高濃度納米銀的制備及其抗菌效果評價*

張金偉，王 瑤，溫永漢，孫宏斌，余國樞，陳武勇

(1. 四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室， 成都 610065； 2. 四川達威科技股份有限公司， 成都 610041； 3. 廣東省江門市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 江門 529000； 4. 廣東盛方化工有限公司，廣東 江門 529162)

0 引 言

納米銀通常指粒徑小于100 nm的金屬銀單質(zhì)，由于納米銀的表面效應(yīng)，同等濃度下其抑菌能力明顯強于銀單質(zhì)，而且不會產(chǎn)生耐藥性，具有低毒性和強抗菌活性等優(yōu)點[1-2]。目前，在皮革、裘皮、造紙、包裝、紡織和涂料等行業(yè)中，納米銀已被廣泛使用[3-8]。納米銀的制備主要有物理方法、化學(xué)還原和生物還原等方法[9]，其中化學(xué)合成法操作簡單，目前較為常用。由于納米銀表面能較高，易團聚沉降，制備時往往需使用保護劑或穩(wěn)定劑防止其團聚，常用的保護劑有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和明膠等[10]。表面活性劑為具有雙親性基團的長鏈分子，其長鏈的位阻效應(yīng)可有效防止納米粒子發(fā)生團聚，同時在溶液中形成的膠束可為納米銀的生成提供模板[11]。其中，陽離子表面活性劑常被作為模板和助穩(wěn)定劑制備納米材料[12]。

以苯扎溴銨為保護劑、硼氫化鈉為還原劑，采用模板法制備的納米銀抗菌劑中銀濃度為2.4×10-5g/mL[13]，由于苯扎溴銨本身就是一種具有殺菌能力的陽離子表面活性劑，該方法制備的納米銀具有良好的抗菌效果，并且可與膠原蛋白和角蛋白產(chǎn)生相互作用，可用于生產(chǎn)和加工具有持久抗菌性能的皮革和裘皮產(chǎn)品[14-17]。在納米銀抗菌劑的使用過程中，由于其有效物含量較低，為達到理想的抗菌效果，不僅使用時用量大，產(chǎn)品在包裝和運輸上的費用也會增加，最終導(dǎo)致綜合使用成本較高，極大地制約了納米銀抗菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用。因此，在現(xiàn)有技術(shù)方案的基礎(chǔ)上制備有效物濃度更高的納米銀就十分必要。

目前，關(guān)于提高納米銀濃度的方法主要是使用保護劑和增稠劑。保護劑分子在納米銀粒子表面形成吸附層，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，有效阻止顆粒間相互聚集，提高溶液的穩(wěn)定性[18]。在納米銀溶液中加入聚氨酯增稠劑，可以顯著提高其中銀的濃度[19]，但會使納米銀粘度大幅增加，成本也較高。苯扎溴銨是一種表面活性劑，其在溶液中濃度超過臨界膠束濃度時會產(chǎn)生膠束包裹納米銀，防止納米銀團聚，通過改變苯扎溴銨的用量，有望在不明顯改變?nèi)芤盒再|(zhì)的前提下大幅提高納米銀濃度，從而降低納米銀的用量和物流成本，為納米銀抗菌劑的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 試劑

硝酸銀、硼氫化鈉，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；苯扎溴銨，5%水溶液，南昌白云藥業(yè)有限公司；異噻唑啉酮(2-甲基異噻唑啉酮與5-氯-2甲基異噻唑啉酮質(zhì)量比為1∶3)，總含量為14%，大連匯邦化學(xué)有限公司。

1.1.2 儀器

DHL-B電腦定時恒流泵，上海青浦滬西儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；Lambda 25紫外可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司；NanoZS激光粒度儀，英國Malvern儀器公司。

1.2 樣品制備方法

1.2.1 高濃度納米銀的制備

以現(xiàn)有納米銀制備方法為基礎(chǔ)(銀濃度為2.4×10-5g/mL)[13]，等比例地提高各試劑的用量為基礎(chǔ)用量的10倍，其中保護劑苯扎溴銨的用量擴大10倍后再增加1倍(1B)、3倍(3B)、4倍(4B)、5倍(5B)、6倍(6B)、7倍(7B)，具體配方見表1，以研究保護劑用量對高濃度納米銀溶液粒徑和穩(wěn)定性的影響，制定最佳工藝。

