PKM2對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)化的影響

周 闖，陸 旭，宋盛平，于 龍，葉建文，翟文龍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，河南鄭州 450052)

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是消化系統(tǒng)中的一種相對(duì)少見但具高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，具有發(fā)生隱匿、高侵襲性、預(yù)后差等特點(diǎn)[1-3]。丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)已被報(bào)道參與調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的無(wú)氧糖酵解，并且已被證實(shí)和多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)[4]。然而，關(guān)于PKM2在肝內(nèi)膽管癌中的研究相對(duì)較少，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討PKM2對(duì)ICC細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)化的影響及其具體的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2016年1月-2017年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科行肝內(nèi)膽管癌根治手術(shù)的患者15例，其中男性9例，女性6例；年齡43～67歲。所有患者術(shù)后標(biāo)本經(jīng)本院2位病理醫(yī)師確診均為膽管細(xì)胞癌，另取配對(duì)癌旁組織。收取15例血管瘤患者的瘤旁組織，作為健康對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞株CCLP-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，PrimeScript RT Reagent Kit Perfect Real-time反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystem公司)，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectaminem 2000(Invitrogen公司)。一抗：PKM2(Santa Cruz公司)、E-cadherin(Santa Cruz公司)、ZO-1(Santa Cruz公司)、N-cadherin(Santa Cruz公司)、GAPDH(Santa Cruz公司)，β-catenin(Epitomics公司)、c-Myc(Epitomics公司)和cyclin D1(Epitomics公司)。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色(SABC法) 標(biāo)本固定、包埋、切片后65 ℃烤30 min，依次脫蠟水化，雙蒸水沖洗3次后用30 mL/L的雙氧水浸泡15 min，0.01 mol/L的PBS緩沖液沖洗3次后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，水浴煮沸15 min后冷卻，PBS緩沖液沖洗3次后滴加5% BSA室溫下孵育20 min，切片滴加一抗后4 ℃冰箱中過(guò)夜；PBS緩沖液沖洗3次后滴加二抗并在37 ℃的恒溫孵育箱中孵育20 min，PBS緩沖液沖3次后滴加SABC液并在37 ℃恒溫箱中進(jìn)行孵育20 min。PBS緩沖液沖洗3次，DAB染色、蘇木素液復(fù)染、脫水、封片、光鏡觀察。

1.3.2慢病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 構(gòu)建人PKM2慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體。PKM2序列通過(guò)引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)，然后將收獲的DNA插入表達(dá)載體pWPI-GFP。包裝載體(pMD2.G and pSPAX2)、pWPI-PKM2-GFP和空載體以Lipofectaminem 2000為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h，更換培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)48 h后收集，通過(guò)熒光顯微鏡觀察其熒光效率?？瞻讓?duì)照為Mock組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒為Control組，轉(zhuǎn)染pWPI-PKM2-GFP為shPKM2組。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系中PKM2 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑操作說(shuō)明提取總RNA；隨后按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；將Taqman熒光標(biāo)記探針(5 μmol/L)混合液、0.5 μL擴(kuò)增引物(18 μmol/L)與5 μL含Taq酶的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)定量檢測(cè)混合液混合，加入4.5 μL cDNA按照Taqman試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)選取TBP(TATA box binding protein)為內(nèi)參照基因。

1.3.4Western blotting檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后及對(duì)照細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)PKM2、E-cadherin、ZO-1、β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白含量。按Western blotting 試劑盒操作，將蛋白樣本加入上樣緩沖液后于95 ℃水浴變性10 min，加入120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠分離目的條帶，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后用對(duì)應(yīng)的二抗孵育、洗膜、顯影。

1.3.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基將其充分混勻成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞將其接種至6孔培養(yǎng)皿中。1周后終止培養(yǎng)；棄上清，使用PBS仔細(xì)浸洗2次；加純甲醇或1∶3醋酸/甲醇5 mL，固定10 min；應(yīng)用染色液20 min，洗去染色液待其干燥后將平皿倒置并疊加1張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 使用無(wú)血清預(yù)冷的DMEM，按8∶1的比例稀釋Matrigel；將80 μL稀釋過(guò)的Matrigel加入Transwell小室上室；37 ℃孵育3～5 h待其成凝膠狀；使用胰蛋白酶消化細(xì)胞；用不含血清的DMEM培養(yǎng)液充分混勻細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)使其密度為2×106個(gè)/mL；用預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌Matrigel；在Matrigel上加入100 μL細(xì)胞懸液；下室加入600 μL含有100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液DMEM；將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃孵育48 h；用棉簽擦凈微孔濾膜上室面未侵襲的細(xì)胞，Giemsa染液染色。200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中PKM2的表達(dá)情況PKM2在mRNA水平的表達(dá)在ICC組織中相比癌旁及正常肝組織明顯增加(圖1B、圖1C)；在蛋白水平的表達(dá)具有相同的趨勢(shì)。在15例ICC組織及癌旁組織中，PKM2在胞核胞質(zhì)均有表達(dá)(圖1A)，癌組織中11例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.3%；癌旁組織中3例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20.0%，其陽(yáng)性表達(dá)存在差異性(P<0.05)。

2.2 PKM2 RNAi對(duì)ICC細(xì)胞克隆形成的影響首先測(cè)定PKM2的轉(zhuǎn)染效率：收取CCLP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后及對(duì)照細(xì)胞，提取總蛋白Western blotting結(jié)果示轉(zhuǎn)染組PKM2明顯下調(diào) (圖2A)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示pWPI-PKM2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成數(shù)(152±9.63)明顯低于空白組(351.5±17.6)及對(duì)照組(333.1±21.3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

