不同成熟度煙葉采后抗氧化能力和能量代謝研究

牛浩 徐辰生 王勝雷 王廷賢 楊占偉 李靜超 宋朝鵬 宋江雨

摘 要：為探究抗氧化能力和能量代謝在采后煙葉顏色變化中的作用，準(zhǔn)確把握和理解采收成熟度，在自然條件下采用暗箱試驗(yàn)測(cè)定了不同成熟度采后煙葉的變黃程度、變褐程度、變黃指數(shù)、變褐指數(shù)、丙二醛（MDA）含量、浸出液電導(dǎo)率、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、能量相關(guān)物質(zhì)（ATP、ADP和AMP）含量、能荷和呼吸代謝酶（CCO和SDH）活性。結(jié)果表明，隨著采收成熟度的提高，采后煙葉變黃變褐發(fā)展更快，在試驗(yàn)期間的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）和能量代謝酶（SDH、CCO）高活性時(shí)間持續(xù)更短。同時(shí)，高成熟度采后煙葉在試驗(yàn)中MDA含量和浸出液電導(dǎo)率更較高，且ATP含量高峰出現(xiàn)較早，ATP含量和能荷在試驗(yàn)期間保持高水平的持續(xù)時(shí)間更短。低成熟度采后煙葉變黃變褐發(fā)展更緩慢可能與其較高抗氧化能力和能量代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞：成熟度;能量代謝;采后生理;膜脂過(guò)氧化;抗氧化能力

Abstract： for accurately grasping and understanding harvest maturity and explore the role of antioxidant capacity and energy metabolism in postharvest tobacco leaf discoloration， the harvested tobacco leaves were placed in a dark environment. The changes of yellowing， browning， MDA content， conductivity of leaching solution， adenosine triphosphate （ATP） content， adenosine diphosphate （ADP） content， adenosine triphosphate （AMP） content， energy charge （EG） and activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， succinate dehydrogenase （SDH） and cytochrome oxidase （CCO） of samples were determined during the experiment. With the increase of harvest maturity， the yellowing and browning of postharvest tobacco leaves started earlier and developed faster. During the test， the antioxidant enzymes （SOD， POD， CAT） and energy metabolism enzymes （SDH， CCO） were highly active. At the same time， the high-maturity postharvest tobacco leaves had higher MDA content and leachate conductivity in the experiment， and the ATP content peak appeared earlier， and the ATP content and energy charge remained high during the experiment for a shorter period of time. These results indicated that the slower development of yellowing and browning of tobacco leaves after harvest at low maturity may be related to higher antioxidant capacity and energy metabolism.

Keywords： maturity; energy metabolism; postharvest physiology; membrane lipid peroxidation; antioxidant capacity

