陜產七葉一枝花的生藥學研究△

楊琳，程江雪，王艷，彭亮，高靜，楊新杰，張崗，顏永剛*，程虎印*

1.陜西中醫(yī)藥大學 藥學院/陜西省秦嶺中草藥應用開發(fā)工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043

七葉一枝花ParispolyphyllaSm.為百合科重樓屬粗壯根莖類的南重樓組藥用植物，是陜西燈臺七、重樓藥材的基原植物[1]。七葉一枝花主要分布于我國西藏東南、云南、貴州和四川等地[2]，在陜西也有分布。根據(jù)本草考證，七葉一枝花最早在陜西的記錄出現(xiàn)于《本草圖經(jīng)》：“蚤休，即紫河車也，俗呼金線重樓。生……今河中、河陽、華、鳳、文州及江淮間亦有之。苗葉似王孫、鬼臼等，做二、三層；六月開黃紫花，蕊赤黃色，上有金絲垂下；秋結紅子；根似肥姜，皮赤肉白。四、五月采根，日干用”[3]，由此植物形態(tài)特征判斷其應為七葉一枝花，“華”應為華州，今陜西省渭南市華陰市、華州區(qū)、潼關縣一帶；“鳳”即為鳳州，今陜西省鳳縣。《陜西中藥志》1962年版記載中藥重樓為“百合科(Liliaceae)植物重樓ParispolyphyllaSm.的根莖?！鳟a于山陽、紫陽、隴縣、寧強、鳳縣、南鄭、華縣等縣區(qū)及太白山地區(qū)”[4]。七葉一枝花在陜西的藥用歷史源遠流長，近年來陜西省第四次中藥資源調查初步結果表明，其在陜西渭北高塬的耀州區(qū)和黃龍、秦嶺南北坡各縣、大巴山脈之鎮(zhèn)巴縣、勉縣等地多有分布[5-8]。重樓屬南重樓組植物的粗壯根莖作為陜西中藥市場重樓的統(tǒng)貨，具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、收縮子宮和抗腫瘤等作用[9-13]。

陜產七葉一枝花在民間當燈臺七使用，所含活性成分主要為重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等[9-16]。已有學者對七葉一枝花營養(yǎng)器官的顯微結構及皂苷含量進行了研究[17-19]，但目前對陜產七葉一枝花的生藥學研究較少。本實驗研究了七葉一枝花的形態(tài)特性、生藥性狀及其顯微特征，并參照《中華人民共和國藥典》[20](以下簡稱《中國藥典》)2015年版重樓項下方法測定了重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量，為厘清來源及合理利用陜產七葉一枝花植物資源提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Nikon D750型數(shù)碼照相機(尼康株式會社)；LEICA RM2235型切片機(德國徠卡公司)；HD-360型生物組織自動染色機(湖北慧達儀器有限公司)；ZEISS Imager.A2型顯微鏡(德國蔡司公司)；FA2104型電子分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；UltiMate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Inertsil ODS(C18)型高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)。

1.2 試藥

10批七葉一枝花樣品采自陜西省七葉一枝花主產縣域陰濕的落葉闊葉林或人工闊葉林下(見表1)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學程虎印教授、顏永剛教授鑒定為七葉一枝花ParispolyphyllaSm.。

表1 陜產七葉一枝花生藥采集地點信息

對照品重樓皂苷Ⅰ(批號：10575-201410)、重樓皂苷Ⅱ(批號：10576-201409)、重樓皂苷Ⅵ(批號：10577-201411)、重樓皂苷Ⅶ(批號：10578-201411)均購自南昌貝塔生物科技有限公司，純度均大于98%；娃哈哈牌瓶裝純凈水；乙醇(分析純)；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；其余所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 生物學特性及生長習性觀察

通過野外資源考察及對仿野生基地長期觀察的方式，實地觀察七葉一枝花的生長特性，用數(shù)碼相機拍照，記錄原植物形態(tài)。

2.2 性狀鑒別

8月初采挖6年以上的實生苗，觀察七葉一枝花根莖的性狀特征，并對其根莖的形狀、大小、表面顏色、質地以及斷面等進行描述，用數(shù)碼相機對觀察到的特征進行拍攝記錄。

