基于血液DNA甲基化在肝癌診斷中的研究進展

李芳芳, 陶紫薇, 沈永利, 翁亞麗

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 感染病科, 江蘇 南京, 210029)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死病因中高居第3位，世界衛(wèi)生組織(WHO)預測2030年將有100萬人死于肝癌[1]。據統(tǒng)計，超過一半新發(fā)和死亡患者在中國[2]。肝癌的主要危險因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染，丙型肝炎病毒(HCV)感染，酒精攝入及代謝綜合征[3]。巴塞羅那肝癌分期系統(tǒng)(BCLC)是目前應用最為廣泛的分期系統(tǒng)，該方案將肝癌的臨床分期分為最早期、早期、中期、晚期和終末期，并為每個階段提供治療建議[1]。早期診斷是改善肝癌預后的重要方式。歐洲肝臟協(xié)會對于非肝硬化患者，或者經影像學不能診斷為肝癌的肝硬化患者，推薦通過病理來確診肝癌[3]，但穿刺活檢會發(fā)生出血及腫瘤針道轉移等風險。此外，肝癌是最具異質性特征的腫瘤之一，因此單一的病灶活檢并不能代表整個腫瘤病變的異質性[4]。目前，肝癌的主要血液學標志物仍然是甲胎蛋白(AFP)，但其診斷肝癌的敏感度和特異度均難以滿足臨床需求，約30%肝癌患者血清AFP值可處于正常范圍值內[5]。液體活檢是診斷腫瘤的一種非侵入式無創(chuàng)檢測技術，主要檢測原位腫瘤或轉移灶釋放到體液中的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、循環(huán)游離DNA(cfDNA)及循環(huán)微小核糖核酸(miRNA)。健康人群中, cfDNA主要來源于凋亡細胞，而腫瘤患者中的cfDNA主要由腫瘤來源的DNA組成。研究[6-9]顯示, cfDNA在診斷肝癌及預測肝癌預后方面具有潛在價值。DNA甲基化是一種表觀遺傳學的基因修飾形式，異常的基因甲基化被認為是引發(fā)肝癌的主要機制之一[10-11]。一項研究[12]表明，通過甲基化反卷積分析，肝癌患者肝臟釋放入血漿的DNA中位百分比顯著高于對照組(分別為24%和11%)。本文就cfDNA甲基化研究現狀及其作為肝癌生物標志物方面的最新進展進行綜述。

1 DNA甲基化標志物在肝癌及其他癌癥

檢測中的現狀

引起癌癥的基因突變種類繁多[13]，即使在同一種腫瘤類型中，不同患者的突變譜也不盡相同。SCHULZE K等[14]表明突變影響端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子、鈣黏蛋白相關蛋白β1(CTNNB1)和腫瘤抑制因子p53(TP53)等多種基因。基因突變的多樣性給基于DNA序列變化的癌癥診斷帶來了難度。與基因突變相比，癌癥中DNA甲基化變化具有穩(wěn)定性，有可能成為生物標志物開發(fā)的一個有前景的新靶點。MONTAVON C等[15]發(fā)現HOXA9啟動子和EN1啟動子分別在95%和80%的卵巢癌患者中甲基化。DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應，作為表觀遺傳學水平基因表達的核心機制，DNA甲基化在肝癌發(fā)生中起重要作用[11，16-17]。ZHANG C等[18]對144項病例對照研究進行了薈萃分析并得出結論，異常的DNA甲基化可能成為預測和診斷肝癌的有效生物標志物，并且證實了RAS相關結構域家族1A(RASSF1A)、谷胱甘肽硫轉移酶P1(GSTP1)、p16等異常甲基化基因與肝癌的發(fā)生密切相關。腫瘤的發(fā)展一般伴隨著原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化[19], 血液中也可以檢測到類似的變化，這表明基于血液的DNA甲基化標志物可作為新的篩查標記或危險分層的標記[20]。近10年，針對cfDNA甲基化的研究數量逐年遞增。研究[21]通過大數據分析循環(huán)游離DNA甲基化，構建出了一種分類器，能夠識別出血液樣本中腫瘤來源的DNA，并且完成腫瘤分類。外周血中SEPT9甲基化已被美國食品藥品監(jiān)管管理局(FDA)批準用于結直腸癌的檢測, PRESEPT研究[22]顯示mSEPT9檢測結直腸癌的敏感度為48.2%, 特異度為91.5%。LIGGETT T E等[23]通過分析3組隊列病人的血漿樣本cfDNA基因甲基化模式，區(qū)分出健康個體和良性、惡性卵巢腫瘤患者，且均具有很高的敏感度和特異度。因此，基于血液的DNA甲基化能夠成為診斷肝癌的可靠的非侵入性方法。