采收成熟度是影響煙葉烘烤效果的關(guān)鍵因素。在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)煙葉成熟度把握不準(zhǔn)確是造成烤壞煙現(xiàn)象的重要原因。因此，探討采收成熟度對(duì)采后煙葉顏色變化的影響及其背后的生理機(jī)制可為準(zhǔn)確理解采收成熟度，提高煙葉烘烤質(zhì)量提供理論依據(jù)和參考。近年來(lái)，在園藝作物領(lǐng)域的研究指出果蔬的采后衰老褐變與能量代謝及膜脂過(guò)氧化作用關(guān)系密切[1-4]。在煙草領(lǐng)域的研究也指出膜脂過(guò)氧化作用是影響烘烤特性的關(guān)鍵[5]，過(guò)早和過(guò)高的膜脂過(guò)氧化作用都會(huì)對(duì)煙葉造成不利影響[6]。韓錦峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨成熟度的提高葉內(nèi)抗氧化酶活性下降，細(xì)胞膜通透性變大。王傳義等[8]認(rèn)為成熟度適宜的煙葉烘烤過(guò)程中SOD和POD等保護(hù)酶活性較高，是其烘烤質(zhì)量較高的重要原因。以往的研究主要集中在采收成熟度對(duì)煙葉烘烤特性及烤后品質(zhì)的影響上，對(duì)于采后煙葉變黃變褐的生理機(jī)制知之甚少。基于此，本研究以烤煙品種豫煙13號(hào)為研究對(duì)象，采用暗箱試驗(yàn)的方式研究了不同成熟度采后煙葉黃化褐變的發(fā)展過(guò)程。通過(guò)測(cè)定試驗(yàn)期間煙葉的變黃變褐程度、丙二醛（MDA）含量、浸出液電導(dǎo)率、抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）]、能量相關(guān)物質(zhì)[腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）、腺嘌呤核糖核苷（AMP）]含量、能荷以及細(xì)胞色素氧化酶（CCO）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等呼吸代謝相關(guān)酶的活性，探討不同成熟度采后煙葉顏色變化差異及其生理機(jī)制，為準(zhǔn)確把握采收成熟度，提高煙葉烘烤質(zhì)量提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020年度于河南省洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣石村（N112°3′25″，E34°30′24″）進(jìn)行。供試品種為烤煙豫煙13號(hào)[9]，試驗(yàn)田土壤肥力中等，田間管理均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方法進(jìn)行。選取中部葉（10～13葉位）作為試驗(yàn)材料，按成熟度由低到高設(shè)置M1、M2和M3三種成熟度處理（表1），每處理各200片進(jìn)行暗箱試驗(yàn)。在暗箱試驗(yàn)期間，每隔24 h觀(guān)察變黃變褐情況;每隔48 h隨機(jī)選取3片煙葉，去除主脈后混合第6至第7支脈葉肉用于測(cè)定生理指標(biāo);各項(xiàng)生理指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。試驗(yàn)當(dāng)天記為第0天，進(jìn)行至所有煙葉變褐程度達(dá)到三成及以上時(shí)結(jié)束。

1.2 方法

1.2.1 變黃變褐程度的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]的方法，在黑暗密閉環(huán)境中進(jìn)行暗箱試驗(yàn)。每隔24 h觀(guān)察并記錄煙葉的變黃變褐程度直至所有煙葉的褐變程度均達(dá)到30%為止。變黃指數(shù)從采后第0天觀(guān)測(cè)至試驗(yàn)第7天（共統(tǒng)計(jì)8次），變褐指數(shù)從采后第4天觀(guān)測(cè)至采后第10天（共統(tǒng)計(jì)7次），按照公式（1）和公式（2）分別計(jì)算變黃指數(shù)（Yellowing Index，YI）和變褐指數(shù)（Browning Index，BI）。

其中n為統(tǒng)計(jì)次數(shù)，Y為各次觀(guān)察時(shí)的煙葉變黃比例，B為各次觀(guān)察時(shí)煙葉的變褐比例。

1.2.2 丙二醛含量及滲出液電導(dǎo)率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]中的方法，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，結(jié)果以nmol/g表示。

浸出液電導(dǎo)率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]的方法略有修改。取0.1 g煙葉樣品，用去離子水沖洗5次后吸干表面水分，放入潔凈玻璃試管中加入10 mL蒸餾水浸泡3 h。使用DDS-11A型電導(dǎo)儀測(cè)定浸出液的電導(dǎo)率。

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 SOD、POD、CAT活性均采用南京建成科技生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。定義l mL反應(yīng)體系中NBT（氮藍(lán)四唑）還原抑制百分率達(dá)到50%所對(duì)應(yīng)的SOD酶活性為一個(gè)SOD活性單位U;定義1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中每分鐘470 nm處吸光值變化0.01為一個(gè)POD活性單位U;定義1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中每分鐘催化1 μmol H2O2降解為一個(gè)CAT活性單位U。

1.2.4 ATP、ADP、AMP含量和能荷的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定ATP、ADP、AMP含量[14]。根據(jù)公式（3）計(jì)算能荷（EC）：

1.2.5 煙草葉片線(xiàn)粒體的提取 使用差速離心法提取煙草葉片線(xiàn)粒體[15-16]，有修改。獲得的線(xiàn)粒體沉淀用1.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，內(nèi)含0.3 mol/L甘露醇、1mmol/L EDTA-Na2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的聚乙烯吡咯烷酮）溶解后用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.6 線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）活性測(cè)定 參考陳京京等[16]的方法測(cè)定，以1 g組織在1 mL反應(yīng)液中600 nm處吸光值每分鐘變化0.1為1個(gè)SDH的活性單位U。

