度98.33%，成都曼思特生物科技有限公司）；香草醛（天津市光復精細化工研究）所。無水乙醇及其余分析純試劑（天津大茂化學試劑廠）。

1.2 儀器與設備

真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；多功能振蕩器（金壇市華城開元儀器廠）；紫外分光光度計（TU-1950型，北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 供試品溶液

雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液的制備：取適量雙刺參膠囊內(nèi)容物，研磨粉碎，精密稱取2.0 g，置于燒瓶中，加20 mL甲醇，超聲處理（功率200 W，頻率53 kHz）30 min，放冷后過濾，用2 mL甲醇洗滌濾渣2次，將濾液及洗滌液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度線，搖勻后取1.3 mL再次定容至25 mL容量瓶中，即得。

提取物供試品溶液的制備：稱取2 g干燥至恒質(zhì)量的雙刺參提取物，精密稱定。加入適量甲醇，經(jīng)30 min超聲處理（功率200 W，頻率53 kHz）后過濾，用少量甲醇洗滌2次后定容至25 mL容量瓶中，取0.5 mL上述溶液定容至10 mL容量瓶中，即得。

1.3.1.2 對照品溶液

取10 mg齊墩果酸，精密稱定，加入甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 測定方法的選擇

1.3.2.1 香草醛-冰醋酸-濃硫酸顯色法（A法）

參照文獻[21]。吸取0.4 mL供試品溶液，于80 ℃水浴蒸干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液溶解后加入0.8 mL 80%硫酸，于60 ℃水浴振蕩15 min，振蕩結(jié)束后放于冰水浴中冷卻10 min，加入10 mL冰醋酸室溫靜置15 min。

1.3.2.2 香草酸-冰醋酸-高氯酸顯色法（B法）[22]

吸取0.4 mL供試品溶液，于80 ℃水浴蒸干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液溶解后加入0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴振蕩15 min，振蕩結(jié)束后放于冰水浴中冷卻10 min，加入10 mL冰醋酸室溫靜置15 min。

1.3.2.3 香草醛-乙醇-硫酸顯色法（C法）

參照文獻[23]，并進行調(diào)整。吸取0.4 mL供試品溶液，于80 ℃水浴蒸干溶劑，加入0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液溶解后加入5 mL 72%硫酸，混合均勻于60℃水浴振蕩15 min，振蕩結(jié)束后放于冰水浴中冷卻10 min，在室溫下靜置15 min。

采用上述3種方法分別對雙刺參提取物、雙刺參膠囊內(nèi)容物、齊墩果酸、淀粉進行顯色，將顯色后的樣品、未顯色的雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液以及對應顯色劑在200～800 nm進行全波長掃描，通過對比最大吸收峰的波長及峰型確定檢測方法。

1.3.3 方法學考察

1.3.3.1 穩(wěn)定性試驗

吸取雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液，分別考察其顯色前360 min內(nèi)及顯色后90 min內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.3.3.2 儀器精密度試驗

吸取6份同一雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液，按照相應方法進行顯色，在同一臺紫外分光光度計下測定吸光度，記錄并計算測定值的RSD值，應小于3%。

1.3.3.3 中間精密度試驗

吸取6份同一雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液進行顯色，使用2臺紫外分光光度計對顯色后的供試品溶液進行吸光度測定，計算其RSD值，應小于3%。

1.3.3.4 重現(xiàn)性試驗

取同一批次雙刺參膠囊內(nèi)容物，按照雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液制備方法制備6份溶液，按照檢測方法進行顯色后測定吸光度，吸光度的RSD值應小于3%。

1.3.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取9份已知總皂苷含量的雙刺參膠囊內(nèi)容物，每份1.0 g。每3份為1組，分別加入總皂苷含量的50%，100%和150%的齊墩果酸對照品，按照選定的顯色方法進行顯色處理，測定吸光度并計算加樣回收率，RSD值應小于3%。

1.3.4 標準曲線的繪制

精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mL對照品溶液進行顯色處理，顯色后測定吸光度。以齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 雙刺參膠囊內(nèi)容物總皂苷含量的測定

