綿羊NRCAM基因的生物信息學(xué)分析

靳澤希，馮 芬，鄧曉銀，王維民，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅民勤 733300）

神經(jīng)原相關(guān)的細(xì)胞粘附分子（neuro-related celladhesion molecule，NRCAM）是一種跨膜的細(xì)胞粘附分子，它有多種亞型，目前已經(jīng)鑒定出的有20多種。NRCAM屬單基因家族，其不同亞型的形成是由單個NRCAM基因通過不同的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工形成的。NRCAM屬于免疫球蛋白超基因家族［1-2］，它是一種能介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用的糖蛋白，在細(xì)胞的識別及轉(zhuǎn)移、腫瘤的浸潤與生長、神經(jīng)再生、跨膜信號的傳導(dǎo)、學(xué)習(xí)和記憶等方面均發(fā)揮一定的作用。神經(jīng)細(xì)胞粘附分子在組織形成和細(xì)胞遷移以及神經(jīng)突長出中起著重要作用，它還可以通過胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞骨架蛋白或第二信使的結(jié)合參與信號傳導(dǎo)過程。例如，傳統(tǒng)的鈣粘素通過參與細(xì)胞極性建立、細(xì)胞增殖、軸突延長和聚集等基本過程，在動物細(xì)胞的形態(tài)中發(fā)揮著重要作用［3］。Zhou WB 等［4］發(fā)現(xiàn)，將周圍神經(jīng)植入腦中幾天后，丘腦、紋狀體部位神經(jīng)元直接朝向周圍神經(jīng)移植物的方向生長，進(jìn)入雪旺細(xì)胞柱中，而在雪旺細(xì)胞和神經(jīng)元表面均有NRCAM的表達(dá)，表明NRCAM在神經(jīng)的再生過程中擔(dān)當(dāng)著重要角色。Doherty P等［5］對雞NRCAM基因的分析發(fā)現(xiàn)，NRCAM基因由內(nèi)含子和26個外顯子組成，這26個外顯子的結(jié)構(gòu)在不同的物種和屬之間是相當(dāng)恒定的，但內(nèi)含子是不同的。目前，人、家鼠、牛、狗、豬、綿羊、雞、兔子等動物的NRCAM基因序列均已經(jīng)公布，但對其結(jié)構(gòu)和功能的研究有待進(jìn)一步研究。我們以生物基因組數(shù)據(jù)庫調(diào)取的綿羊NRCAM的序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對不同物種NRCAM基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及多參數(shù)預(yù)測、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽預(yù)測、亞細(xì)胞定位和三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析，以期為深入研究NRCAM基因及其編碼蛋白基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

數(shù)據(jù)來源于NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫［6］，包括綿羊 （XM_027968593.1）、牛（NM_001206562.1）、人（NM_001193583.1）、家鼠（XM_017594291.1）、豬（XM_021063526.1）、狗（XM_014120801.2）、兔子（XM_00825 8357.2）和雞（XM_015280741.2）等 8個物種的mRNA序列。括號內(nèi)為GenBank登錄號。

1.2 方法

綿羊NRCAM基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）采用 NCBI的 ORF Finder程序分析，參照Kozak法則；NRCAM編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用Bioedit及ExPASy分析軟件預(yù)測［7］；亞細(xì)胞定位采用PSORTⅡ預(yù)測［8-9］；蛋白潛在信號肽剪切位點(diǎn)預(yù)測采用Signalp 3.0軟件；跨膜螺旋區(qū)域的預(yù)測采用TMHMM程序；蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析采用Smart軟件。采用ProtScale進(jìn)行蛋白親疏水性分析。二級結(jié)構(gòu)采用Jpred分析預(yù)測。采用Swiss-model軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu)多序列比對，同源性分析采用DNAMAN軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊NRCAM基因開放閱讀框分析

通過圖1可以看出，綿羊NRCAM基因序列中有1條最大長度為3 648 bp的ORF，起始密碼子位于405 bp處，終止密碼子位于4 052 bp處，推測編碼1 215個氨基酸殘基。

2.2 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn)等［10］。對綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)的分析表明，綿羊NRCAM基因編碼1 215個氨基酸殘基，其分子式為C5995H9389N1613O1830S32，分子質(zhì)量為134 367.13 KDa，理論等電點(diǎn)pI為5.49。其氨基酸組成如圖2所示，其中含量最多的氨基酸是Leu（亮氨酸），所占比例為8.3%；含量最少的氨基酸是Cys（半胱氨酸），所占比例1.2%。負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為 148，正電荷殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為 121?；蚓幋a產(chǎn)物半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為40.22，不穩(wěn)定指數(shù)為40.22＞40.00，可確定該基因編碼產(chǎn)物屬不穩(wěn)定蛋白。