1.2.7 線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）活性測(cè)定 參考KAN等[17]方法測(cè)定，以1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中600 nm處吸光值每分鐘變化0.1表示1個(gè)CCO的活性單位U。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析和作圖;采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同成熟度采后煙葉黃化褐變的發(fā)展

從圖1和圖2A中可以看出，隨著采收成熟度的提高采后煙葉的變黃速度明顯提高;M1，M2，M3處理分別在第7天，第5天和第3天達(dá)到了十成黃;在變黃指數(shù)方面M3處理分別比M2和M1高出18.33%和69.04%（圖2B）。由圖2A可知，采后煙葉的變褐速度也隨著采收成熟度的增加有明顯提高;M1，M2，M3處理分別在采后第10天、第8天和第6天達(dá)到了3成褐;在變褐指數(shù)上，M3處理分別比M2和M1處理高出100.00%和500.00%（圖2B）。

2.2 不同成熟度采后煙葉浸出液電導(dǎo)率和MDA含量的變化

如圖3A所示，不同成熟度采后煙葉的滲出液電導(dǎo)率隨采后時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在試驗(yàn)期間，M3處理煙葉的滲出液電導(dǎo)率較高，比M2和M3處理分別高出10.65%和45.15%。同時(shí)，M3處理煙葉滲出液電導(dǎo)率上升較快。在采后第4～10天，M1處理的采后煙葉與M2、M3處理煙葉浸出液電導(dǎo)率差異達(dá)到了顯著水平（p<0.05）。由圖3B可知，各成熟度處理采后煙葉MDA含量變化與浸出液電導(dǎo)率類(lèi)似，均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。M3處理煙葉的MDA含量始終處于較高水平，比M2處理和M1處理分別高出20.53%和48.98%。M3處理煙葉MDA含量增加較快，在整個(gè)試驗(yàn)期間M3處理煙葉的MDA含量顯著高于M2、M1處理（p<0.05）。

2.3 不同成熟度采后煙葉抗氧化酶活性的變化

如圖4所示，各處理煙葉的SOD、POD和CAT活性表現(xiàn)出相似的變化，均在前期迅速升高，而后逐漸下降。隨著采收成熟度的提高，煙葉的抗氧化酶活性有所下降。試驗(yàn)期間，M1和M2處理煙葉的SOD活性比M3處理分別高19.18%和29.04%;POD活性分別高17.59%和25.16%;CAT活性分別高55.30%和81.04%。各處理煙葉SOD、CAT活性均在采后第4天達(dá)到了高峰（圖4A，圖4C），POD（圖4B）活性則在采后第2天達(dá)到了高峰。在采后第4～10天，M1處理煙葉的SOD和POD活性顯著高于M2、M3處理（p<0.05）。CAT活性下降較快，在采后第2～6天表現(xiàn)為M1>M2>M3（p<0.05），其余時(shí)間各處理差異不明顯。

2.4 不同成熟度采后煙葉ATP、ADP、AMP含量及能荷的變化

由圖5A可以看出，隨著采后時(shí)間的延長(zhǎng)，各成熟度煙葉的ATP含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在剛采收時(shí)，M3處理顯著高于M2、M1處理（p<0.05）。隨后，各處理煙葉的ATP含量均出現(xiàn)明顯升高。M1，M2和M3處理采后煙葉的ATP含量分別在采后第6天、第4天和第2天達(dá)到高峰。之后，各處理ATP含量均出現(xiàn)下降，但M2、M3處理下降得更為迅速。在采后第6～10天，M1處理采后煙葉的ATP含量顯著高于M2和M3（p<0.05）。各處理采后煙葉ADP含量的變化與ATP類(lèi)似，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖5B）。在剛采收時(shí)，M3處理煙葉的ADP含量顯著高于M2、M3處理（p<0.05）。隨后各處理煙葉的ADP含量開(kāi)始下降，M3處理下降最為迅速，M2次之，M1處理曲線(xiàn)最為平緩。如圖5C所示，隨著采后時(shí)間的延長(zhǎng)，各成熟度采后煙葉的AMP含量總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。在剛采收時(shí)，M1、M2處理采后煙葉的AMP含量顯著高于M3處理（p<0.05）。隨后各處理AMP含量開(kāi)始緩慢上升，M1、M2處理上升較緩，M3處理上升幅度較大。

