干粉培養(yǎng)基的研制研究

聶娟　魯珍娥　易家玲　柳威　朱玉婷

摘 要：本文在簡(jiǎn)要論述干粉培養(yǎng)基相關(guān)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，深入探討了干粉培養(yǎng)基研制的材料與工藝方法，并對(duì)其研制結(jié)果進(jìn)行深入探討，給出了干粉培養(yǎng)基研制與工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，最后將干粉培養(yǎng)基的研制工藝帶入實(shí)際應(yīng)用，綜述了干粉培養(yǎng)基的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值和前景展望，旨在為我國(guó)干粉培養(yǎng)基研制水平的不斷提高和應(yīng)用價(jià)值的進(jìn)一步凸顯提供更多參考與啟迪。

關(guān)鍵詞：干粉培養(yǎng)基;研制;應(yīng)用價(jià)值

目前，不論是生物學(xué)界還是醫(yī)學(xué)界，所使用的培養(yǎng)支原體培養(yǎng)基絕大部分是以美國(guó)學(xué)者所發(fā)明的肉湯或瓊脂為基礎(chǔ)的干粉培養(yǎng)基，且英國(guó)、美國(guó)、日本等諸多發(fā)達(dá)國(guó)家已然將干粉培養(yǎng)基商業(yè)化和工業(yè)化，為工業(yè)生產(chǎn)做出了不可忽視的重要貢獻(xiàn)。我國(guó)20世紀(jì)50年代初，上海生物制藥品所就開始生產(chǎn)與不斷應(yīng)用干粉培養(yǎng)基。就現(xiàn)階段而言，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)干粉培養(yǎng)基往往采用高溫烘干后再球磨的方式，實(shí)際生產(chǎn)質(zhì)量較為不穩(wěn)定，產(chǎn)量受生產(chǎn)工藝限制有所缺憾。在此背景下，對(duì)干粉培養(yǎng)基的研制研究也就具備了重要理論意義和現(xiàn)實(shí)價(jià)值，能有效改善我國(guó)當(dāng)前干粉培養(yǎng)基研制效率、生產(chǎn)效率不高的不良狀況，不斷優(yōu)化干粉培養(yǎng)基的研制工藝流程，從而為干粉培養(yǎng)基的商業(yè)化和工業(yè)化提供一定技術(shù)支撐。

1 干粉培養(yǎng)基概述

干粉培養(yǎng)基主要是指將培養(yǎng)基的各種成分經(jīng)過一定的化學(xué)處理或物理處理，將培養(yǎng)基實(shí)際配方中所需的各種成分以一定量充分混合攪勻，使培養(yǎng)基配方呈現(xiàn)粉末狀態(tài)，并提取此時(shí)充分混合的粉末狀態(tài)，按照一定比例加入蒸餾水后熔化，分裝滅菌后即可投入工業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基種類。整體而言，干粉培養(yǎng)基生產(chǎn)具備工藝標(biāo)準(zhǔn)化，節(jié)約培養(yǎng)基單個(gè)制造時(shí)間，且實(shí)際生產(chǎn)質(zhì)量較為穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢(shì)，是適用于一般流動(dòng)性及其設(shè)備簡(jiǎn)單的小型化學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的重要培養(yǎng)基類別之一，受到了諸多小型實(shí)驗(yàn)室的強(qiáng)烈歡迎，也為小型實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的正常推進(jìn)做出了重要貢獻(xiàn)。我國(guó)從21世紀(jì)50年代初期著手研制干粉培養(yǎng)基，干粉培養(yǎng)基在現(xiàn)代醫(yī)藥單位已廣泛投入使用，無菌干粉培養(yǎng)基甚至列入了我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程。

