氮氧自由基HPN葡萄糖苷的設(shè)計合成與抗缺氧活性研究

楊立超，邵 瑾，趙 彤，馬慧萍，景臨林*

(1.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院衛(wèi)勤訓(xùn)練中心，甘肅 蘭州 730050； 2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州730050)

糖苷類化合物在天然產(chǎn)物中廣泛存在，往往具有優(yōu)異的生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[6].糖單元的引入能夠增加母體分子的穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度，并改善其生物和藥理特性[7].同時，一些葡萄糖苷可以通過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)中分布廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glucose transporter 1，GLUT1))主動轉(zhuǎn)運到腦組織中，使母體分子具有腦靶向性[8].

為了獲得活性更加優(yōu)異的HPN衍生物，通過兩步反應(yīng)，將HPN與葡萄糖偶聯(lián)，得到了HPN葡萄糖苷衍生物(合成路線見圖1)，目標化合物分子結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、EPR、質(zhì)譜和元素分析確證.進一步通過體內(nèi)抗缺氧活性實驗證明：該衍生物能顯著延長常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，且活性明顯優(yōu)于HPN.

圖1 HPN葡萄糖苷的合成路線

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

HWCL-3集熱式恒溫磁力攪拌器、R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和DL-400循環(huán)冷卻器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；X-4B顯微熔點儀(溫度計未校正)，上海精科實業(yè)有限公司；Vario EL cube 型元素分析儀，德國 Elementar公司；ALPHA紅外光譜儀(溴化鉀壓片)、A300-9.5/12電子順磁共振波譜儀和APEX II型傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀，德國Brucker公司；API 3200 LC/MS/MS串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Applied Biosystems公司.

氮氧自由基HPN和四乙酰溴代葡萄糖分別按照文獻[5]和文獻[9]的方法制備.732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；200 ～ 300目柱層析硅膠購自青島海洋化工廠分廠，GF254薄層析層硅膠預(yù)制板購自煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所；石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇均為市售分析純試劑.

1.2 乙?；疕PN葡萄糖苷(化合物2)的合成

將500 mg(2 mmol)HPN、644 mg(2 mmol)四丁基溴化銨(TBAB)、500 mg(4 mmol)K2CO3、30 mL蒸餾水和30 mL CHCl3加入250 mL三口燒瓶中.室溫攪拌下，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加四乙酰溴代葡萄糖(1.64 g，4 mmol)的CHCl3(30 mL)溶液.滴加完畢后，升溫至60 ℃繼續(xù)避光反應(yīng)約10 h.停止反應(yīng)，分液，水相用CH2Cl2萃取(20 mL×3)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜.過濾，減壓除去溶劑后得藍色油狀物.快速柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1 ～ 1∶1)分離純化后得目標化合物2.

化合物2：藍色固體，961 mg，產(chǎn)率83%.m.p.：94.5～ 95.5 ℃.IR(KBr，cm-1)：1 757，1 607，1 487，1 451，1 364，1 306，1 230，1 038，907，837.EPR(CH3OH)：五重峰，αN=7.74，g=2.008 2.ESI-MS(m/z)：580[M+H]+.Anal.Calcd for C27H35N2O12：C，55.95；H，6.09；N，4.83.Found：C，55.90；H，6.11；N，4.84.

1.3 HPN葡萄糖苷(化合物1)的合成

將化合物2(579 mg，1.0 mmol)和10 mL甲醇加至一單口燒瓶中，冷卻至0 ℃.攪拌下加入25%的甲醇鈉/甲醇溶液(100 μL).加畢后，繼續(xù)反應(yīng)4 h，TLC監(jiān)測原料點消失后，用732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)體系至中性，過濾，濾餅用甲醇洗滌數(shù)次，合并濾液后，減壓除去甲醇后得目標化合物1.

化合物1：藍色固體，378 mg，產(chǎn)率92%.m.p.：123.9～124.9 ℃.IR(KBr,cm-1)：3 385，1 607，1 488，1 451，1 358，1 306，1 246，1 075，906，837.EPR(CH3OH)：五重峰，αN=7.74，g=2.008 2.ESI-MS(m/z)：412[M+H]+.Anal.Calcd for C19H27N2O8：C，55.47；H，6.61；N，6.81.Found：C，55.48；H，5.59；N，6.77.

1.4 常壓密閉缺氧實驗

50只清潔級雄性BABL/c小鼠隨機均分為5組，缺氧模型組、HPN組(0.8 mmol/kg)、三組HPN葡萄糖苷(化合物1)組(0.4，0.8，1.2 mmol/kg)，腹腔注射給藥，缺氧模型組給予等體積的生理鹽水，給藥30 min后，將小鼠置于250 mL廣口瓶內(nèi)(瓶內(nèi)放置5g鈉石灰用于吸收呼出的二氧化碳，2片濾紙用于吸附小鼠排泄物)，將瓶口密封后開始計時，以小鼠最后一次大喘氣為死亡標志，記錄小鼠的存活時間并計算延長率.