取若干3個批次的雙刺參膠囊，取內(nèi)容物按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在顯色方法下顯色后測定吸光度，代入標準曲線方程，計算雙刺參膠囊中總皂苷的含量。

1.4 正交試驗優(yōu)選總皂苷提取工藝

1.4.1 正交試驗

在預試驗中，分別對總皂苷的提取溶劑種類乙醇體積分數(shù)、溶劑用量料液比（g/mL）、提取溫度及提取時間等可能影響總皂苷提取的因素進行單因素試驗考察，最終選擇影響較大的3個因素：提取溶劑種類乙醇體積分數(shù)（A）、溶劑用量料液比（B）及提取時間（C），以總皂苷的提取率作為指標，進行三因素三水平正交試驗，正交因素與水平見表1。

表1 正交因素水平表

1.4.2 驗證試驗

稱取10.5 g過孔徑0.180 mm篩的人參粉、21 g刺五加粉及14 g刺玫果粉，混合，共3份，每份均采用正交試驗的最優(yōu)工藝提取2次，合并濾液，減壓濃縮后置于真空干燥箱60 ℃干燥至恒質(zhì)量。按照雙刺參提取物供試品溶液制備方法進行溶液制備，經(jīng)顯色，測定吸光度，計算總皂苷提取率。

1.5 提取物體外活性研究

1.5.1 清除ABTS自由基陽離子能力

參考文獻[24]配制ABTS自由基陽離子工作液。取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的各種供試品溶液，與3.9 mL ABTS自由基陽離子工作液混合，于23 ℃避光放置6 min，于734 nm測定吸光度（Ay），同法操作，將供試品溶液更換為蒸餾水測得Ak，按式（1）計算自由基清除率，并計算其IC50值。通過對比IC50，比較雙刺參提取物與VC體外抗氧化活性。

1.5.2 抗脂質(zhì)過氧化能力

以抑制率為指標，參照文獻[25]的試驗方法，對VC、總皂苷提取物的抗卵磷脂脂質(zhì)過氧化作用進行測試。在具塞試管中依次加入1 mL卵磷脂溶液、1 mL 0.4 mmol/L FeSO4溶液及1 mL供試品溶液混勻。于37℃避光水浴60 min，加入2 mL TCA-TBA-HCl混合液，于90～100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，以5 000 r/min離心10 min，取上清液在波長535 nm處測定吸光度As。空白管以1 mL重蒸水代替1 mL供試品溶液測得Ac，按式（2）計算抗脂質(zhì)過氧化抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 總皂苷含量測定方法的試驗結(jié)果

2.1.1 總皂苷測定方法

A法雙刺參提取物與膠囊內(nèi)容物在530 nm附近存在吸收峰，齊墩果酸對照品在550 nm處有最大吸收峰。目標峰波長相差較大，且提取物及內(nèi)容物在470 nm處也存在吸收峰，專屬性較差。

B法雙刺參提取物與膠囊內(nèi)容物、齊墩果酸三者的吸收峰均在545 nm附近，但峰型未呈現(xiàn)較為完美的饅頭峰，且各樣品的最大吸收峰偏差較大。

C法雙刺參提取物，膠囊內(nèi)容物及齊墩果酸對照品的最大吸收峰均在540 nm附近，且相應空白試劑在該處無吸收峰，故該法適用于雙刺參膠囊中總皂苷的含量測定。在C顯色方法下各供試品全波長掃描圖見圖1。

圖1 C顯色方法下供試品全波長掃描譜圖

2.1.2 方法學考察

2.1.2.1 穩(wěn)定性

顯色前雙刺參膠囊供試品溶液在0，30，60，120，180，240，300和360 min的吸光度分別為0.524，0.536，0.549，0.545，0.543，0.542，0.543和0.563，均在0.544±0.02范圍內(nèi)，顯色后其在0，15，30，45，60，75和90 min內(nèi)吸光度分別為0.587，0.571，0.573，0.572，0.563，0.566和0.579，均在0.575±0.01范圍內(nèi)，顯色前后的RSD值分別為2.03%和1.40%，均小于3%，說明雙刺參膠囊供試品溶液在顯色前360 min內(nèi)、顯色后90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2.2 儀器精密度

