高脂飲食對ApoE敲除小鼠炎癥反應(yīng)及外周血單核細(xì)胞斑塊內(nèi)遷徙的影響

馬 寧，魏琳琳，刁騰月，趙 璇,2，王曉梅,3，李 可

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710004；2. 商洛市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西商洛 726000；3. 漢中市洋縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西漢中 723300)

動脈粥樣硬化是一種威脅中老年人健康的最常見的心血管疾病，是引起如心腦梗死、中風(fēng)、主動脈瘤等各種急慢性心血管意外的首要病因[1]，由其引發(fā)的心腦血管病死亡是全球主要死亡原因之一。目前普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎癥疾病[2]。動脈粥樣硬化的炎癥發(fā)病機(jī)制是一個多步驟過程[3]，其中單核/巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要作用[4-6]。血液單核細(xì)胞在趨化因子作用下黏附于損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞并侵入內(nèi)皮下聚集分化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂蛋白分化為泡沫樣細(xì)胞并堆積形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊[7-9]。本研究對比正常飲食對照及高脂飲食(8周和16周)誘導(dǎo)動脈粥樣硬化小鼠組織及全身炎癥狀態(tài)，利用紅色熒光染料PKH26標(biāo)記純化的外周血單核細(xì)胞，通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，探討炎癥微環(huán)境對單核細(xì)胞向動脈粥樣硬化斑塊遷徙影響，為動態(tài)觀察動脈粥樣硬化過程中炎癥微環(huán)境狀態(tài)變化、炎癥細(xì)胞向斑塊內(nèi)遷徙提供了有效的研究方法和形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料油紅O染料(AMRESCO)，CCL2 ELISA試劑盒(R&D Systems)，TNF-α ELISA試劑盒(BD Biosciences)，流式抗體CD45(30-F11, APC)，CD11b(M1/70, FITC)，Ly6G(1A8, PE)，Ly6C(HK1.4, PE/Cy7)(Biolegend)，PKH26紅色熒光細(xì)胞標(biāo)記試劑盒(Sigma-Aldrich)、Trizol、核酸染料SYBR Green、DAPI(Thermo Fisher Scientific)，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega)。流式細(xì)胞儀(BD Calibur, BD AriaⅡ)，實(shí)時定量PCR儀(ABI StepOne)，徠卡激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)，徠卡冰凍切片機(jī)(LeicaCM1900)，酶標(biāo)儀(Bio-tek)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及模型建立SPF級C57BL/6 ApoE敲除小鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK(京) 2016-0006]，于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK (陜) 2015-0002]SPF級環(huán)境繁育飼養(yǎng)，體質(zhì)量(20.0±2.0)g。隨機(jī)將36只雄鼠分為3組，各12只：正常飲食6周齡；高脂飲食(21%脂肪，0.15%膽固醇)8周(從6周齡開始)；高脂飲食16周小鼠，用于主動脈病理檢查及炎癥檢測[10-12]。25只小鼠用于單核細(xì)胞回輸實(shí)驗(yàn)：其中高脂飲食16周小鼠(15只)隨機(jī)分為3組，各5只，用于不同量單核細(xì)胞回輸；隨機(jī)將另外10只小鼠分為2組(高脂飲食8周或16周)，各5只，用于相同量單核細(xì)胞不同周齡鼠回輸實(shí)驗(yàn)。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)，批件號：XJTULAC2020-16。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1主動脈及主動脈根部病理檢查 主動脈根部40 g/L多聚甲醛固定2 h后，200 g/L蔗糖過夜，OCT包埋，冰凍切片機(jī)5 μm連續(xù)切片。主動脈及主動脈根部切片進(jìn)行油紅O染色，圖像分析軟件(Image Pro Plus, IPP)計(jì)算斑塊面積[13]。

