蛋白聚糖調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

吳靖漪 陳嘉文 孫天語 劉鵬 吳補(bǔ)領(lǐng)

南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院1種植中心，4牙周科（廣州510280）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科（廣州510515）；3南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（廣州510515）；5南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院口腔科（廣州510282）；6南方醫(yī)科大學(xué)深圳口腔醫(yī)院（坪山）（廣東深圳518118）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有多向分化潛力，由于其來源廣泛并可以在體外大量擴(kuò)增，是骨組織再生工程中熱門的種子細(xì)胞，并在臨床試驗(yàn)中獲得了顯著的修復(fù)效果［1-2］。先前研究主要集中在多種信號(hào)分子對(duì)干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［3］，然而干細(xì)胞微環(huán)境亦是干細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵影響因素。蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）是構(gòu)成MSCs 微環(huán)境的最主要成分之一［4］，參與調(diào)控其自我更新與譜系分化之間的動(dòng)態(tài)平衡。既往研究認(rèn)為蛋白聚糖具有組織特異性，能夠參與配體、趨化因子、生長(zhǎng)因子等在細(xì)胞外的梯度擴(kuò)散。近年來研究還表明蛋白聚糖能與細(xì)胞外信號(hào)分子結(jié)合共同調(diào)控信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而影響干細(xì)胞自我更新和成骨分化之間的動(dòng)態(tài)平衡［5-6］。深入揭示蛋白聚糖在干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)楦杉?xì)胞在骨修復(fù)應(yīng)用中的臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。本文將重點(diǎn)闡述蛋白聚糖調(diào)控不同間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用、潛在機(jī)制及其臨床應(yīng)用。

1 蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)組成及功能特點(diǎn)

蛋白聚糖是由一個(gè)或多個(gè)GAGs 通過絲氨酸殘基以共價(jià)鍵形式結(jié)合在一個(gè)核心蛋白上組合而成的多糖大分子，是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)的重要構(gòu)成成分，與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)。

蛋白聚糖的生物學(xué)功能主要來源于其結(jié)構(gòu)中多樣的GAGs 鏈。GAGs 是由二糖單位重復(fù)連接形成的高硫化線性多糖，主要分為硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸軟骨素（chondroitin sul?fate，CS）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）、硫酸角質(zhì)素（keratan sulphate，KS）、透明質(zhì)酸（hyaluron?ic acid，HA）和肝素（heparin，HEP）［6］。不同的GAGs 之間主鏈差異較小，但經(jīng)進(jìn)一步硫酸化、脫乙?；彤悩?gòu)化修飾后，GAGs 長(zhǎng)鏈間出現(xiàn)明顯生物構(gòu)象及功能差異。GAGs 屬于翻譯后修飾產(chǎn)物，其合成無確定的模板，組織器官來源及個(gè)體化差異等均會(huì)影響其硫酸化修飾，各異的硫酸化修飾的位點(diǎn)和硫化程度使GAGs 具有豐富的結(jié)構(gòu)域，能夠?yàn)椴煌男盘?hào)蛋白、生長(zhǎng)因子及趨化因子等提供結(jié)合位點(diǎn)［7-8］，以此賦予蛋白聚糖不同的生物學(xué)功能。GAGs 的表達(dá)具有明顯的時(shí)空特異性，它通過不斷調(diào)整自身糖鏈結(jié)構(gòu)，以在不同時(shí)期適應(yīng)與特定生長(zhǎng)因子的結(jié)合，協(xié)助其擴(kuò)散或與其受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合這些生長(zhǎng)因子，從而雙向調(diào)控信號(hào)通路傳導(dǎo)。此外，GAGs 與特定生長(zhǎng)因子具有高親和力，可以結(jié)合并保護(hù)這些生長(zhǎng)因子免受蛋白酶降解，進(jìn)而維持穩(wěn)定的信號(hào)分子濃度梯度。

