鼠趾再生過(guò)程中的相關(guān)分子機(jī)制研究進(jìn)展

王啟文，劉英芹

(桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

0 引言

哺乳動(dòng)物通常被認(rèn)為是再生潛力較差的有機(jī)體，但是有少數(shù)哺乳動(dòng)物顯示出強(qiáng)大的再生能力[1]。哺乳動(dòng)物的再生僅限于第三趾骨的遠(yuǎn)端(P3)[2-4]，與其它長(zhǎng)骨相比，第二趾骨(P2)截肢導(dǎo)致骨截?cái)嗪推つw愈合與纖維瘢痕形成。最近的研究表明，盡管P2沒有再生反應(yīng)，但P2截肢啟動(dòng)了類似于骨折愈合的動(dòng)態(tài)修復(fù)反應(yīng)，并顯示出軟組織再生的跡象[5]。體外研究顯示新生胎兒和小鼠指尖存在解剖學(xué)和分子學(xué)的相似性[1]，另外，指尖是人體肢體中唯一具有再生能力的部分，因此鼠趾趾尖已成為研究臨床相關(guān)再生反應(yīng)的模型[6]。首先，鼠趾趾尖再生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并且通過(guò)連續(xù)階段進(jìn)行，包括炎癥發(fā)生，組織溶解，表皮閉合，胚芽形成和分化等階段[6]。同時(shí)，再生也是由一個(gè)涉及許多生長(zhǎng)因子的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)的過(guò)程，細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)再生的誘導(dǎo)和促進(jìn)至關(guān)重要。脊椎動(dòng)物的四肢通過(guò)許多生長(zhǎng)因子及其信號(hào)通路的相互協(xié)調(diào)而生長(zhǎng)，包括Wnt通路，F(xiàn)GF、BMP、SMAD通路和TGF-β途徑[4,9-11]。這些研究證實(shí)，許多基因和細(xì)胞因子及其信號(hào)通路對(duì)鼠趾再生有促進(jìn)或抑制作用。

2 不同基因和細(xì)胞因子對(duì)鼠趾再生的影響

鼠趾再生過(guò)程中會(huì)有多種基因和細(xì)胞因子的參與，比如BMP、FGF4、Msx1、Msx2、Sox2、Hoxc13、Ihh、SIRT3和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。胚胎鼠趾再生期間，在發(fā)育鼠趾的趾尖特異性表達(dá)的許多基因被上調(diào)，表明這些基因?qū)υ偕磻?yīng)產(chǎn)生了重要作用[1]。本文重點(diǎn)闡述BMP2、BMP4、BMP9、FGF4、SIRT3和α-MSH以及Msx、Sox2對(duì)鼠趾形態(tài)的發(fā)育和影響。

2.1 BMP在鼠趾再生中的作用

BMP是一類結(jié)構(gòu)相似的高度保守的功能蛋白，屬于TGF-β家族。BMP可以誘導(dǎo)DNA合成和細(xì)胞復(fù)制，從而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。它也是誘導(dǎo)骨和軟骨發(fā)育的主要因子，在四肢生長(zhǎng)、早期骨折、軟骨修復(fù)中表達(dá)，在胚胎發(fā)育和骨再生過(guò)程中起重要作用。