表1 不同苯扎溴銨用量下高濃度納米銀溶液制備配方

1.2.2 納米銀抗菌劑的制備

納米銀與有機抗菌劑復(fù)配，可以明顯提高其抗菌性能[20]。為進一步提高納米銀的抗菌效果，利用高效、低毒的有機抗菌劑異噻唑啉酮與所得納米銀進行復(fù)配，制備納米銀抗菌劑。將高濃度納米銀溶液(銀濃度為2.4×10-4g/mL)，與異噻唑啉酮溶液按照100∶0.8(w/w)的比例進行復(fù)配。復(fù)配時將異噻唑啉酮在攪拌條件下緩緩加入納米銀溶液，滴加完成后繼續(xù)攪拌10 min即完成復(fù)配。

1.3 分析測試方法

1.3.1 紫外-可見光譜測試

用Lambda 25紫外可見分光光度計，設(shè)定測試溫度為25 ℃，掃描速度為240 nm/min，在300～800 nm的波長范圍內(nèi)掃描并記錄納米銀溶液的吸收光譜曲線。

1.3.2 動態(tài)光散射測試

平均粒徑及Zeta-電位分析用Nano ZS激光粒度儀對納米銀溶液的平均粒徑和Zeta電位值進行測定，取3次測試結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果，測試溫度為25 ℃，測試前設(shè)定溫度下平衡3 min。

1.3.3 透射電鏡分析

用JEM-100CXII透射電鏡，在加速電壓為200 kV的條件下觀測納米銀的粒徑大小和形貌。測試前，將1-2滴的納米銀溶液滴到孔徑為200目的銅網(wǎng)上，自然干燥后即可進行測試。

1.3.4 納米銀復(fù)合抗菌劑抗菌性能的測定

配制牛肉膏蛋白胨和孟加拉紅培養(yǎng)基[21]，并在121 ℃條件下，滅菌21 min備用。配制菌液濃度為5×105～106cfu/mL的細菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液、菌體濃度為1.0×105～106cfu/mL的黑曲霉和粘性紅圓酵母菌懸液。

10 mL培養(yǎng)基與納米銀抗菌劑混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，控制培養(yǎng)基中納米銀抗菌劑濃度依次為1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL；待培養(yǎng)基凝固后加入1 mL的菌懸液，均勻涂布在培養(yǎng)基表面；最后，將培養(yǎng)皿置于37 ℃和90%相對濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察微生物生長情況，運用平板計數(shù)法計算菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同保護劑用量對納米銀穩(wěn)定性的影響

2.1.1 紫外-可見光吸收光譜分析

圖1為不同苯扎溴銨用量下高濃度納米銀溶液的紫外-可見吸收光譜圖。

圖1 不同苯扎溴銨用量下納米銀溶液的紫外-可見光譜圖Fig 1 UV-vis spectra of nano-sliver solution prepared with different benzalkonium bromide dosage

從圖1中可見，當納米銀溶液的濃度提高10倍后，苯扎溴銨保護劑用量在基礎(chǔ)用量擴大10倍后再增加1、3、4、5、6和7倍時，其最大吸收波長分別對應(yīng)為417 、412 、412、413 、414 和414 nm。當保護劑用量最少(1倍)時，其最大吸收波長為417 nm，出現(xiàn)了較明顯的紅移，且與之對應(yīng)的吸光度值相對較低，半峰寬較大，說明在該溶液中，納米銀粒子粒徑較大，溶液中膠體粒子的均一性較差、穩(wěn)定性較低[22]。在其他苯扎溴銨用量下生成的納米銀最大吸收波長在412～414 nm，且不同樣品的半峰寬相近，說明此時溶液中納米銀粒子分散性和均一性都較好。