由此可見，多樣的GAGs 與其所依附的核心蛋白決定著蛋白聚糖將以多種方式廣泛參與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)［9］。蛋白聚糖持續(xù)參與重塑動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞微環(huán)境，影響干細(xì)胞及子代細(xì)胞的增殖與分化［6］，廣泛參與調(diào)控胚胎發(fā)育［10］、細(xì)胞分化［11］、組織再生［12］以及腫瘤進(jìn)展［13］等多個(gè)生物學(xué)環(huán)節(jié)。

2 蛋白聚糖在干細(xì)胞成骨分化中的作用

蛋白聚糖與骨組織發(fā)育再生密切相關(guān)，大量研究已觀察到核心蛋白聚糖（decorin）、雙鏈蛋白聚糖（biglycan）、基底膜聚糖（perlecan）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）等多種蛋白聚糖在骨組織發(fā)育的不同時(shí)期廣泛表達(dá)，這些蛋白聚糖參與構(gòu)成骨基質(zhì)的形成和礦化，在骨組織發(fā)育及修復(fù)中起著必不可少的作用。FAM20B 調(diào)控著蛋白聚糖上的GAGs 與核心蛋白之間鏈接區(qū)內(nèi)木糖（xylose）的磷酸化，是GAGs 連接于蛋白聚糖發(fā)揮正常生物學(xué)功能的必要激酶。LIU 等［10］在神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)特異性敲除Fam20B 基因，導(dǎo)致GAGs 無法與核心蛋白順利連接，構(gòu)建了GAGs 缺失小鼠模型，觀察到小鼠顱面部骨骼發(fā)育明顯異常，表現(xiàn)為骨質(zhì)礦化不足，顱縫較正常小鼠顯著增寬。說明蛋白聚糖對(duì)骨骼系統(tǒng)的正常發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

蛋白聚糖在骨組織中的作用不僅在動(dòng)物體內(nèi)觀察到，參與編碼多種蛋白聚糖的基因突變亦會(huì)導(dǎo)致遺傳性骨發(fā)育疾病。Schwartz?Jampel 綜合征的致病基因是編碼Perlecan 的基因突變，突變患者分泌到細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的Perlecan 顯著減少，阻礙生長(zhǎng)板的正常形成，并引起軟骨細(xì)胞聚集障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重的軟骨發(fā)育不全及骨組織的結(jié)構(gòu)異常［14］。

骨骼系統(tǒng)的正常發(fā)育不僅依賴于蛋白聚糖的完整功能，蛋白聚糖正常的硫酸化修飾對(duì)于骨組織發(fā)育亦起著不可或缺的調(diào)控作用。SLC26A2 是胞膜上的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，可為蛋白聚糖的硫酸化修飾提供充足的硫酸鹽，其功能缺失導(dǎo)致軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的硫酸鹽攝取顯著下降，軟骨內(nèi)的蛋白聚糖硫化程度嚴(yán)重降低，生長(zhǎng)板內(nèi)的Ihh 信號(hào)通路的活性降低，抑制軟骨細(xì)胞增殖，推遲次級(jí)骨化中心的形成，最終造成多種遺傳性骨發(fā)育疾病的發(fā)生，包括骨畸形性發(fā)育不良、軟骨成長(zhǎng)不全以及多發(fā)性骨骺發(fā)育不良［15］。由此可見，蛋白聚糖廣泛參與了骨和軟骨發(fā)育形成的全過程，其完整的結(jié)構(gòu)和功能時(shí)刻影響著復(fù)雜的骨組織發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是骨骼系統(tǒng)發(fā)育生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵分子。