6份雙刺參膠囊內(nèi)容物供試品溶液的吸光度分別為0.592，0.587，0.584，0.582，0.584和0.583，RSD為0.63%，說明儀器精密度良好。

2.1.2.3 中間精密度

由同一名實驗員在相同的試驗條件下，分別在2臺紫外分光光度計上測定6份雙刺參膠囊供試品溶液的吸光度，分別為0.579，0.591，0.577，0.608，0.605，0.588和0.584，0.589，0.583，0.579，0.596，0.581。通過對比，2臺分光光度計的測定結(jié)果相差不大，且RSD值為1.73%，表明此方法的中間精密度良好。

2.1.2.4 重現(xiàn)性

6份雙刺參膠囊供試品溶液顯色后的吸光度分別為0.555，0.549，0.551，0.549，0.562和0.550。經(jīng)計算，RSD值為0.88%，小于3%，說明該方法重現(xiàn)性良好，可用于測定膠囊中總皂苷的含量。

2.1.2.5 加樣回收率

稱取9份1 g雙刺參膠囊內(nèi)容物，精密稱定，加入約已知總皂苷含量50%，100%和150%的齊墩果酸，按含量測定方法制備供試品溶液并進行顯色處理，在540 nm處用紫外分光光度儀進行吸光度測定，試驗結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.3 標準曲線的制備

以齊墩果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=23.01X+0.057 7，R2=0.999 4，表明在4.51～31.56 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.4 雙刺參膠囊總皂苷含量測定結(jié)果

將測得的吸光度代入到標準曲線中進行計算，結(jié)果得到3個批次的雙刺參膠囊總皂苷平均含量，分別為13.28，13.31和13.36 g/100 g。

2.2 優(yōu)選總皂苷提取工藝的試驗結(jié)果

2.2.1 正交試驗結(jié)果與方差分析

結(jié)合表3可以看出，各因素對提取物中總皂苷含量影響最大的是因素C，即提取時間，其次為提取溶劑A，溶劑用量B的影響較小，因此選擇提取工藝A3B1C2，即為料液比為1∶5（g/mL），乙醇體積分數(shù)為90%，提取時間為1 h。

表3 正交試驗結(jié)果分析表

2.2.2 工藝驗證試驗結(jié)果

采用最佳工藝平行提取3次，總皂苷提取率分別為28.82，29.25和28.46 mg/g，且RSD值為1.08%，說明該工藝合理穩(wěn)定，可以用于雙刺參膠囊總皂苷的提取，且提取效率較高。

2.3 體外抗氧化試驗結(jié)果

雙刺參提取物與VC均能有效地清除ABTS自由基陽離子，抑制脂質(zhì)的過氧化作用。通過對比兩者清除ABTS自由基陽離子能力及抗脂質(zhì)過氧化能力的半數(shù)抑制濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙刺參提取物的抗氧化能力弱于VC，試驗結(jié)果見表4。

表4 體外抗氧化試驗結(jié)果

3 結(jié)論

研究采用香草醛-冰醋酸-濃硫酸顯色法、香草酸-冰醋酸-高氯酸顯色法、香草醛-乙醇-硫酸顯色法三種顯色方法，對供試品溶液進行顯色，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，經(jīng)香草醛-乙醇-硫酸顯色法，各供試品溶液在540 nm處均有最大吸收，且專屬性較高、穩(wěn)定性較好，可作為雙刺參膠囊總皂苷的含量測定方法。通過正交試驗優(yōu)選得到雙刺參總皂苷的最佳提取工藝，即5倍量90%乙醇，于80 ℃水浴提取2次，每次1 h，總皂苷平均提取率為28.84 g/g，該方法簡單快捷，總皂苷提取率較高。體外抗氧化試驗結(jié)果顯示，雙刺參提取物具有一定的抗氧化能力。此次研究不僅為雙刺參膠囊的進一步研究提供了基礎數(shù)據(jù)，同時也為刺玫果、刺五加及人參進一步的開發(fā)利用提供了試驗基礎。