1.3.2主動脈炎性因子及細(xì)胞mRNA表達(dá)量檢測 采用Trizol法提取主動脈RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR Green染料行實(shí)時定量PCR，采用相對定量法(2-△△CT)計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，△△CT=(CT目的基因-CTβ-actin)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CTβ-actin)對照組。以正常對照小鼠主動脈炎性因子或細(xì)胞表達(dá)水平(設(shè)為1)為對照。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 各引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.3ELISA檢測血漿炎性因子表達(dá)量 利用CCL2及TNF-α ELISA試劑盒，酶標(biāo)儀450 nm讀取A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本濃度。

1.3.4流式檢測外周血炎性細(xì)胞 肝素抗凝外周血，冰上裂解紅細(xì)胞后，重懸入100 μL PBS，加Fc受體阻斷抗體，冰上孵育10 min。隨后加入大鼠抗小鼠APC-CD45、FITC-CD11b、PE-Ly6G、PEcy7-Ly6C及相應(yīng)同型對照抗體，冰上孵育20 min。PBS洗2遍，重懸入300 μL PBS上機(jī)檢測。FlowJo 7.6軟件分析流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。

1.3.5外周血單核細(xì)胞分選、標(biāo)記、回輸及檢測 6～8周齡ApoE敲除雄鼠，收抗凝外周血，裂解紅細(xì)胞，封閉，利用流式抗體標(biāo)記細(xì)胞，流式分選得到CD45+CD11b+ly6G-單核細(xì)胞，利用PKH26細(xì)胞染料標(biāo)記紅色熒光[14]。將不同濃度的標(biāo)記細(xì)胞，尾靜脈注射入動脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)。24 h后收取主動脈根部，OCT包埋，5 μm冰凍切片，DAPI染色后[15]，共聚焦顯微鏡計(jì)數(shù)PKH26紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0及Graph Pad Prism 7.0處理數(shù)據(jù)、作圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)(不符合正態(tài)分布或方差不齊)；單一變量多組間比較用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行分析。P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的對比本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化模型。為比較高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊，整條主動脈和主動脈根部切片進(jìn)行脂質(zhì)油紅O染色，以正常飲食6周齡小鼠作為陰性對照。高脂飲食16周小鼠較高脂飲食8周小鼠主動脈斑塊明顯增多(t=6.276，P<0.001，圖1A、圖1C)，主動脈根部斑塊亦明顯增多(Z=-2.882，P<0.01，圖1B、圖1D)。結(jié)果提示，高脂飲食時間延長，ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化病變加重。

圖1 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的比較

2.2 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠組織炎癥變化為檢測小鼠主動脈組織局部炎癥變化，利用實(shí)時定量PCR檢測相關(guān)炎癥/趨化因子及細(xì)胞含量。以正常飲食6周齡小鼠相應(yīng)mRNA相對表達(dá)平均值為1，高脂飲食16周小鼠主動脈炎癥/趨化因子CCL2(Z=-2.882,P<0.01)、TNF-α(Z=-2.722,P<0.01)、IL-1β(Z=-2.882,P<0.01)相對表達(dá)量均較高脂飲食8周小鼠明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖2A)。高脂飲食16周小鼠主動脈巨噬細(xì)胞相對表達(dá)量(9.86±0.74)明顯高于高脂飲食8周小鼠(4.93±0.38)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.914，P<0.001，圖2B)。提示高脂飲食16周小鼠主動脈組織巨噬細(xì)胞增多，局部炎性反應(yīng)加重。

表2 高脂飲食小鼠主動脈相關(guān)促炎因子mRNA水平Tab.2 mRNA levels of proinflammatory cytokines on high-fat diet(n=6)