2.1 蛋白聚糖在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和成骨分化之間的穩(wěn)態(tài)是目前研究的重點(diǎn)之一，其精準(zhǔn)調(diào)控需要多個(gè)信號(hào)分子有序的時(shí)空表達(dá)。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為GAGs 是干細(xì)胞轉(zhuǎn)向分化狀態(tài)中必需的信號(hào)調(diào)控分子。敲除小鼠ESCs 中編碼HS 鏈合成的Ext?1 基因后，干細(xì)胞的分化活動(dòng)明顯受阻［16］。蛋白聚糖作為該動(dòng)態(tài)平衡中重要的信號(hào)分子，它的種類及分布具有明顯的組織特異性。隨著MSCs 進(jìn)行成骨分化，蛋白聚糖的表達(dá)模式也不斷地發(fā)生著變化，CSPG 和DSPG 的含量逐漸降低，相反的HSPG含量逐漸上升［17］。與蛋白聚糖中的核心蛋白相比，其上共價(jià)連接的GAGs 是影響MSCs 成骨分化的關(guān)鍵。在MSCs 成骨向分化時(shí)，合成HS、CS、DS所需的關(guān)鍵酶XT?Ⅰ、EXTL2、GalNAcT 及硫化酶HS6ST3 的表達(dá)顯著上調(diào)［18-19］。由此可見，GAGs 及其硫酸化修飾緊密調(diào)控著MSCs 的成骨向分化。體外研究亦表明加入外源性GAGs 能有效增強(qiáng)MSCs的成骨分化潛力，成骨分化的相關(guān)基因例如骨鈣素、骨粘連蛋白和Ⅰ型膠原等表達(dá)顯著上調(diào)［20］，加速骨缺損的愈合［21］。

2.2 蛋白聚糖在調(diào)控牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用除了調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，多種蛋白聚糖如基膜蛋白聚糖（lumican）、多能蛋白聚糖（versican）、骨調(diào)蛋白（osteomodulin，OMD）、Asporin 及外源性的HEP 在牙源性干細(xì)胞中的成骨作用也是近年研究的熱點(diǎn)。研究者們?cè)谘浪杞M織中觀察到基膜蛋白聚糖、多能蛋白聚糖等多種蛋白聚糖的表達(dá)，可能密切調(diào)控牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的增殖和分化［11，22］。JIANG 等［23］通過在體外牙胚培養(yǎng)中添加化學(xué)分子Xyl?MU，抑制GAGs 與核心蛋白的連接，觀察到成牙本質(zhì)細(xì)胞的成骨向分化嚴(yán)重受阻，成骨向分化標(biāo)志物DMP1、DSPP 的表達(dá)僅為對(duì)照組的20%，基質(zhì)沉積和礦化亦顯著減少，前牙本質(zhì)的厚度僅為對(duì)照組的二分之一。提示蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)和功能完整性對(duì)于DPSCs 的成骨分化必不可缺，而蛋白聚糖作為成骨分化中重要的調(diào)控分子，它的種類及分布具有明顯的組織特異性。OMD 是一種僅存在于礦化組織內(nèi)的蛋白聚糖，其C 端結(jié)構(gòu)域?qū)αu基磷灰石有著高親和力。在hDPSCs 的成骨分化后期OMD 的表達(dá)顯著上調(diào)35 倍，研究者們進(jìn)一步通過shRNA 沉默OMD 的表達(dá)后，shOMD?hDPSCs組的成骨標(biāo)志物表達(dá)水平僅為對(duì)照組的三分之一，并且無法形成礦化結(jié)節(jié)［11］。由此可見蛋白聚糖不僅參與了hDPSCs 的成骨向分化，亦是基質(zhì)礦化的重要調(diào)控分子。

同樣，外源性的HEP 具有促進(jìn)hDPSCs 成骨向分化的潛力，可顯著上調(diào)成骨標(biāo)志物BMP?2、ALP、OC 的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。HEP 良好的組織相容性和成骨潛力使其有望成為直接蓋髓術(shù)的新材料［24］。目前關(guān)于蛋白聚糖在牙源性干細(xì)胞成骨向分化中的調(diào)控作用的探討仍處于初級(jí)階段，深入闡明蛋白聚糖對(duì)牙源性干細(xì)胞的成骨調(diào)控作用將有助于推動(dòng)引導(dǎo)骨組織再生、材料學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。