先前關(guān)于胎兒和新生兒鼠趾截肢的研究表明BMP信號(hào)通路在再生中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[12]。從指甲近端褶皺(nail proximal fold，NPF)中分離出的指甲緩慢循環(huán)標(biāo)記滯留細(xì)胞(label-retaining cells,LRCs)的基因表達(dá)譜顯示，兩種BMP信號(hào)通路的抑制劑被下調(diào)，從而表明BMP通路在指甲穩(wěn)態(tài)中的作用[13]。再生的特征在于未分化增殖細(xì)胞的芽基形成并表達(dá)BMP4[2]，原位雜交結(jié)果表明，再生過(guò)程中BMP4的表達(dá)上調(diào)，因此，表明其在再生反應(yīng)中誘導(dǎo)發(fā)育[2]；同時(shí)，在新生小鼠的斷趾模型研究中發(fā)現(xiàn)，BMP拮抗劑頭蛋白治療抑制了再生，因此表明BMP可以促進(jìn)鼠趾斷趾再生。另外，利用非再生截肢傷口表明，BMP2或者BMP7(BMP7也會(huì)誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)[14])能誘導(dǎo)鼠趾再生反應(yīng)[12]。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)Msx1突變小鼠表現(xiàn)出再生缺陷時(shí)，可以通過(guò)外源性BMP4處理來(lái)解決，并且用BMP拮抗劑頭蛋白處理野生型鼠趾截肢抑制了再生[12]。再生還與水平有關(guān)，截?cái)嗟谌汗?P3)遠(yuǎn)端區(qū)域后可再生，而更近端水平的截肢則無(wú)法再生[2]。在新生兒鼠趾的研究中，成功的再生同樣需要BMP信號(hào)傳導(dǎo)并且通過(guò)BMP2或BMP7的靶向治療來(lái)刺激近端(非再生)損傷截肢再生[2]。BMP2通過(guò)建立一個(gè)在肥厚性軟骨細(xì)胞附近有增殖的軟骨內(nèi)骨化中心來(lái)誘導(dǎo)P3的再生，但通過(guò)建立遠(yuǎn)端增殖軟骨細(xì)胞的軟骨內(nèi)骨化中心誘導(dǎo)遠(yuǎn)端P2的再生；BMP2誘導(dǎo)的再生與局部增殖反應(yīng)和已建立的鼠趾細(xì)胞標(biāo)記基因的瞬時(shí)表達(dá)相關(guān)[12,15]。相關(guān)研究還表明，Bmp4在再生鼠趾胚芽間充質(zhì)中表達(dá)。并受Msx1和Msx2的調(diào)節(jié)，這提高了BMP4可能是Msx1突變體鼠趾再生中限制因子的可能性[16]。BMP4表達(dá)的空間和時(shí)間模式研究表明它是建立幾種不同器官系統(tǒng)所需的誘導(dǎo)組織相互作用的介質(zhì)，包括心臟，腦垂體和腸道以及四肢。BMP4能以自分泌方式起作用來(lái)影響神經(jīng)組織的增殖和/或分化；或者BMP4也能以旁分泌的方式起作用，來(lái)影響相鄰細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。這些結(jié)果都增加了BMP4是多肽信號(hào)分子、同源盒和視黃酸受體級(jí)聯(lián)一部分的可能性，這些基因也都參與肢體的生長(zhǎng)和發(fā)育。相關(guān)研究還表明BMP4在Msx1下游以劑量依賴性方式起作用，因此BMP4對(duì)再生反應(yīng)的調(diào)節(jié)是非常必不可少的[16]。

BMP9可抑制鼠趾再生。BMP9是一個(gè)在出生后調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)的有效因子[17,18]，并在不同的研究中被證明可以促進(jìn)血管的生成或抑制血管的生成[19,20]。雖然在鼠趾再生過(guò)程中沒有檢測(cè)到BMP9轉(zhuǎn)錄，但用BMP9(500ng/μL)治療被切除的鼠趾會(huì)導(dǎo)致完全的抑制再生。對(duì)BMP9組鼠趾的分析表明，在14DPI下分析的樣本鼠趾中有100%顯示出基于總檢查的抑制再生反應(yīng)；與BSA對(duì)照組相比，BMP9組鼠趾的骨體積分析導(dǎo)致最終P3體積顯著減少。BMP9組鼠骨量與VEGF組鼠骨量基本相當(dāng)[20]。在轉(zhuǎn)染間充質(zhì)祖細(xì)胞的研究中表明，BMP9在體內(nèi)起到促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并且在體外起到促進(jìn)異位骨形成的作用[21]。與BMP2一樣，BMP9在內(nèi)皮細(xì)胞的研究中已被證明通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的SMAD通路發(fā)出信號(hào)，而BMP9已被證明可以在其他細(xì)胞類型中激活替代的(非典型的)通路[22]。因此，BMP9對(duì)鼠趾再生的抑制影響突出了BMP信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)新方面，是抑制而非促進(jìn)[20]。這些發(fā)現(xiàn)突出了BMP9活性的多樣性。