2.3 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析

綿羊NRCAM基因?qū)Φ鞍讈喖?xì)胞的定位結(jié)果見表1?？梢钥闯?，綿羊NRCAM蛋白的亞細(xì)胞分布于細(xì)胞質(zhì)的可能性為26.1%，分布于細(xì)胞核的可能性為17.4%，分布于囊泡分泌系統(tǒng)、線粒體的可能性均為13.0%，分布于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性均為8.7%，分布于細(xì)胞骨架、細(xì)胞外及細(xì)胞壁、質(zhì)膜的可能性均為4.3%。由此推斷，綿羊NRCAM基因的編碼產(chǎn)物主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

表1 NRCAM編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

2.4 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物的同源性分析

從圖3、圖4可以看出，NRCAM在很多物種中都有表達(dá)，且綿羊與牛的NRCAM氨基酸序列同源性較高，這也說明它們在進(jìn)化過程具有較近的親緣關(guān)系。NRCAM基因編碼產(chǎn)物同源樹證明，該基因的編碼產(chǎn)物在綿羊和牛上的同源性最高，達(dá)99%。

2.5 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物潛在信號肽剪切位點(diǎn)預(yù)測

信號肽序列是存在于分泌蛋白基因編碼序列中、在起始密碼子之后的1段富含疏水氨基酸多肽的序列。通過檢測綿羊NRCAM蛋白潛在信號肽的存在情況可判斷該基因編碼的產(chǎn)物是否為分泌蛋白和跨膜蛋白以及跨膜蛋白的基本信息。從圖5看出，綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物的C值、Y值和S值分別為0.474、0.580和0.929。推斷NRCAM基因的編碼產(chǎn)物包含信號肽，剪切位點(diǎn)位于29、30殘基處，屬于分泌蛋白。

2.6 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測

用TMHMM2.0軟件分析的結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白有1段跨膜結(jié)構(gòu)（圖6），其中1～1 074位氨基酸在細(xì)胞膜外，其余氨基酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

2.7 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物保守結(jié)構(gòu)域分析

由Smart軟件分析可知，綿羊NRCAM第59～130位、第283～347位、第373～439位、第467～532位和第558～623位氨基酸殘基存在IGc2區(qū)，第152～239位氨基酸殘基存在于IG區(qū)，第625～635位氨基酸殘基均為低復(fù)雜性區(qū)域，第647～730位、第747～830位、第846～937位和第952～1037位氨基酸殘基存在于FN3區(qū)，第1075～1 097位氨基酸殘基存在于跨膜區(qū)（圖7、表2）。

表2 綿羊NRCAM蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)

2.8 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物親疏水性分析

該基因編碼蛋白疏水性最大值為4.078（1 090位），最小值為 -3.022（790～791位），圖形的高峰值（正值）區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。整條鏈中親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基。因此可推測該基因編碼的蛋白是親水性蛋白（圖8）。

2.9 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過Jpred軟件分析可知（圖9），綿羊NRCAM蛋白二級結(jié)構(gòu)如下:α螺旋（Hh）、β折疊（Ee）、無規(guī)卷曲（Cc）分別占2.96%、42.13%、54.89%?？梢钥闯鯪RCAM基因編碼的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲占主導(dǎo)地位，其次是β折疊。

2.10 綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

通過在線工具Swiss-model對綿羊NRCAM蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析（圖10）可知，NRCAM基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果一致，主要由無規(guī)卷曲和β折疊纏繞形成。

3 結(jié)論

綿羊NRCAM基因含有1個最大長度為3 648 bp的ORF，編碼1 215個氨基酸殘基；亮氨酸所占比例最多，為8.3%，分子質(zhì)量為134 367.13 KDa，理論等電點(diǎn)pI為5.49。NRCAM編碼的產(chǎn)物為不穩(wěn)定性蛋白。NRCAM蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，為26.1%。NRCAM基因在很多物種中都有表達(dá)，綿羊和牛在同源樹中同源性達(dá)到99%。NRCAM基因的編碼產(chǎn)物中包含信號肽，該蛋白是分泌蛋白。該基因編碼的蛋白有1段跨膜結(jié)構(gòu)。NRCAM基因編碼的蛋白為親水性蛋白，親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基。綿羊NRCAM基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲和β折疊為主，三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲和β折疊纏繞形成。