2.3 蛋白聚糖調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制骨形成是長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)過程，多條通路的相互作用和精準(zhǔn)的時(shí)空表達(dá)是骨發(fā)育再生中必不可少的。蛋白聚糖上的多種GAGs 鏈（如HS、CS）廣泛參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化所涉及的信號(hào)傳導(dǎo)。FUKUNISHI 等［25］發(fā)現(xiàn)MC3T3?E1 細(xì)胞在成骨分化過程中所表達(dá)的GAGs 對(duì)FGF2 以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）?2 的親和力顯著上升，有助于GAGs 結(jié)合并穩(wěn)定這些生長(zhǎng)因子，從而穩(wěn)定地調(diào)控成骨相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

HS 亦能夠促進(jìn)BMP?2 和其受體的結(jié)合，同時(shí)降低頭蛋白（Noggin）對(duì)該通路的拮抗作用，促進(jìn)pSMAD 的激活，從而促進(jìn)成骨［26］。HEP 可與Wnt3a相互作用，進(jìn)而激活肌醇磷脂?3?激酶（phosphati?dylinositol?3?kinases，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein?serine?threonine kinase，AKT）信 號(hào)通路，并且通過Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt?related transcription factor 2，RUNX2）促進(jìn)ALP 的活性，從而發(fā)揮促進(jìn)成骨向分化的作用［27］。除此之外，HEP 亦可正向調(diào)節(jié)BMP 信號(hào)通路活性，同時(shí)下調(diào)Wnt 通路抑制物Dickkopf1（DKK1）和骨硬化蛋白（Sclerostin，SOST）的表達(dá)從而促進(jìn)hMSCs 的成骨分化。

CS 是構(gòu)成骨基質(zhì)最主要的GAGs 之一，其表達(dá)水平隨著MSCs 的成骨分化明顯上調(diào)，其中高硫酸化的硫酸軟骨素?E（Chondroitin sulphate E，CS?E）的表達(dá)水平顯著上升，CS?E 能夠與BMP4 作用促進(jìn)細(xì)胞成骨分化和基質(zhì)礦化［28］。研究還發(fā)現(xiàn)CS?E亦可與上皮型鈣黏蛋白（E?cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白?11（cadherin?11）結(jié)合，降低ERK1/2 的磷酸化，激活SMAD3 和SMAD1/5/8，促進(jìn)成骨分化［29］。

近年來，有學(xué)者提出不同結(jié)構(gòu)的GAGs 能夠影響細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)。HA 是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的GAGs，不經(jīng)過硫化以游離或非共價(jià)復(fù)合體形式參與信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。ZHAO 等［30］在兔MSCs的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高分子量HA能有效促進(jìn)兔MSCs 的成骨分化，同時(shí)MSCs 形成的鈣結(jié)節(jié)量隨HA的分子量升高而增多。雖然其具體作用機(jī)制尚不明確，但研究者認(rèn)為可能與HA 改變BMP 通路傳導(dǎo)有關(guān)，HA 通過下調(diào)BMP?2 的拮抗Noggin 和卵泡抑素（Follistatin）的表達(dá)，增強(qiáng)BMP 通路活性從而促進(jìn)MSCs 的成骨分化能力［31］。但KANEKO等［32］發(fā)現(xiàn)高分子量HA 在低濃度下能夠通過與CD44 結(jié)合抑制BMP?2 誘導(dǎo)的成骨分化，并下調(diào)SMAD1/5/8 的磷酸化水平，提示HA 的分子量與濃度可能存在交互作用。

3 蛋白聚糖在骨組織工程中的應(yīng)用

蛋白聚糖作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性、可降解性、無免疫原性等特點(diǎn)，是目前骨組織工程材料的研究熱點(diǎn)。通過對(duì)蛋白聚糖、GAGs 與多種材料進(jìn)行修飾及交聯(lián)，能夠顯著提高材料的性能，并且將材料制備成便于使用的各種形式。