圖2 PKM2 RNAi對(duì)膽管癌細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 PKM2 RNAi對(duì)ICC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響轉(zhuǎn)染pWPI-PKM2的膽管癌細(xì)胞48 h后，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組CCLP-1細(xì)胞的侵襲能力明顯低于空載Mock及對(duì)照組Control組，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)分別為(96±7.1)、(185.5±11.3)、(197.1±17.2)(P<0.05，圖3)。

2.4 PKM2 RNAi 對(duì)ICC EMT相關(guān)生物學(xué)特性的影響體外實(shí)驗(yàn)顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株CCLP-1后表現(xiàn)為間質(zhì)表型N-cadherin下調(diào)和上皮表型E-cadherin、ZO-1的表達(dá)上調(diào)。與對(duì)照組相比，PKM2明顯降低β-catenin、c-Myc和cyclin D1細(xì)胞系的表達(dá)水平(圖4)。

3 討 論

丙酮酸激酶作為一個(gè)在腫瘤糖代謝和惡性進(jìn)展過(guò)程中表達(dá)量較高的代謝基因之一，其二聚體形式的亞型在腫瘤細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)，因此也被稱為腫瘤型PKM2，并且在四聚體和二聚體形式之間的轉(zhuǎn)換賦予了它在腫瘤代謝和發(fā)生發(fā)展中的雙重作用，對(duì)細(xì)胞的代謝、增殖及侵襲等均發(fā)揮了極其重要的作用[5]。因此，對(duì)腫瘤組織中丙酮酸激酶的表達(dá)水平以及這種表達(dá)改變的意義進(jìn)行細(xì)致的研究，對(duì)于了解腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)、探尋腫瘤治療的新靶點(diǎn)具有重要意義的。本研究發(fā)現(xiàn)，PKM2表達(dá)在ICC組織中RNA及蛋白水平都明顯增加。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PKM2促進(jìn)了EMT的發(fā)生，并且通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)ICC細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，PKM2可能是ICC治療的一個(gè)新的生物標(biāo)志物靶點(diǎn)。

圖3 PKM2 RNAi對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

圖4 PKM2 RNAi對(duì)EMT及Wnt信號(hào)通路的影響

腫瘤糖代謝的異常主要表現(xiàn)為有氧狀態(tài)下的葡萄糖酵解，即有氧糖酵解。近年來(lái)，其作為多種惡性腫瘤的必要組成部分或侵襲強(qiáng)的特征已被許多學(xué)者所接受[6-8]，然而，癌細(xì)胞是怎么建立這種特殊的Warburg效應(yīng)的機(jī)制尚不明確。調(diào)節(jié)葡萄糖酵解的酶類有很多，而研究發(fā)現(xiàn)腫瘤當(dāng)中幾乎所有的酶類均發(fā)生不同程度的表達(dá)和功能上的改變[9-10]。其中丙酮酸激酶作為糖酵解途徑重要的限速酶，它在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)亞型的改變不僅賦予了細(xì)胞特殊的葡萄糖代謝表型，而且使腫瘤細(xì)胞獲得了生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)及侵襲轉(zhuǎn)移的能力的增強(qiáng)[8, 11-12]。丙酮酸激酶有4種不同的亞型，即PKL、PKR、PKM1和PKM2，它們分別在不同的細(xì)胞和組織中表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤的形成及發(fā)展過(guò)程中，丙酮酸激酶亞型的表達(dá)均逐漸發(fā)揮組織特異性，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)橐员磉_(dá)M2亞型為主[13-15]。然而，有關(guān)PKM2在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的作用機(jī)制研究還很少。本研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在其中高表達(dá)，不僅在ICC組織樣本中的強(qiáng)陽(yáng)性染色，而且RNA水平也較配對(duì)癌旁組織及正常肝組織明顯升高?；诖耍琍KM2可作為一個(gè)新型的腫瘤標(biāo)志物，在ICC的診斷及監(jiān)測(cè)方面具有一定的臨床價(jià)值。

上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞極性改變、形成新的細(xì)胞-基質(zhì)黏附等，發(fā)生EMT的細(xì)胞更容易遷移和侵襲，并且通常被認(rèn)為是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的前提。雖然有研究證實(shí)EMT參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]，但目前對(duì)于PKM2在ICC中生物學(xué)特性及其具體的作用機(jī)制了解的尚不夠深入。本研究進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，運(yùn)用重組慢病毒RNAi干擾技術(shù)抑制PKM2的表達(dá)，CCLP-1在被干擾后細(xì)胞上皮間質(zhì)表型發(fā)生了明顯的變化。PKM2低表達(dá)組細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)記物(N-cadherin)明顯下調(diào)，而上皮標(biāo)記(E-cadherin、ZO-1)表達(dá)則明顯升高，表明PKM2可能通過(guò)EMT促進(jìn)膽管癌轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin通路在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和EMT等方面起著重要作用；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，其異常激活通路參與了PKM2調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲作用[18]。PKM2的缺失能通過(guò)β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活谷氨酰胺的代謝。miR-200a介導(dǎo)的β-catenin信號(hào)通路影響PKM2的表達(dá)，為了證實(shí)PKM2是否參與調(diào)節(jié)Wnt/β通路的活性，本研究檢測(cè)了PKM2基因干擾后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，PKM2明顯降低了β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)均表明，Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在PKM2誘導(dǎo)ICC細(xì)胞侵襲方面具有重要的作用，通過(guò)EMT途徑參與ICC腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究證實(shí)了PKM2在人ICC組織中高表達(dá)，同時(shí)PKM2促進(jìn)ICC細(xì)胞增殖并通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑誘導(dǎo)EMT進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞侵襲增強(qiáng)。