綜上所述，BMP在鼠趾再生中發(fā)揮著作用的生物學(xué)功能。

2.2 FGF4對(duì)小鼠肢體分叉反應(yīng)的影響

分叉反應(yīng)是鼠趾特定的，限于鼠趾IV；細(xì)胞標(biāo)記研究表明，分叉反應(yīng)是由鼠趾雛形的前軟骨細(xì)胞在趾尖的重組引起的。FGF4對(duì)鼠趾形態(tài)發(fā)育的影響與許多基因(包括Msx1,IGF2和HoxD簇的后部成員)的表達(dá)變化密切相關(guān)[23]。

脊椎動(dòng)物肢體骨骼的元素起源于間充質(zhì)凝結(jié)，其在上皮-間充質(zhì)相互作用后出現(xiàn)。這種相互作用包括位于早期肢芽遠(yuǎn)端趾尖的特殊上皮和下面的間充質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)[24]。頂端外胚層脊(apical ectode rmalridge,AER)通過(guò)將間充質(zhì)細(xì)胞維持在高度增殖和未分化狀態(tài)來(lái)刺激肢體向外生長(zhǎng)。極化活動(dòng)區(qū)(zone of polarizing activity；ZPA)是肢體后壁和體壁附近的一小塊中胚層組織，調(diào)節(jié)ZPA活性的因素包括同源框轉(zhuǎn)錄因子HoxD家族的成員和分泌的分子如音猬因子(SHH)和BMP2和BMP4。近端-遠(yuǎn)端肢體向外生長(zhǎng)由表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子成員的FGF家族控制；其中FGF2和FGF8在整個(gè)AER中都有表達(dá)，而FGF4的表達(dá)僅限于后部AER；目前的研究表明這些FGF對(duì)AER和間充質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)起重要作用[23,25]。FGF4在體外對(duì)早期小鼠肢芽細(xì)胞具有促進(jìn)有絲分裂的作用[25]，并且在體內(nèi)對(duì)于小雞肢體的叉指細(xì)胞具有促進(jìn)有絲分裂作用[23]。研究還發(fā)現(xiàn)FGF4抑制小鼠趾尖細(xì)胞的凋亡和Msx1，HoxD以及IGF2基因的表達(dá)[23]，這表明內(nèi)源性FGF4在鼠指骨骼的遠(yuǎn)端生長(zhǎng)中起重要作用。另外，研究提出了一種模型，其中FGF4在鼠趾IV的骨架分支期間將起雙重作用。首先，F(xiàn)GF4將對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞具有直接的趨化作用，導(dǎo)致前軟骨形成結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)大；其次，F(xiàn)GF4將在建立外胚層信號(hào)中心中發(fā)揮作用?？傊現(xiàn)GF4在鼠指IV分叉反應(yīng)中起雙重作用。綜上所述，F(xiàn)GF4在小鼠骨骼分支形態(tài)發(fā)育中是重要的內(nèi)源性信號(hào)。