將GAGs 與合適的生物材料進(jìn)行復(fù)合，模擬骨組織天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步提高其促成骨作用是目前研究的一大熱點(diǎn)。大量研究將CS、HS、HA 等與膠原蛋白、殼聚糖、鈦板等材料進(jìn)行復(fù)合，制成復(fù)合支架、水凝膠等形式的材料，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出優(yōu)越的促成骨作用［21，33］。在一項(xiàng)前瞻性臨床研究中，LORENZ 等［33］將HA 和β?磷酸三鈣混合制成可注射的骨替代物，該材料不僅具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，還具有良好的骨引導(dǎo)能力，可以用于促進(jìn)患者拔牙窩的骨再生，為后期的種植手術(shù)提供有利的骨量基礎(chǔ)，該研究納入21 例患者，行牙拔除術(shù)后均在拔牙窩內(nèi)注射該新型骨替代物。在4 個(gè)月的愈合期后，形態(tài)學(xué)和骨計(jì)量學(xué)檢查表面發(fā)現(xiàn)所有患者的牙槽窩內(nèi)均有大量新骨形成，且后續(xù)種植體的一年存活率達(dá)到100%。水凝膠型HA/β?磷酸三鈣骨替代物能夠明顯減少愈合初期結(jié)締組織的長(zhǎng)入，其多孔結(jié)構(gòu)更是為成骨細(xì)胞的長(zhǎng)入和后續(xù)骨基質(zhì)的生成沉積提供了良好的機(jī)械基礎(chǔ)。HA 在材料中的應(yīng)用亦能加速內(nèi)源性成骨細(xì)胞的募集并促進(jìn)成骨作用，極大提升材料的生物學(xué)特性。目前，GAGs 已被廣泛運(yùn)用到骨移植替代材料中，顯著改善了移植材料的生物活性，有效地促進(jìn)成骨作用，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，GAGs 可結(jié)合并調(diào)控生長(zhǎng)因子的活性，提高其生物利用度，作為生長(zhǎng)因子的替代或補(bǔ)充，解決骨再生中生長(zhǎng)因子應(yīng)用昂貴、釋放不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，為骨組織工程中生長(zhǎng)因子的遞送系統(tǒng)提供了更優(yōu)良的策略，達(dá)到更好的促進(jìn)骨再生效果。CS?GAG 和HS?GAG 作為BMP?2 的載體，均能顯著延長(zhǎng)BMP?2 的釋放時(shí)間［34-35］。還有研究者合成出與BMP?2 具有高親和力的HS3，添加了HS3 的復(fù)合支架能夠顯著維持BMP?2 的生物活性，在27 d 后支架內(nèi)的BMP?2 含量仍有初始含量的58%，是對(duì)照組的三倍，顯著促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化［36］。由此可見，利用GAGs 與生長(zhǎng)因子的高親和力，能夠構(gòu)建生長(zhǎng)因子控釋系統(tǒng)的復(fù)合支架材料，從而為骨組織工程提供新的思路。

4 結(jié)論與展望

目前，利用間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)骨組織再生的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，如何精準(zhǔn)調(diào)控干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以最大程度發(fā)揮其成骨向分化潛能是未來骨組織再生研究的重點(diǎn)。因此，深度揭示干細(xì)胞所處微環(huán)境對(duì)其自我更新和成骨分化動(dòng)態(tài)平衡的影響顯得尤為重要。蛋白聚糖是構(gòu)成間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境的主要成分，廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中，參與了間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的調(diào)控。目前臨床研究已發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖缺陷可導(dǎo)致數(shù)種骨組織發(fā)育異常的遺傳性疾病，基礎(chǔ)研究也揭示了蛋白聚糖是干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要信號(hào)分子，其GAGs 上的硫酸化基團(tuán)也是參與信號(hào)傳導(dǎo)和成骨調(diào)控的重要功能域，其潛在的作用機(jī)制研究尚處于初級(jí)階段，深入揭示明確蛋白聚糖對(duì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，將有利于在未來對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的定向化調(diào)控，從而促進(jìn)成骨分化的臨床應(yīng)用和相關(guān)骨缺損的治療。