2.3 顯微特征鑒別

對七葉一枝花藥材根莖的橫切面和粉末進行制片，利用顯微鏡觀察根莖及粉末結構及特征，拍攝組織顯微照片，記錄其顯微特征及數(shù)據(jù)。

2.4 含量測定

2.4.1色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱為Inertsil ODS(C18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以流動相水(A)-乙腈(B)進行梯度洗脫(0～10 min，30%～40%B；10～15 min，40%～60%B；15～35 min，60%～70%B；35～45 min，70%～75%B)。柱溫：25 ℃；檢測波長：203 nm；流速：1 mL·min-1；進樣體積：30 μL。理論板數(shù)按重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ計算均不低10 000?？瞻讓φ?、混合對照品、供試品的HPLC圖見圖1。

注：A.空白對照；B.混合對照品；C.供試品(第8批)；1.重樓皂苷Ⅶ；2.重樓皂苷Ⅵ；3.重樓皂苷Ⅱ；4.重樓皂苷Ⅰ。圖1 空白對照、混合對照品及供試品的HPLC圖

2.4.2對照品溶液制備 精密稱取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ 2 mg，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為0.4 mg·mL-1的對照品溶液，備用；精密吸取上述4種對照品溶液各1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，搖勻，用甲醇定容，即得混合對照品儲備液。

2.4.3供試品溶液的制備 將生藥干燥后粉碎成粗粉，精密稱取藥材粉末2.0 g，置于錐形瓶中，加入25 mL 90%乙醇，浸泡0.5 h后，連續(xù)回流提取2次，合并濾液，完全蒸發(fā)續(xù)濾液中溶劑，向其中加入甲醇溶解，并定容至10 mL量瓶內，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4方法學考察 按照相關標準進行方法學試驗[21]，結果顯示，精密度、穩(wěn)定性及重復性試驗中供試品峰面積的RSD分別為0.16%～0.57%、1.62%～4.79%、2.17%～3.88%，均在規(guī)定范圍內，表明儀器精密度良好，供試品溶液穩(wěn)定性、方法重復性較好，方法準確度良好。加樣回收率試驗中，4個成分的RSD分別為5.31%、5.79%、5.28%、4.19%。

2.4.5含量測定 取10批樣品各適量，分別按2.4.3項下方法制備供試品溶液，再按2.4.1項下色譜條件進樣測定，并以干燥品計算含量。

3 結果

3.1 生物學特性及生長習性

陜產七葉一枝花為多年生直立草本，株高25～90 cm；莖單一，無毛，常帶紫紅色，基部有灰白色干膜質的鞘1～3枚；根狀莖橫走而粗厚，直徑1～2.5 cm，長1.5～5.8 cm，外面棕褐色，密生多數(shù)斜橫環(huán)節(jié)和須根，上面有一列多數(shù)凹陷莖痕；葉7～12枚，輪生，葉片矩圓形、橢圓形或倒卵狀披針形，長7～16 cm，寬1.8～3 cm，先端短尖或漸尖，基部圓形或寬楔形，羽狀網(wǎng)脈；葉柄明顯，長0.3～1 cm，常帶紫紅色；花單生于葉輪中央，花梗似為莖的延續(xù)，長6～18 cm；花基數(shù)(3-)4～8；花被2輪，離生，宿存，外輪花被片綠色，葉狀，狹卵狀披針形或長橢圓形，長(3-)4.5～5 cm，寬1.2～2.3 cm，內輪花被片狹條形，綠色至黃綠色，長3～7 cm，通常比外輪長；雄蕊2輪，花藥長0.5～0.8 cm，與花絲近等長或稍長，藥隔突出部分長0.1～0.2 mm；子房近球形，具5～6棱，頂端具一盤狀花柱基，花柱粗短，具(4-)5分枝，中上部側下反曲；蒴果紫色至墨綠色，直徑1.5～2.5 cm，3～6瓣裂開；種子多數(shù)，具鮮紅色多漿汁的外種皮?；ㄆ?—7月，果期8—10月。