由圖5D可以看出，隨采后時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理采后煙葉的能荷值呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)。在剛采收時(shí)，M3處理的能荷值顯著高于M2、M3（p<0.05）。M3處理采后煙葉的能荷值在采后第2天達(dá)到高峰，而M1和M2處理均在第6天達(dá)到高峰。與M2和M3相比，M1處理采后煙葉在試驗(yàn)中后期保持著相對(duì)較高能荷水平。

2.5 不同成熟度采后煙葉SDH活性的變化

由圖6可以看出，采后煙葉的SDH活性基本呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在剛采收時(shí)，M3處理煙葉的SDH活性最高，M2次之，M1最低。在采后2 d，各處理煙葉的SDH活性明顯上升，此時(shí)M2，M3處理的煙葉SDH活性比M1分別高出12.41%和26.37%（p<0.05）。之后各處理采后煙葉SDH活性呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì)，且M2、M3處理下降得更為快速。在采后4～10 d，M1處理采后煙葉SDH活性分別比M2處理和M3處理高出10.18%和12.91%。各處理間煙葉SDH活性分別在采后第2天、第10天差異達(dá)到了極顯著水平（p<0.01）

2.6 不同成熟度采后煙葉CCO活性的變化

由圖7可以看出，各處理采后煙葉CCO活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在剛采收時(shí)，M3處理采后煙葉的CCO活性最高，M2次之，M1最低。在采后第2天，3個(gè)處理煙葉的CCO活性均達(dá)到了峰值，此時(shí)M3處理煙葉的CCO活性最高，分別比M2和M1高出20.35%和12.22%（p<0.05）。隨后各處理CCO活性呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，在采后4～10 d表現(xiàn)為M1>M2>M3。各處理間CCO活性分別在采后第2、4、6天差異達(dá)到了顯著水平（p<0.05）。

3 討 論

采后煙葉的變黃變褐過(guò)程涉及一系列復(fù)雜的生理生化機(jī)制[18-21]。由于斷絕了外界的水分和營(yíng)養(yǎng)供給，采收后煙葉處于一個(gè)多重的逆境環(huán)境之中，極易引起活性氧的積累[22]?；钚匝醯姆e累可以啟動(dòng)并加速膜脂過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞細(xì)胞膜完整性，最終導(dǎo)致煙葉黃化褐變的發(fā)生[23]。然而，煙葉可以自然產(chǎn)生抗氧化酶以對(duì)抗氧化損傷[24]。在本研究中隨著采收成熟度的增加，采后煙葉的SOD、POD和CAT在試驗(yàn)期間的活性有所降低，導(dǎo)致其MDA含量和滲出液電導(dǎo)率較高，加速了煙葉的變黃變褐過(guò)程，這與前人的研究結(jié)果相一致[25]。