當溶液中苯扎溴銨含量較少時，所形成的膠束無法完全負載納米銀，也不足以有效防止納米粒子的團聚，因此納米銀膠團粒徑增大，溶液的穩(wěn)定性變差，紫外特征吸收峰紅移。隨著溶液中加入的苯扎溴銨含量的增加，陽離子型的苯扎溴銨分子的親水基端向外與水分子作用，疏水基端向內(nèi)與納米銀粒子相互吸附作用，在納米銀粒子周圍形成了有效的空間位阻，阻止了納米銀粒子之間的團聚作用，最終生成了較為均一的納米銀粒子，膠體穩(wěn)定性也有所改善。

2.1.2 激光粒度儀分析

圖2為不同苯扎溴銨用量對納米銀粒子粒徑和Zeta電位的影響。

圖2 苯扎溴銨用量對納米銀粒子粒徑和Zeta電位的影響(左側(cè)為粒徑，右側(cè)為Zeta電位)Fig 2 Influence of benzalkonium bromide dosage on average particle size and Zeta potential of nano-sliver particles (particle size on left and Zeta potential on right)

從圖2中左側(cè)的粒徑結(jié)果可知，在10倍基礎(chǔ)濃度納米銀溶液中，當苯扎溴銨的用量在基礎(chǔ)用量擴大10倍的基礎(chǔ)上再增加1倍(1B)時，所生成的納米銀粒子的平均粒徑高達64.73 nm，原方法中所制備納米銀的濃度為26 nm[13]，這是因為較少用量的苯扎溴銨難以形成有效的空間位阻，不能有效抑制納米銀膠團的聚集，因此納米銀粒子粒徑增大。隨著苯扎溴銨用量的增加(4B、5B)，對應(yīng)的納米銀溶液中所生成的納米銀粒子粒徑較小，與原濃度條件下差別不大，這是因為苯扎溴銨分子與納米銀粒子相互作用后，在溶液中形成了有效的空間穩(wěn)定層，降低了納米銀粒子之間的團聚。當保護劑用量繼續(xù)增加后(7B)，納米銀粒徑又出現(xiàn)明顯的增加，這可能是因為當溶液中苯扎溴銨過量時，苯扎溴銨分子之間相互纏結(jié)，在一定程度上削弱了膠團的空間位阻，苯扎溴銨形成的膠束無法有效地負載納米銀粒子，使得粒子之間出現(xiàn)了軟團聚，導(dǎo)致納米銀粒子粒徑增大。

Zeta電位又稱ζ-電位或動電電位，是指在外電場的作用下，分散粒子的穩(wěn)定層與擴散層發(fā)生相對移動時，滑動面(或剪切面)的電位，是膠體體系的電化學(xué)性質(zhì)的主要指標之一，一般來說Zeta電位絕對值越大，則該膠體溶液的穩(wěn)定性越好。圖2中右側(cè)Zeta電位可知，納米銀溶液的Zeta電位值隨著苯扎溴銨用量的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。當苯扎溴銨用量為1B和3B時，Zeta電位絕對值相對較低(低于30 mV)，說明此時納米銀溶液中膠團穩(wěn)定性較差；當苯扎溴銨用量增加到4B-5B時，Zeta電位絕對值分別為44.37和40.12 mV，說明該保護劑用量下，苯扎溴銨分子與納米銀粒子作用后，納米銀膠團表面所帶電荷增加，雙電層變厚，所制備的納米銀溶液具有較高的穩(wěn)定性；當保護劑用量繼續(xù)增加到6B-7B時，所制備的納米銀溶液Zeta電位絕對值開始下降，說明包裹在納米銀粒子表面的苯扎溴銨分子達到飽和，繼續(xù)增加保護劑，苯扎溴銨分子之間會發(fā)生一定纏結(jié)作用，不利于提高納米銀的穩(wěn)定性。