2 cfDNA甲基化標志物在肝癌診斷中

的作用

2.1 單個DNA甲基化標志物檢測

DNA甲基化作為最常見的表觀遺傳修飾，已被報道其會影響肝癌的基因組穩(wěn)定性和腫瘤抑制基因的轉錄沉默[24-28]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(CDKN2A)是一種被廣泛接受的腫瘤抑制基因; 1999年, WONG I H等[29]首次在肝癌患者血漿和血清中發(fā)現CDKN2A(編碼p16的基因)啟動子高甲基化，其主要利用DNA甲基化特異性的聚合酶鏈式反應(PCR), 分析了腫瘤相關p16基因在肝癌患者中的甲基化狀態(tài)，結果發(fā)現73%(16/22)的肝癌組織中出現p16基因異常甲基化，在這16例患者中, 81%(13/16)的患者血液中也檢測到類似的甲基化改變。一項旨在評價體液(血清、血漿和全血)中RASSF1A啟動子甲基化診斷肝細胞癌(HCC)效能的薈萃分析[30], 納入了302例肝癌患者和250例慢性肝病患者，結果顯示RASSF1A啟動子甲基化診斷肝細胞癌的敏感度和特異度分別為0.70(95%CI: 0.49～0.85)和0.72(95%CI: 0.54～0.85), 受試者工作曲線下面積(AUROC)為0.77(95%CI: 0.73～0.81)。一項研究[31]評估了血漿中SEPT9啟動子甲基化(mSEPT9)診斷肝癌的效能，共計納入104例肝癌患者及174例健康人群，結果表明mSEPT9啟動子甲基化在鑒別診斷肝癌組與健康對照組時，敏感度為82.7%, 特異度為96.0%, AUROC為0.961(95% CI: 0.933～0.989), 顯著優(yōu)于AFP(AUROC 為0.881, 敏感度為57.7%, 特異度為 98.3%)。此外，研究者進一步將肝癌患者按照BCLC分期進行分期，早期組包括A期及B期患者，共73例; 發(fā)現mSEPT9用于診斷早期肝癌患者同樣具有較高的診斷價值(AUROC為0.946, 95%CI: 0.907～0.985, 敏感度為76.7%, 特異度為96.0%)。

其他單基因標志物研究[32-38]表明，GSTP、TBX2、FHIT、SCAND3、SOX1、VIM、SOCS3、SGIP1等單個基因的高甲基化在肝癌的檢測中具有潛在臨床價值。TIAN M P等[32]發(fā)現血液中的GSTP啟動子高甲基化與HCC的發(fā)病率呈正相關，且其與苯并芘(一種化學致癌物)的肝細胞毒性密切相關; WU H C等[33]發(fā)現血液中的TBX2高甲基化與HCC風險增加相關; IYER P等[34]發(fā)現肝癌患者血液中FHIT甲基化頻率明顯增高。

此外, DNA低甲基化可激活原癌基因，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[39-40]。有研究者采用DNA低甲基化作為診斷肝癌的標志物，并取得了較好的結果。RAMZY I I等[41]發(fā)現肝癌患者血清中LINE-1的低甲基化概率顯著高于對照組。CHAN K C等[42]使用鳥槍法大規(guī)模并行亞硫酸鹽測序方法對血漿中全基因組的低甲基化分析，發(fā)現其是檢測肝癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、平滑肌肉瘤和神經內分泌癌等多種癌癥的有效方法。在肝癌的診斷中, AUROC為0.96(95%CI: 0.91～1.00), 但是其檢測方法較為復雜，有待進一步簡化。

DNA甲基化與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關系，大部分關于肝癌的DNA甲基化研究都集中于高甲基化。以上研究結果提示，單基因高甲基化在肝癌的診斷方面可能比AFP更具敏感度和特異度，并有望成為肝癌的有效的新型血液學生物標志物。

2.2 多個DNA甲基化標志物聯(lián)合檢測

近年來，研究證明使用多基因甲基化標志物聯(lián)合檢測肝癌能夠顯著提高診斷效能。WEN L等[43]利用一種甲基化CpG短串聯(lián)擴增與測序技術(MCTA-Seq)檢測肝癌患者、肝硬化患者及正常人的血漿樣本中的腫瘤特異度CPG島，共鑒定出2種類型的標志物用于肝癌的診斷。Ⅰ型標志物(RGS10、ST8SIA6、RUNX2和VIM)具有高特異度; Ⅱ型標志物[TMC8(i)、SCT、TBX2等15個基因]在肝癌發(fā)生早期即可釋放入血，具有高敏感度。此項研究中, 2種類型標志物的聯(lián)合檢測對HCC患者、肝硬化患者及健康人群的診斷敏感度達94%, 特異度達89%, 并且成功診斷15例AFP陰性的HCC患者，該研究表明多種DNA甲基化的聯(lián)合檢測有望提高AFP陰性的肝癌患者的診斷效能，但需要擴大樣本量進一步驗證。