2.3 線粒體去乙酰化酶3(SIRT3)對(duì)鼠趾再生的影響

線粒體去乙?；?(SIRT3)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)代謝的主要因素之一——促進(jìn)線粒體能量的產(chǎn)生和維持穩(wěn)態(tài)[26]。當(dāng)SIRT3缺乏可降低鼠趾骨膜成骨細(xì)胞的氧化和糖酵解能力。當(dāng)敲除小鼠中SIRT3會(huì)導(dǎo)致骨量減少，這可能是由于破骨細(xì)胞數(shù)量的增加[27]直接與ROS有關(guān)[28]；這將導(dǎo)致骨小梁數(shù)量減少，并降低機(jī)械能力[28]。缺乏SIRT3的小鼠由于成骨細(xì)胞數(shù)量的增加而出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)減少。SIRT3通過(guò)干擾RANKL誘導(dǎo)的PGC-1β表達(dá)來(lái)抑制分化[27]。SIRT3-/-破骨細(xì)胞前體細(xì)胞通過(guò)下調(diào)AMP依賴的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)的表達(dá)來(lái)降低AMPK的磷酸化。研究也發(fā)現(xiàn)，SIRT3是RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞發(fā)育的內(nèi)在抑制劑[27,29]。SIRT3通過(guò)對(duì)呼吸鏈的影響，參與了線粒體ATP產(chǎn)生機(jī)制的控制，研究中發(fā)現(xiàn)SIRT3-/-破骨前體細(xì)胞增加了破骨細(xì)胞的分化水平，并確實(shí)發(fā)現(xiàn)SIRT3缺陷小鼠由于破骨細(xì)胞數(shù)量的增加而顯示出骨量減少[27]；SIRT3在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化期間由PGC-1β和ERRα誘導(dǎo)，并通過(guò)穩(wěn)定AMPK蛋白可能作為破骨細(xì)胞發(fā)育的負(fù)性調(diào)節(jié)介質(zhì)，因此表明SIRT3在破骨細(xì)胞形成中發(fā)揮了重要的分子剎車作用。SIRT3對(duì)破骨細(xì)胞的分化呈負(fù)調(diào)控，SIRT3的缺乏增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的形成，另外需要注意的是SIRT3負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞分化，但不調(diào)控其功能，SIRT3的缺失沒有導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞線粒體的任何缺陷[27]。另外，SIRT3調(diào)節(jié)的線粒體應(yīng)激參與成骨細(xì)胞分化和骨形成[28]。在分化過(guò)程中，特異性誘導(dǎo)SOD2消除過(guò)量的線粒體超氧化物和蛋白質(zhì)氧化，而SIRT3的表達(dá)通過(guò)K68的去乙?；瘉?lái)增強(qiáng)SOD2的活性。SOD2和SIRT3的敲除都抑制了分化。同時(shí)，缺乏SIRT3的小鼠表現(xiàn)出明顯的骨量減少，并伴有成骨細(xì)胞的功能障礙，而SOD2或SIRT3的過(guò)表達(dá)提高了來(lái)自SIRT3缺陷小鼠的原發(fā)性成骨細(xì)胞的分化能力。這都表明，SIRT3/SOD2是調(diào)節(jié)線粒體應(yīng)激所必需的，并在成骨細(xì)胞分化和骨形成中發(fā)揮著重要的作用[28]。目前，對(duì)SIRT3/SOD2在骨形成和穩(wěn)態(tài)方面的研究相當(dāng)有限；SIRT3抑制了RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞發(fā)育[28]，SIRT3的缺失導(dǎo)致MTROS增加而損害線粒體穩(wěn)態(tài)和功能，從而抑制體外和體內(nèi)的骨發(fā)育，因此SIRT3/SOD2可能是促進(jìn)骨骼的潛在靶點(diǎn)[28]。作為線粒體內(nèi)重要的去乙?；福琒IRT3被認(rèn)為是基礎(chǔ)ATP和整體能量穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，它也被證明主要通過(guò)賴氨酸68(K68)去乙酰酸并以此來(lái)激活SOD2[28]。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了SIRT3/SOD2軸在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能和骨形成中的重要作用。

綜上所述，這些研究表明線粒體在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，并證明了SIRT3/SOD2控制著成骨性分化以及調(diào)節(jié)著線粒體氧化還原和體外以及體內(nèi)的骨形成。因此SIRT3在鼠趾再生過(guò)程中對(duì)成骨細(xì)胞的作用也是至關(guān)重要的。