該種的葉片形狀、葉柄長度與顏色、葉基與葉尖形態(tài)有明顯變化幅度；內輪花被片長度比外輪花被片短、近等長或顯著長；生長年限越長的植株，其株高、葉片數(shù)、花基數(shù)、根莖直徑與長度、果實大小及成熟種子數(shù)等均有不同程度增加。陜產七葉一枝花根莖在花形成前生成的根莖較細，花形成之后根莖顯著膨脹變粗，至頂部最粗，略彎曲或呈結節(jié)狀，表皮棕褐色，橫斜環(huán)紋較為粗厚，突起明顯；頂芽唯一，常自7月中旬—8月中下旬的花期末至果期初萌發(fā)，至次年3月地上實生苗出土時持續(xù)生長。由此可見，根莖顯著持續(xù)膨大似與有性生殖過程相關。其根莖有別于華重樓P.polyphyllaSm.varchinensis(Franch.)Hara根莖的粗壯、較長及狹葉重樓P.polyphyllaSm.var.stenophyllaFranch.根莖較細、較短等。其栽培方式的生長特性與具柄重樓P.fargegiiFranch.var.Petiolata(Baker ex C.H.Wright)Wang et Tang[21]、寬葉重樓P.polyphyllaSm.var.latifoliaWang et Chang[22]較為相似，對生長環(huán)境條件的選擇較為專性。陜產七葉一枝花的原植物、花、果實種子及臘葉標本見圖2。

注：A.原植物；B.花；C.果實種子；D.臘葉標本。圖2 陜產七葉一枝花的原植物、花、果實種子及臘葉標本

3.2 生藥性狀

生藥為無(或切去)頂芽、除去須根的干燥根莖，為較粗壯的結節(jié)狀不勻扁圓柱體，不同程度彎曲，長2.2～9.8 cm，直徑不均勻；表面呈棕褐色，有粗斜層狀環(huán)形突起，結節(jié)顯著，尾部為最初形成的根莖，較細，向頂部逐步加粗，有時頂部有凹陷莖痕或干燥皺縮的芽體及平齊的芽體切面，根莖底面有顯著的凹窩狀白色須根痕，質地堅實，斷面呈乳白色，較為平整，粉性強；氣微，味微苦、麻。見圖3。

圖3 陜產七葉一枝花的生藥性狀特征

3.3 生藥顯微特征

3.3.1橫切面 其最外為一層表皮細胞，細胞壁栓化，外切向壁明顯較厚，呈棕褐色，細胞排列較為緊密，無細胞間隙，細胞多呈近圓形、短矩形，切向稍延長。部分表皮破裂或剝落。皮層寬廣，由外及里依次為外皮層細胞2～4層，稍大于表皮細胞，部分細胞因外切向壁稍木栓化而呈淺褐色，排列較整齊緊密，少有細胞間隙，無或很少含淀粉粒；皮層薄壁組織28～32層細胞，呈類方形、類圓形或類多角形，大小較為均勻，排列不整齊，細胞間隙顯著存在；根跡維管束外圍為維管束鞘包圍，厚約7～13層薄壁細胞，內有不規(guī)狀大型細胞間隙連成的通氣組織，最內和最外層各為1～2層、環(huán)圍排列較為整齊緊密。生活細胞內均含大量淀粉粒，普遍較小；死亡細胞內含針晶束較多，普遍較大，長20～60 μm，寬10～40 μm。黏液細胞偶見。內皮層1層，明顯存在，排列較為整齊、不連續(xù)。皮層整體寬度與中柱半徑之寬度約為2.5∶1。

中柱構造為基本組織細胞之中散布大小不一的周木式維管束。中柱鞘與皮層、中柱的界限不顯著，薄壁細胞的大小不均、排列不整齊，存在明顯細胞間隙，含極多淀粉粒和針晶束。有6～10個大小不一的周木式維管束散布于中柱近外圍區(qū)域，呈圓形、不規(guī)則形或橢圓形，有的2～3個黏連一起成群排列。黏液細胞偶見。40倍光學顯微鏡下特征見圖4。

注：A.詳圖；B.簡圖；1.栓化表皮；2.皮層；3.細胞間隙；4.草酸鈣針晶；5.根跡；6.維管束鞘；7.內皮層；8.周木式維管束；9.黏液細胞。圖4 陜產七葉一枝花橫切面結構部分詳圖及簡圖