一項納入1098位肝癌患者及835位健康人群的大型研究[44], 成功篩選出用于檢測肝癌的10個甲基化標志物(BMPR1A、PSD、ARHGAP25、KLF3、PLAC8、ATXN1、Chr 6∶170、Chr 6∶3、ATAD2及Chr 8∶20), 其在訓練隊列對HCC診斷的敏感度為85.7%, 特異度為94.3%, 在驗證隊列中診斷的敏感度為83.3%, 特異度為90.5%。并證實了該診斷模型與腫瘤負荷、治療應答、腫瘤分期均相關。KISIEL J B等[45]利用簡化代表性重亞硫酸鹽測序鑒定出27個候選基因。Ⅱ期臨床研究中納入了95例HCC患者, 51例肝硬化患者和98例健康對照人群，發(fā)現其中6個循環(huán)游離DNA甲基化標志物(HOXA1、EMX1、AK055957、ECE1、PFKP和CLEC11A)聯(lián)合檢測HCC的敏感度為95%, 特異度為92%; 該基因panel能夠檢測出75%(3/4)的0期肝癌患者和93%(39/42)的A期肝癌患者(BCLC分期); 此研究中基因panel診斷肝癌效果顯著優(yōu)于AFP(P<0.001)。

上述研究證明，聯(lián)合診斷的模型與肝癌的分期相關，且在診斷早期肝癌(如BCLC分期0和A期)仍有較高的準確度。因此，多個DNA甲基化聯(lián)合是可靠的無創(chuàng)生物標志物，對于早期發(fā)現肝癌有重要意義。

2.3 DNA甲基化標志物聯(lián)合AFP

近年來，新型標志物聯(lián)合AFP診斷肝癌已表現出極大的優(yōu)勢。TIAN M M等[46]檢測350份血清樣本的HCCS1啟動子甲基化及AFP水平，發(fā)現兩者聯(lián)合對診斷HBV相關性肝癌的敏感度達81.7%, 顯著高于AFP單獨檢測。DONG X Y等[47]納入了HBV相關性肝癌患者98例，肝硬化患者75例，慢性乙型肝炎患者90例及健康對照80例，檢測血清中多種基因甲基化水平，結果顯示RASSF1A、BVES及 HOXA9三種基因panel聯(lián)合AFP, 其診斷HBV相關性肝癌的敏感度為83.7%, 特異度為78.9%, AUROC達0.852。學者[48-49]認為HBV相關性肝癌的發(fā)病機制涉及表觀遺傳學，尤其是DNA甲基化，且血液中游離的甲基化基因的動態(tài)變化特征與HBV相關性肝癌的發(fā)展過程有相關性，上述研究結果再次證實了此觀點。有學者[50-51]證明了DNA啟動子甲基化參與了慢性丙型肝炎向肝癌的發(fā)展過程，且DNA甲基化聯(lián)合AFP對HCV相關性肝癌也有良好的診斷效能?；贒NA甲基化聯(lián)合AFP在HBV相關性肝癌及HCV相關性肝癌的診斷中的效能，表明檢測血液中的游離DNA甲基化對肝癌的病因診斷有一定的幫助，但需要繼續(xù)研究來證實。

血液中基因甲基化水平聯(lián)合AFP對早期肝癌的診斷顯示出一定的臨床應用前景。一項多中心病例對照研究[52]發(fā)現, 3個DNA甲基化標志物(HOXA1、EMX1 及 TSPYL5)聯(lián)合AFP、AFP-L3診斷早期肝癌，特異度達90%, 敏感度為71%, 這與PASHA H F等[53]研究結果相似。

2.4 DNA甲基化標志物聯(lián)合其他指標

ZHANG Y J等[54]檢測50例肝癌患者與50例健康對照的血清中3種DNA甲基化水平(RASSF1A、p16和p15), 并將這3種基因標志物聯(lián)合患者臨床特征，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、表面抗原及丙型肝炎病毒抗體等，建立一種診斷模型，該模型對肝癌的診斷敏感度為84%, 特異度為94%, 提示DNA甲基化聯(lián)合其他指標，如異常凝血酶原(PIVKAII)、甲胎蛋白異質體(AFP-L3)、患者的臨床指標、影像學資料(如肝臟超聲)等，可提高肝癌的檢出率。

3 結語與展望

肝癌是一種高發(fā)病率及高致死率的疾病，其發(fā)生、發(fā)展是表觀遺傳學不斷積累變化的過程[55]。DNA甲基化是轉錄和調控控制的重要表觀遺傳學改變，是表觀基因組領域最有前途的生物標志物，可以根據直接從腫瘤或“偏遠”位置(如痰、血液、尿液及膽汁等)獲得的遺傳物質進行診斷[56-57]。本文綜述了基于血液的DNA甲基化檢測在診斷肝癌方面的進展，著重介紹了單個DNA甲基化標志物、多個DNA甲基化標志物聯(lián)合及DNA甲基化聯(lián)合AFP在肝癌檢測方面取得的現有成果。隨著檢測技術的不斷進步，以DNA甲基化為基礎的液體活檢的臨床效能，需要高質量研究進一步驗證。期待在不久的將來，基于血液的無創(chuàng)檢測方法檢測患者的相關基因位點異常甲基化，能夠成為肝癌早期診斷、長期監(jiān)測、預后判斷以及指導個性化用藥的重要手段。