非洲豬瘟病毒檢測方法研究進(jìn)展

宮 婷

（遼寧省桓仁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，遼寧 桓仁 117200）

非洲豬瘟簡稱ASF（African swine fever），是一種容易引起家豬或者野豬發(fā)生急性、熱性的傳染性疾病，其傳播途徑通過密切接觸而來，其病原名稱為非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV），被世界動物衛(wèi)生組織（OIF）定性為必須報告的動物疫病，我國定性一類疫病[1]。在我國，首例被確診的非洲豬瘟是在2018 年8月，從此之后，非洲豬瘟已經(jīng)蔓延到了全國多個省市自治區(qū)和直轄市，給我國養(yǎng)豬行業(yè)及配套產(chǎn)業(yè)帶來了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到了市場的肉類供應(yīng)。

目前，國際上針對此病還沒有研制出可以預(yù)防的有效疫苗，防控疫病的方法主要采取生物安全措施。針對ASF 做及時明確的病原學(xué)檢測可以有效的為制定各項(xiàng)防控措施提出指導(dǎo)，對于疫病防控實(shí)施效果評估提供有利的依據(jù)。文章將主要的病原學(xué)檢測方法進(jìn)行了解析，為ASF 的防控工作以及研發(fā)高效可行的診斷技術(shù)提供了參考內(nèi)容。

1 病毒分離

首先要從病豬身上采集血液、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，在其樣本上接種諸如豬肺泡巨噬細(xì)胞這樣的原代細(xì)胞，ASFV 在這些容易受到感染的細(xì)胞中產(chǎn)生病變同時產(chǎn)生復(fù)制。如果在培養(yǎng)的細(xì)胞組織中注入豬紅細(xì)胞，那么絕大多數(shù)的ASFV 就會對紅細(xì)胞產(chǎn)生吸附的反應(yīng)，這種包圍豬紅細(xì)胞的狀態(tài)有一個好聽的名字叫“玫瑰花環(huán)”。由于還有一部分的非洲豬瘟病毒株對于紅細(xì)胞不會產(chǎn)生吸附反應(yīng)，如果在分離培養(yǎng)的組織中沒有出現(xiàn)吸附反應(yīng)而是產(chǎn)生了細(xì)胞裂變，那么就要通過免疫熒光或者是PCR 的方式來對細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn)，看看是否有非洲豬瘟病毒的存在；檢測中需要注意，免疫熒光和PCR 要傳代3-5 次成陰性反應(yīng)才可以被認(rèn)可為陰性。如果是首次爆發(fā)ASF 的地區(qū)，在通過PCR 或者免疫熒光等方法監(jiān)測的結(jié)果都是陽性的話，就需要再進(jìn)行紅細(xì)胞吸附反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證[2]。

2 抗原檢測

2.1 免疫熒光法

免疫熒光法是ASF 的檢測方法之一，被世界動物衛(wèi)生組織所推薦。這個方法是針對臟器涂片或者薄層冷凍切片等加入異硫氰酸熒光素來標(biāo)記抗ASFV 特異性抗體，以此來實(shí)現(xiàn)檢測。這種檢測方法主要是針對不產(chǎn)生HAD 的ASFV 毒株感染進(jìn)行鑒別工作，還可以用來對ASFV 產(chǎn)生CPE和其它病毒產(chǎn)生CPE 進(jìn)行區(qū)別。免疫熒光檢測法對于急性ASF 感染的檢測時效極高，但是對于亞急性或者是慢性感染的檢測就不那么迅速了，這與感染組織可能已經(jīng)異變成抗原體復(fù)合物阻止了與檢測用抗體相結(jié)合的通道有關(guān)[3]。

2.2 ELISA 法

ELISA 檢測法是通過Wardley 等用抗ASFV的特異性血清IgG 作為包被蛋白而進(jìn)行的檢測法，其對于 ASFV 抗原檢測濃度為 50-500 HAD50/ml?；趐72（病毒衣殼蛋白）單抗的雙抗夾心ELISA 法具有較強(qiáng)的靈敏度[3]。目前，針對這種檢測方法，已經(jīng)發(fā)明了ASFV 抗原ELISA 檢測試劑盒，其設(shè)備要求低，使用起來簡單，性價比高，在市場上流通很快，但是與熒光定量PCR 檢測法相比，檢測的準(zhǔn)確性和特異性還需要進(jìn)一步的提升。

2.3 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是用抗VP72 蛋白單克隆抗體研制而成的。通過對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條可以檢測病毒的含量是超過104HAU 的樣本，通過臨床試驗(yàn)可以看出，三種檢測方式其準(zhǔn)確率不同，檢測率最高最準(zhǔn)確的是PCR，其次就是檢測率達(dá)60 % 的試紙條，而抗原間接ELISA 試劑盒僅有48 % 的準(zhǔn)確率[4]。

3 分子生物學(xué)檢測方法

除了免疫學(xué)檢測技術(shù)，還有分子生物學(xué)檢測法，其檢測反應(yīng)更為精準(zhǔn)，更加適用于高通量檢測。上文提到OIE 推薦的PCR 檢測法是普遍認(rèn)可的ASFV 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對于PCE 的探索國內(nèi)外學(xué)者從未停止，目前甚至出現(xiàn)數(shù)字PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增等方法[5]。

3.1 常規(guī)PCR 檢測法

常規(guī)PCR 檢測法針對ASFV 最多能檢測的DNA 數(shù)值是從幾十到上百。通過VP72 基因設(shè)計而建立起的常規(guī)PCR 檢測法是可以檢測到0.12HAU50濃度的ASFV，而且其特異性表現(xiàn)良好，是OIE 推薦的檢測方法。

除可以單獨(dú)檢測ASFV 的方法，更有檢測多種病原的PCR 檢測方法。如可以同時對ASFV、豬瘟病毒、高致病性藍(lán)耳病病毒和為狂犬病病毒進(jìn)行檢測的多重PCR 法[6]。

3.2 熒光定量PCR 檢測法

熒光定量PCR 檢測法比常規(guī)PCR 檢測對于基因片段的擴(kuò)增更短，不僅反應(yīng)快速，而且最低檢出的限度可以從幾個到幾十個拷貝的DNA 模板。在操作時不用開蓋的優(yōu)點(diǎn)降低了擴(kuò)增產(chǎn)物被污染的可能性，因此是現(xiàn)今ASFV 檢測被使用頻率最高的方法。

3.3 恒溫擴(kuò)增檢測法

近幾年，分子診斷技術(shù)越來越成為研究重點(diǎn)，恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其優(yōu)勢在于可以降低實(shí)驗(yàn)操作成本，不用通過造價較高的熱循環(huán)設(shè)備，只需使用普通的水浴設(shè)備就可以在單一溫度中進(jìn)行測試，而且反應(yīng)迅速；在檢測時肉眼直觀的可以根據(jù)體系中染料色彩變化或者時試紙條上檢測線來分辨結(jié)果，是一種可以現(xiàn)場完成測試的檢測方法[7]。

4 小結(jié)

綜上所述，依據(jù)我國對于ASF 防控政策，對于ASFV 的分離和鑒定還沒有完全放開，只能在特定的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，盡管試紙條和ELISA 這樣的檢測方法既便利又快捷，但是受制于檢測限，也只能用來檢測急性病例和病死豬而已。對非洲豬瘟的防控研究，還有很長的一段路要走，希望在未來的科學(xué)研究中，能夠早日打破現(xiàn)在的局面，讓抗疫疫苗早日面世。