2.3 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠全身炎癥變化ELISA檢測血漿炎癥/趨化因子結(jié)果顯示：隨高脂飲食時間延長，血漿炎癥/趨化因子CCL2、TNF-α含量顯著升高(P<0.001，圖3A)。流式分析外周血免疫細(xì)胞測定，細(xì)胞分群策略見圖3B。隨高脂飲食時間延長，小鼠外周血粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及炎性單核/巨噬細(xì)胞亞群逐漸增多(P<0.05或P<0.01，圖3C)，單核/巨噬細(xì)胞受體CCR2平均熒光強(qiáng)度逐漸增高(P<0.01，圖3D)。提示高脂飲食16周小鼠全身炎性反應(yīng)加重。

圖2 高脂飲食16周小鼠組織炎癥反應(yīng)加重

圖3 高脂飲食16周小鼠全身炎癥反應(yīng)加重

2.4 PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞主動脈根部遷徙比較PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞分為3組，2×105/100 μL、5×105/100 μL、1×106/100 μL尾靜脈輸入高脂飲食16周ApoE敲除小鼠體內(nèi)。24 h后，各組主動脈根部斑塊內(nèi)紅色熒光陽性單核細(xì)胞數(shù)量分別為：6.40±1.36、16.80±2.27和34.20±4.53，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.49，P<0.001，圖4A、圖4B)。2×105/100 μL組即可檢測到遷徙細(xì)胞，隨回輸細(xì)胞數(shù)量增多，斑塊內(nèi)遷徙細(xì)胞增多。為觀察炎癥微環(huán)境對單核細(xì)胞向斑塊內(nèi)遷徙影響，2×105/100 μL標(biāo)記單核細(xì)胞尾靜脈注射入高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食16周小鼠主動脈根部斑塊中遷徙細(xì)胞個數(shù)(7.20±1.02)明顯多于高脂飲食8周小鼠(1.80±0.37)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.971,P<0.01，圖4C、圖4D)。

圖4 尾靜脈注射PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞主動脈根部遷徙的比較

3 討 論

盡管在治療方面取得了重大進(jìn)展，但動脈粥樣硬化的臨床后遺癥、心臟病發(fā)作和中風(fēng)仍是目前的主要死亡原因。ROSS課題組[16]在1986年首次明確提出動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，是對損傷的一種過度防御反應(yīng)。目前普遍認(rèn)為，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[2,17]。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展涉及到動脈內(nèi)膜中多種細(xì)胞的活化[18]，從而導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞是AS斑塊內(nèi)的重要炎癥細(xì)胞，對微環(huán)境炎癥狀態(tài)發(fā)揮重要影響作用，參與動脈粥樣硬化疾病進(jìn)展各個階段[19-20]。本研究利用流式分選技術(shù)，分選外周血單核細(xì)胞，體外標(biāo)記紅色熒光染料PKH26，通過細(xì)胞回輸, 原位展現(xiàn)外周血單核細(xì)胞進(jìn)入斑塊并進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著回輸細(xì)胞增多，斑塊內(nèi)遷徙細(xì)胞增多。因小鼠循環(huán)血量少，每只小鼠大約僅能獲得1 mL全血，獲取外周血單核細(xì)胞總量低，2×105可作為首選尾靜脈注射細(xì)胞量，此細(xì)胞量較為經(jīng)濟(jì)。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨高脂飲食時間延長，ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化病變加重，組織及全身炎性反應(yīng)加重，其炎癥微環(huán)境有助于外周血單核細(xì)胞向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)遷徙。

研究證實(shí)，PKH26可用于多種細(xì)胞染色，其不可逆地結(jié)合細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，假陽性率低。其毒性較小，只要標(biāo)記濃度適當(dāng)，基本不會對細(xì)胞生物學(xué)特征產(chǎn)生影響，并且可以在體內(nèi)保留長達(dá)1年[14]。本研究在動脈粥樣硬化小鼠模型中成功建立了PKH26標(biāo)記單核細(xì)胞體內(nèi)遷徙示蹤模型。此方法可應(yīng)用于其他免疫細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞體外分選及體內(nèi)示蹤，也可應(yīng)用于不同標(biāo)記或攜帶不同基因修飾的細(xì)胞治療和作用研究。