2.4 α-MSH激活黑素皮質(zhì)素-4受體信號(hào)刺激神經(jīng)依賴性小鼠趾頭再生

在利用Mc4r-gfp小鼠分析了Mc4r在胚胎和產(chǎn)后小鼠肢體中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，Mc4r-GFP主要表達(dá)在肢體神經(jīng)和正在經(jīng)歷繼發(fā)性肌發(fā)生的肢體肌肉中。Mc4r-GFP在成人小鼠趾頭中的表達(dá)僅限于指甲基質(zhì)。在α-MSH對(duì)鼠趾再生的影響的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)在Mc4r+/-小鼠中使用α-MSH可以避免遠(yuǎn)端趾尖延遲再生。α-MSH可以避免退化的后肢的遠(yuǎn)端指頭再生。總之，小鼠肢體和手指中的Mc4r表達(dá)與神經(jīng)組織密切相關(guān)，與α-MSH/MC4R密切相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)在小鼠趾尖再生中起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[31]。

2.5 Msx基因參與鼠趾再生

鼠趾趾尖的發(fā)育是上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的結(jié)果，受到許多發(fā)育調(diào)節(jié)因子的調(diào)控。同源異型盒基因Msx是鼠趾發(fā)育的重要調(diào)控基因，其編碼蛋白在鼠趾發(fā)育的啟動(dòng)、定位和構(gòu)型中起著重要作用。Msx基因在肢體頂端間充質(zhì)中的表達(dá)依賴于來(lái)自AER的信號(hào)傳導(dǎo)，以及與臨近間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用[16]。在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，Msx1和Msx2的轉(zhuǎn)錄都受到小鼠遠(yuǎn)端鼠趾結(jié)構(gòu)細(xì)胞的影響，同時(shí)Msx1和Msx2均在出生時(shí)鼠趾甲床和毛囊細(xì)胞中表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)鼠趾趾尖的再生能力僅限于截肢平面在Msx1區(qū)域內(nèi)的水平[32]。事實(shí)上，先前的研究證實(shí)，BMP下游的轉(zhuǎn)錄因子Msx2和Foxn1在甲床細(xì)胞終末分中是必不可少的。Msx2突變體的特征具有在生角質(zhì)區(qū)中分化差的特征，硬角蛋白的產(chǎn)生減少。在 Foxn1突變體中，硬角蛋白的表達(dá)甚至更低，表現(xiàn)為指甲斷裂[33]。

綜上所述，Msx在鼠趾的再生過(guò)程中起到了很好的促進(jìn)作用[34]。

2.6 Sox2基因?qū)τ谑笾涸偕淖饔?/h3>

Sox2基因?qū)儆赟ox基因家族，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，在維持胚胎早期細(xì)胞的多能性、細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化、性發(fā)育、軟骨和血細(xì)胞形成等方面發(fā)揮著重要作用[35]。Sox基因家族編碼一組進(jìn)化上高度保守、結(jié)構(gòu)上與SRY相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；同時(shí)相關(guān)研究已經(jīng)表明，Sox2可能是通過(guò)它在施萬(wàn)前體細(xì)胞(schwann cell precursor,SCP)中的作用來(lái)發(fā)揮其對(duì)鼠趾的再生作用[36]。

3 總結(jié)與展望

BMP是調(diào)控鼠趾再生的關(guān)鍵信號(hào)分子，TGF-β超家族組成員BMP-3B和GDP-10的生物學(xué)功能還是未知，但可能參與成骨細(xì)胞的分化、增強(qiáng)BMP2的活性，所以有待進(jìn)一步進(jìn)行研究和發(fā)現(xiàn)其在鼠趾再生過(guò)程中的具體作用。此外，目前的研究表明，SIRT3可能發(fā)揮著破骨細(xì)胞分化的分子剎車作用；但還需要對(duì)SIRT3作用的分子機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，以了解SIRT3是否真正充當(dāng)PGC-1β和AMPK之間的橋梁。這些努力不僅會(huì)增進(jìn)我們對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的理解，而且可能為鼠趾再生和骨科疾病治療的干預(yù)提供新的方法[27]。另外，SIRT3/SOD2激活的機(jī)制應(yīng)進(jìn)一步探索，并確定成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的分子相關(guān)性，以便進(jìn)一步證實(shí)在有機(jī)體的疾病和衰老過(guò)程中SIRT3/SOD2發(fā)揮著線粒體中心調(diào)節(jié)器的作用，最終在未來(lái)可以為與年齡相關(guān)的骨科疾病提供新的治療方法。