2 干粉培養(yǎng)基的研制與工藝優(yōu)化

2.1 材料與方法

在干粉培養(yǎng)基的研制與工藝優(yōu)化過程中，本文選擇血清干粉培養(yǎng)基的生產(chǎn)為主要研制對(duì)象，選擇Cho細(xì)胞以及上海某抗體藥物工程研究中心所提供的培養(yǎng)基原材料。進(jìn)一步將干粉培養(yǎng)基以40、60、80和100℃作為四個(gè)溫度分界點(diǎn)，實(shí)際處理時(shí)間為10h。在使四個(gè)具備溫度點(diǎn)設(shè)定的干粉培養(yǎng)基與原方法處理的干粉培養(yǎng)基成為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，四個(gè)溫度點(diǎn)中的每個(gè)溫度點(diǎn)各增加兩個(gè)平行試驗(yàn)，最大限度消除實(shí)驗(yàn)誤差可能帶來的不良影響。在干粉培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)過程中，主要將細(xì)胞放置于初始原始細(xì)胞密度接近于1L的搖瓶，以十天為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，確保搖瓶中的pH值不低于6.8，一旦pH值低于6.8，即進(jìn)行補(bǔ)堿工作，確定培養(yǎng)基中每天的糖分為3g/l，培養(yǎng)溫度為37℃恒溫狀態(tài)，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%左右，實(shí)際培養(yǎng)基搖瓶轉(zhuǎn)速為125轉(zhuǎn)/min。同時(shí)，試驗(yàn)人員還應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中每天取樣一定量細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在培養(yǎng)液1萬轉(zhuǎn)/s的離心狀態(tài)下離心5min，使離心后的液體可用于實(shí)驗(yàn)理化數(shù)據(jù)參數(shù)分析。最后，選擇干粉培養(yǎng)基的分析方法，可采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、葡萄糖乳酸測(cè)定方法甚至蛋白表達(dá)量測(cè)定方法等。

2.2 結(jié)果與討論

首先，探究不同溫度條件下所處理的培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)基中活細(xì)胞密度的影響，在100℃的狀態(tài)下，干粉培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度最低，深入分析造成該現(xiàn)象的原因可知，可能是由于干粉培養(yǎng)基中某些物質(zhì)成分在100℃的高溫狀態(tài)處理下，會(huì)存在著部分物質(zhì)成分損失以及營(yíng)養(yǎng)成分減少等問題，嚴(yán)重影響培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖，造成活細(xì)胞密度較低這一不良現(xiàn)象。在培養(yǎng)基的磨制過程中，實(shí)際磨制工藝在瞬時(shí)溫度高達(dá)80℃以上時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基中的部分熱敏感物質(zhì)就會(huì)有較大破壞。

其次，探討不同溫度處理下的培養(yǎng)基對(duì)乳酸的最終影響，在100℃、80℃左右時(shí)，乳酸生產(chǎn)質(zhì)量濃度最高，高達(dá)1.75克/升以上。在60℃時(shí)，乳酸濃度處于集中狀態(tài)，40℃和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳酸濃度處于最低狀態(tài)。由于乳酸濃度較高，會(huì)直接抑制干粉培養(yǎng)基中細(xì)胞的實(shí)際生長(zhǎng)速度和表達(dá)方式，由此可知，當(dāng)乳酸濃度較高時(shí)，細(xì)胞密度則相對(duì)較低。究其原因可知，干粉培養(yǎng)基的實(shí)際處理溫度較高時(shí)，會(huì)對(duì)培養(yǎng)基成分造成一定影響，例如，會(huì)影響培養(yǎng)基中關(guān)于谷氨酰胺和轉(zhuǎn)鐵蛋白等物質(zhì)成分，而該類物質(zhì)成分與干粉培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常代謝息息相關(guān)，直接會(huì)影響干粉培養(yǎng)基中細(xì)胞的TCL循環(huán)。當(dāng)能量代謝進(jìn)入了糖酵解階段或是糖磷酸支路途徑時(shí)，乳酸濃度快速升高。而乳酸濃度越低，則說明干粉培養(yǎng)基中的實(shí)際能量代謝所釋放的ATP數(shù)量也就越多，越有利于干粉培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常代謝，乳酸濃度過高，則會(huì)影響干粉培養(yǎng)基的細(xì)胞能量代謝過程，抑制干粉培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)和最終表達(dá)。

再者，探討不同溫度處理下的培養(yǎng)基對(duì)目的蛋白表達(dá)量和生產(chǎn)量的影響，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，100℃溫度條件下處理的目的蛋白表達(dá)量最低，僅僅為2.06g/l，而40℃處理后的目的蛋白表達(dá)量和實(shí)際生長(zhǎng)量與對(duì)照組蛋白量和實(shí)際生長(zhǎng)量最高，分別達(dá)到了2.45和2.53g/l，其他溫度條件下所處理的目的蛋白表達(dá)量均低于40℃狀態(tài)下的目的蛋白表達(dá)量，而100℃時(shí)的目的蛋白表達(dá)量含量最低。由此進(jìn)一步探究目的蛋白表達(dá)量和生長(zhǎng)量受溫度的影響可知，由于干粉培養(yǎng)基中的部分成分在100℃的高溫條件處理下會(huì)存在著部分物質(zhì)損耗和營(yíng)養(yǎng)成分的減少。