在果蔬儲(chǔ)藏領(lǐng)域越來(lái)越多的研究指出膜脂過(guò)氧化程度的發(fā)展與能量代謝密切相關(guān)[26]，認(rèn)為能量虧缺是引起果蔬腐爛變質(zhì)的重要原因[27]。在本研究中，采后煙葉的ATP和ADP含量首先呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，可能是因?yàn)樵诓墒粘跗谛枰嗟哪芰縼?lái)應(yīng)對(duì)離體的不利環(huán)境[28]。隨著逆境的不斷加深和煙葉內(nèi)部呼吸底物的不斷減少，新產(chǎn)生的ATP已經(jīng)不能滿(mǎn)足機(jī)體對(duì)于ATP需求，因而ATP含量和ADP含量開(kāi)始下降，AMP含量開(kāi)始上升。與M3處理相比，M1和M2處理能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間的高能荷水平，同時(shí)抗氧化酶的活性更高，膜脂過(guò)氧化發(fā)展得更慢，這說(shuō)明較高的能量水平可能強(qiáng)化了機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)。同時(shí)隨著采收成熟度的提高，ATP高峰出現(xiàn)時(shí)間被提前，幾乎是同時(shí)煙葉也達(dá)到了十成黃，提示變黃的發(fā)生可能與能量代謝高峰出現(xiàn)有關(guān)，其原因可能是較早出現(xiàn)的能量高峰過(guò)多地消耗了煙葉中的能源物質(zhì)[29]，導(dǎo)致后續(xù)能量的相對(duì)缺乏，加速了采后煙葉變黃的過(guò)程。在庫(kù)爾勒香梨中的研究也出現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果[30]。而ATP含量和能荷水平在褐變發(fā)生之前就已經(jīng)出現(xiàn)了下降，說(shuō)明ATP含量和能荷水平低于一定的閾值時(shí)可能引起褐變的發(fā)生;反過(guò)來(lái)，褐變的發(fā)生又促進(jìn)了ATP含量和能荷水平的下降。這種現(xiàn)象在芒果[31]和番木瓜[32]中也有類(lèi)似報(bào)道。有趣的是，盡管M1、M2處理煙葉ATP和ADP含量在試驗(yàn)?zāi)┢谟兴陆?，但在試?yàn)結(jié)束時(shí)的能荷水平仍然高于剛采收時(shí)，但此時(shí)煙葉均已發(fā)生褐變，這似乎與果蔬儲(chǔ)藏中“能量缺乏引起腐爛”的觀(guān)點(diǎn)相矛盾。其原因可能是盡管煙葉的能荷水平被提升了，但由于逆境環(huán)境所帶來(lái)的負(fù)擔(dān)（如強(qiáng)化抗氧化酶系統(tǒng)），煙葉組織對(duì)于能量的需求提升得更多，這造成了在煙葉組織中能量的相對(duì)缺乏，造成了煙葉褐變的發(fā)生。

已有研究報(bào)道，采后果實(shí)儲(chǔ)藏過(guò)程中腐爛褐變的發(fā)生與能量代謝相關(guān)酶活性的下降有關(guān)[33-34]。琥珀酸脫氫酶（SDH）是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶類(lèi)，可為真核細(xì)胞線(xiàn)粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈傳遞和提供電子，在氧化磷酸化活動(dòng)中扮演著重要的角色[35]。細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的末端氧化酶類(lèi)，其主要功能室將來(lái)自于呼吸底物的電子傳遞給分子態(tài)氧，是維持氧化磷酸化作用的關(guān)鍵酶類(lèi)[36]。在本研究中，各處理采后煙葉的SDH和CCO活性均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與ATP含量的變化相一致。與M1，M2處理相比，M3處理采后煙葉的SDH和CCO活性在剛采收時(shí)上升得更高，這表明高成熟度煙葉對(duì)于采摘做出的響應(yīng)更為強(qiáng)烈。但相較于M3處理，M1和M2處理采后煙葉SDH和CCO活性在整個(gè)試驗(yàn)期間維持得更高，導(dǎo)致了其高ATP、ADP含量和高能荷水平狀態(tài)能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)褐變發(fā)生得也更晚。在果實(shí)儲(chǔ)藏研究中也報(bào)道了施用茉莉酸甲酯提高果實(shí)能量代謝酶活性來(lái)抑制果實(shí)褐變的類(lèi)似效果[37-38]。究其原因，可能是未熟煙葉中的內(nèi)含物質(zhì)積累更豐富[39]，為長(zhǎng)時(shí)間的高能量代謝活動(dòng)提供了物質(zhì)保障。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著采收成熟度的增加，采后煙葉的變黃變褐過(guò)程明顯加快。較低成熟度的采后煙葉在試驗(yàn)期間抗氧化酶和能量代謝酶活性較高，膜脂過(guò)氧化發(fā)展較慢，ATP含量和能荷能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間高水平狀態(tài)，表明采后煙葉的變黃變褐過(guò)程與抗氧化能力和能量代謝活動(dòng)存在著一定的關(guān)聯(lián)。本研究可為準(zhǔn)確理解和把握采收成熟度提供理論依據(jù)和參考。

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