2 結(jié)果與討論

2.1 HPN葡萄糖苷的合成

文獻報道的糖苷的合成方法主要有酶催化法和化學(xué)合成法.酶解法具有區(qū)域和立體選擇性好、反應(yīng)溫和等優(yōu)點，但反應(yīng)所需的糖基轉(zhuǎn)移酶價格昂貴，對底物要求較高[10].因此，化學(xué)合成法仍然是獲得糖苷化合物不可或缺的手段.化學(xué)合成糖苷類化合物的方法較多，主要包括柯尼希斯-克諾爾(Koenigs-Knorr)法、三氯乙酰亞胺酯(Schmidt)法、硫苷法、相轉(zhuǎn)移催化法、三氟乙酸酯法和Fisher法等[11]，其中相轉(zhuǎn)移催化法具有反應(yīng)條件溫和、操作簡便、產(chǎn)率高、成本低等優(yōu)點，在糖苷的合成中應(yīng)用廣泛.本文選用價廉易得的季銨鹽類相轉(zhuǎn)移催化劑四乙基溴化銨(TEAB)[12]，以CHCl3-H2O混合體系為溶劑，利用HPN中酚羥基的反應(yīng)活性，在堿性條件下與乙酰化溴代葡萄糖糖反應(yīng)，得到了HPN 7-乙酰葡萄糖苷衍生物.反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)采取的堿性體系對反應(yīng)影響較大.HPN在氫氧化鈉體系中穩(wěn)定性較差，同時溴代糖分解較快.碳酸氫鈉/氯化鉀體系雖然可以減少乙酰溴代糖的水解，但是反應(yīng)時間較長(>72 h)，容易造成HPN的分解，產(chǎn)率較低.因此，研究中采用碳酸鉀體系，反應(yīng)時間短，條件溫和，能夠以83%的高產(chǎn)率得到目標化合物2.

為了避免糖苷鍵在酸性條件下水解，糖苷乙酰基的脫除反應(yīng)一般選擇在堿性條件下進行，可以采用NaOH/CH3CH2OH/H2O、NH3/CH3OH或者CH3ONa/CH3OH體系[13].考慮到NH3/CH3OH體系堿性較弱，反應(yīng)時間長[14]，同時為了簡化后處理流程，研究中采用了CH3ONa/CH3OH體系，反應(yīng)結(jié)束后，只需用強酸性陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)pH為酸性，然后過濾，濃縮干燥后即得目標化合物，避免了引入難于除去的無機鹽，簡化了后處理流程，提高了收率和純度.

2.2 結(jié)構(gòu)表征

氮氧自由基結(jié)構(gòu)中的單電子使其在核磁共振儀上沒有信號，無法通過NMR對其進行結(jié)構(gòu)表征.在化合物1的紅外譜圖中，1 757 cm-1出現(xiàn)乙酰基結(jié)構(gòu)中羰基的特征吸收峰；當化合物1轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?時，3 385 cm-1出現(xiàn)羥基吸收峰，為一單譜帶強寬峰，同時1 757 cm-1的羰基吸收峰消失，表明分子中的乙?；凰?化合物1和2在1 360 cm-1附近均能觀察到典型N-O鍵吸收峰，在1 240 cm-1和1 600 cm-1附近出現(xiàn)C-N和C=N鍵特征吸收峰，在890 cm-1附近出現(xiàn)β-型糖苷鍵的指紋吸收峰，在837 cm-1出現(xiàn)苯環(huán)對位取代特征峰.EPR檢測結(jié)果顯示：化合物1和2與氮氧自由基HPN呈現(xiàn)出幾乎完全相同的五重峰，各峰強度比為1∶2∶3∶2∶1(圖2所示)，表明三種化合物含有相同的自由基結(jié)構(gòu).質(zhì)譜和元素分析結(jié)果與目標化合物一致.

圖2 HPN(左)、化合物1(中)和2(右)的EPR譜

2.3 抗缺氧活性

通過小鼠常壓密閉缺氧實驗，對HPN葡萄糖苷進行抗缺氧活性研究，結(jié)果如表1所示.小鼠存活時間和延長率隨著給藥劑量的加大而增加，具有顯著的劑量依賴性.與缺氧模型組相比，HPN葡萄糖苷中、高劑量組均能顯著延長缺氧小時存活時間.在等物質(zhì)的量的條件下，HPN葡萄糖苷中劑量組小鼠的生存時間較HPN組明顯延長(P<0.05)，表現(xiàn)出優(yōu)于HPN的抗缺氧活性.以上實驗結(jié)果表明：葡萄糖糖單元的引入，可能改變了HPN在體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)和生物利用度，并使其對腦組織具有了一定的靶向性，從而提高了抗缺氧活性.

表1 目標化合物對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響(±s, n=10)

3 結(jié)論

前期研究發(fā)現(xiàn)HPN具有優(yōu)異的抗高原缺氧活性，為了獲得抗缺氧活性更加優(yōu)異的新型氮氧自由基HPN衍生物，以HPN和乙酰溴代葡萄糖為原料，通過兩步反應(yīng)，設(shè)計合成得到一種新型HPN葡萄糖苷衍生物，反應(yīng)操作簡單，條件溫和，目標化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜分析確認.進一步通過小鼠常壓密閉缺氧實驗，結(jié)果表明：HPN葡萄糖苷表現(xiàn)出了顯著優(yōu)于母體分子HPN的抗缺氧活性，但其具體的作用機制尚不明確.下一步課題組將通過對其靶向性和藥代動力學(xué)性質(zhì)的研究，闡明其可能的作用機制，為設(shè)計合成活性更加優(yōu)異的HPN衍生物奠定理論基礎(chǔ).