最后，綜合討論所有培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)，對(duì)單因素結(jié)果和方差進(jìn)行深度分析，比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)十天后的活細(xì)胞密度、乳酸含量以及其目的蛋白的表達(dá)量和生長(zhǎng)量，并對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差數(shù)據(jù)分析。由試驗(yàn)可知，100℃的溫度條件下，活細(xì)胞的生長(zhǎng)密度最低，而40℃的溫度條件下，活細(xì)胞的密度最高，其他溫度條件下處理的活細(xì)胞密度與對(duì)照組比較呈現(xiàn)出顯著性差異這一數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果。當(dāng)溫度條件為40℃時(shí)，pH值大于0.05，也就是數(shù)理統(tǒng)計(jì)上的非顯著性差異。就40℃和對(duì)照組的乳酸濃度問題而言，兩者處于最低狀態(tài)，濃度相差較小，呈現(xiàn)非顯著性差異，兩者數(shù)據(jù)信息較為接近。從目的蛋白的表達(dá)量和生長(zhǎng)量來看，40℃和對(duì)照組為非顯著性差異，其他組與對(duì)照組則呈現(xiàn)出了顯著性差異，明顯高于其他不同條件溫度處理下的目的蛋白表達(dá)量和生長(zhǎng)量。

2.3 結(jié)論

本文以不同溫度條件處理下的干粉培養(yǎng)基對(duì)Cho細(xì)胞培養(yǎng)以及目的蛋白表達(dá)量和生長(zhǎng)量的影響為研究對(duì)象，確定了對(duì)干粉培養(yǎng)基表達(dá)和生產(chǎn)績(jī)效最高的實(shí)際處理溫度。進(jìn)一步結(jié)合乳酸濃度、干粉培養(yǎng)基活細(xì)胞密度以及目的蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)，40℃和對(duì)照組遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組別，其中對(duì)照組的乳酸濃度最低，實(shí)際目的蛋白表達(dá)含量最高，但對(duì)照組的培養(yǎng)基在其干粉處理工序上較為繁復(fù)，實(shí)際生產(chǎn)效率較為低下，而40℃實(shí)驗(yàn)組處理后的干粉培養(yǎng)基活細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與對(duì)照組為非顯著性差異，實(shí)際處理工序卻大幅度減少，處理難度進(jìn)一步降低，生產(chǎn)效率快速提高。綜合考慮，40℃的干粉培養(yǎng)基處理工序?yàn)樽罴烟幚頊囟取?/p>

3 實(shí)際應(yīng)用與價(jià)值

在培養(yǎng)基的實(shí)際生產(chǎn)過程中，加強(qiáng)對(duì)不同溫度條件下培養(yǎng)基原材料的干燥處理以及不同溫度條件下培養(yǎng)基中最終細(xì)胞生長(zhǎng)量、目的蛋白表達(dá)量和生產(chǎn)量等的探討與研究，也就能不斷優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的制備流程和工業(yè)生產(chǎn)流程，使無血清培養(yǎng)基能在生產(chǎn)成本快速降低和生產(chǎn)時(shí)間大量縮減的基礎(chǔ)上，不斷增強(qiáng)其最終生產(chǎn)質(zhì)量?？傊?，無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化處理能為國(guó)內(nèi)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)程提供一定支撐，也能為國(guó)內(nèi)其他抗體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定思考。

4 前景展望

通過本文對(duì)無血清培養(yǎng)基關(guān)于不同溫度條件下的相關(guān)研究，能為無血清培養(yǎng)基在其他影響因素上的工藝流程設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供一定參考，也能為其他類別干粉培養(yǎng)基工藝流程的縮減和優(yōu)化提供更多支撐，更能為國(guó)內(nèi)相關(guān)生物試驗(yàn)的推進(jìn)和國(guó)內(nèi)抗體產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大提供一定參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]翁志兵，邵晨華，胡輝.無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化[J].生物加工過程，2015，13（5）：57-59.