2.1.3 透射電鏡分析結(jié)果

從6個不同的苯扎溴銨用量所得樣品中選取了具有代表性的1B、4B和7B納米銀溶液進行透射電鏡圖譜的掃描，所得結(jié)果如圖3所示。

當苯扎溴銨用量為1B時，納米銀的粒徑在10 nm左右，但是大量的納米銀粒子團聚在一起，形成了較大的納米銀簇(圖3(a))；當苯扎溴銨用量為4B時，納米銀平均粒徑為20 nm左右，且具有較好的分散性和均一性(圖3(b))，當保護劑用量為7倍時，納米銀粒徑為40 nm左右且吸附團聚在一起，形成了較大的納米銀簇，納米銀的粒徑也不均一(圖3(c))。

圖3 不同苯扎溴銨用量下納米銀的透射電鏡圖Fig 3 TEM images of nano-sliver prepared with different benzalkonium bromide dosage

根據(jù)上述結(jié)果，可以得出了苯扎溴銨與納米銀粒子的作用的機理，如圖4所示。

圖4 苯扎溴銨與納米銀粒子作用示意圖Fig 4 Schematic of nano-silver particles capped with benzalkonium bromide

由圖4所示，當Ag+得到電子生成Ag原子后，如果沒有保護劑將形成單質(zhì)銀沉淀，苯扎溴銨加入后，其分子的親水端向外與水介質(zhì)接觸，疏水基與銀粒子發(fā)生吸附作用將其包裹在內(nèi)，形成有效的空間穩(wěn)定層而產(chǎn)生納米銀粒子。當苯扎溴銨分子過少時(圖4(a))，苯扎溴銨分子不足以將溶液中的納米銀粒子包裹完全，較多裸露的納米銀粒子通過自身的布朗運動，相互吸附團聚，使得溶液的穩(wěn)定性降低。隨著苯扎溴銨濃度的增加，納米銀粒子外形成了有效的空間穩(wěn)定層，阻止了納米銀粒子之間的吸附作用，從而提高了膠團的穩(wěn)定性(圖4(b))。當苯扎溴銨過量時，苯扎溴銨分子之間相互纏結(jié)，極大的擠壓和破壞納米銀粒子外部的空間穩(wěn)定層，使得納米銀粒子吸附團聚，納米銀粒子平均粒徑增大，溶液穩(wěn)定性降低(圖4(c))。

2.2 納米銀抗菌劑的抗菌效果評價

為考察納米銀抗菌劑的抗菌性，選擇金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、粘性紅圓酵母(Rhodotorulamucilaginosa)和黑曲霉(Aspergillusniger)等4種革制品中常見菌株[23- 24]，對每種菌株的最小抑菌濃度(MIC)進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 納米銀抗菌劑對不同菌株的最小抑菌濃度

由表2可知，納米銀抗菌劑對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌效果最好，其最小抑菌濃度僅為1.0 μg/mL，對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)也具有很好的抑菌效果，其最小抑菌濃度為2.0 μg/mL，納米銀抗菌劑對真菌類的黑曲霉和粘性紅圓酵母的抑制效果較細菌稍差，其最小抑菌濃度均為4.0 μg/mL。上述結(jié)果表明納米銀與異噻唑啉酮復(fù)配后制備的抗菌劑殺菌能力強、抗菌譜廣。雖然實驗結(jié)果中抗菌劑對4類菌株的最小抑菌濃度稍有差異，在實際使用納米銀抗菌劑生產(chǎn)抗菌皮革制品時，其用量大于4.0 μg/mL時即可對所有菌株都起到良好抑菌作用。

3 結(jié) 論

通過考察不同用量的保護劑苯扎溴銨對納米銀溶液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)保護劑用量為8×10-3g/mL時，所制備的納米銀溶液具有較好的穩(wěn)定性，納米銀膠團分散性和均一性較好，平均直徑約30 nm。該納米銀與異噻唑啉酮按質(zhì)量比100∶0.8復(fù)配后制得的納米銀抗菌劑具有廣譜高效的抗菌效果，對大腸桿菌的最小抑菌濃度僅為1.0 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2.0 μg/mL，對黑曲霉和粘性紅圓酵母的最小抑菌濃度為4.0 μg/mL。本研究所制備的納米銀濃度為2.4×10-4g/mL，比文獻報道的濃度提高了10倍，有利于促進該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和推廣應(yīng)用。