3.3.2藥材粉末 藥材粉末基本為白色，略呈淡棕黃色。淀粉粒多呈球形、矩圓形甚或鈍三角形，極多，絕大多數(shù)為單粒，較少的復粒淀粉屬多粒聚合型，臍點明顯存在，為條狀、裂隙狀、星狀或狹縫狀，層紋不明顯，單粒淀粉直徑2～25 μm。針晶極多，暗灰色，呈束簇狀排列或散列，單針晶長約24～61 μm。導管較常見，主要類型為螺紋導管、梯紋導管、網(wǎng)紋及梯-網(wǎng)紋導管，直徑約12～40 μm。見圖5。

注：A.詳圖；B.簡圖；1.淀粉粒；2.針晶(束)；3.螺紋導管；4.梯紋導管；5.網(wǎng)紋導管；6.梯-網(wǎng)紋導管。圖5 陜產七葉一枝花藥材粉末顯微特征

3.4 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量測定

測定結果表明，陜產七葉一枝花生藥中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量均在2%以上，符合《中國藥典》2015年版標準，見表2。

表2 陜產七葉一枝花生藥中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ質量分數(shù)(n=3) %

4 討論

陜產七葉一枝花來源明確，為百合科重樓屬南重樓組植物七葉一枝花P.polyphyllaSm.，其具有獨特的生長特性，分類特征與其變種和具柄重樓易于區(qū)別。合格藥材的最低生長年限、性狀、最佳采收期、其他活性組分、與《中國藥典》2015年版收載中藥重樓藥效比較研究等是今后七葉一枝花研究工作的主要方向。

其生藥橫切面顯微構造中具有1層表皮細胞、內皮層細胞排列為不連續(xù)的輪廓環(huán)形、6～10個類圓形周木式維管束散布排列等特征性結構，根跡維管束的維管束鞘中有通氣組織樣的連續(xù)細胞間隙，與原植物陰濕的自然適生環(huán)境相符[23]，連同條狀、星狀、裂隙狀或狹縫狀臍點的(類)球形淀粉粒等生藥粉末特征，與《中國藥典》2015年版中七葉一枝花[20](應為華重樓[2])和云南重樓[20](應為寬瓣重樓[2])1層表皮、間斷排列的內皮層、25個以上的小型周木維管束散布、生藥粉末中所含淀粉粒等特征[13，23]區(qū)別顯著，是顯微鑒別所依據(jù)的主要指標。

陜產七葉一枝花根莖入藥有兩重性，其在本地是以燈臺七、海螺七入藥的種之一，性味功能為“味微甘、苦，性寒，有毒。清熱解毒，消腫散結，鎮(zhèn)驚止痛”，主治“瘡癤癰腫，跌打損傷，毒蛇咬傷，瘰癘，癌腫，小兒驚風”[24]。民間鮮品咬敷可止牙痛，同時又在中藥市場上以重樓同名等效入藥。按照《中國藥典》2015年版表述為“性味與歸經(jīng)：苦、微寒；有小毒。歸肝經(jīng)。功能與主治：清熱解毒，消腫止痛、涼肝定驚。用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐”，兩者既有相通性又有區(qū)別。本研究表明，陜產七葉一枝花有效組分重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量超過了《中國藥典》2015年版規(guī)定的0.6%，一定程度上表明其與重樓同名等效入藥的合理性，但能否作為替代資源、地方性的“燈臺七”與中藥重樓通用的合理性有待進一步研究。

陜西產七葉一枝花根莖入藥，有許多地方名稱如燈臺七[1]、海螺七[24]、蒲藍(華陰)[25]等，部分文獻使用非標準名稱、地方名稱、學名直譯(多葉重樓)與《中國藥典》錯誤引注法定藥用植物名稱，或還有植物名與中藥名等混淆交錯在一起，加之七葉一枝花特有的變化性形態(tài)特性，一定程度上干擾并影響了對原植物的科學認知、準確記述與合理藥用。本研究對陜西省產的七葉一枝花生物學特性和生藥學的初步研究，厘清了陜產中藥重樓的主要來源，為制訂陜產重樓質量標準[26]、研究陜產重樓屬其它粗壯根莖類的生藥學特征以及合理開發(fā)地方特色中藥材資源提供了參考。