染色體外癌基因擴增特點與腫瘤發(fā)生發(fā)展

汪雨彤 葉凡 張霄 鄒睿涵 王明遠 俞鍇 崔詩允

腫瘤發(fā)生過程中，癌基因擴增是常見的細胞改變之一。癌基因[1]和功能元件如增強子[2]的過表達，能給細胞提供選擇性生長優(yōu)勢。研究[4]表明，腫瘤細胞中可攜帶癌基因的染色體外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）是癌基因大量擴增的直接原因[3]，可以增加腫瘤遺傳異質性。ecDNA也已被證實在腫瘤細胞中普遍存在[5]，且患者攜帶ecDNA往往提示更差的預后[6]。本綜述將重點闡述ecDNA基本特征和其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系。

1 染色體外DNA基本概念與特征

1965年染色體外DNA被首次發(fā)現(xiàn)，研究人員在哺乳動物DNA樣本中觀察到大小不一的DNA圓環(huán)，大的圓環(huán)常兩兩成對，故被稱為雙微鐘（double minutes, DMs）[7,8]。使用現(xiàn)代技術研究表明，DMs存在于各種類型的癌細胞中[9,10]，并含有原癌基因[5,11-14]。它的基本特征是一種在光學顯微鏡下可見的大型的（1 Mb-3 Mb或以上）、具有一個或多個完整基因和調控區(qū)的環(huán)狀DNA，并且缺乏著絲?；蚨肆！Ｇ疫M一步研究[5]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中只有約30%的染色體外DNA是成對的DMs，故現(xiàn)在多將雙微鐘及其單體形式稱為ecDNA，不再用曾經(jīng)的DMs描述它們。

廣義的染色體外DNA大小不一，從幾百堿基對的microDNA[15]到幾百kb的DMs[11]，廣泛存在于秀麗隱桿線蟲、酵母、果蠅、小鼠、人體正常細胞和癌細胞等多種生物體內[16-22]，一般被稱為染色體外環(huán)狀DNA（extrachromosomal circular DNA, eccDNA），不是本文的主要討論重點。ecDNA屬于eccDNA的一種，但eccDNA廣泛存在，而ecDNA多見于腫瘤細胞內。

ecDNA的存在在癌癥中很常見。對來自不同患者的腫瘤細胞系和永生非癌細胞系等進行量化ecDNA水平研究發(fā)現(xiàn)，ecDNA幾乎不存在于正常細胞中，但在40%的各類型癌癥細胞和90%患者腦部腫瘤移植模型中存在。且ecDNA含量細胞間差異很大，具有腫瘤特異性[5,23]。其中以腦膠質母細胞瘤及骨肉瘤最常見，在約50%的上述腫瘤細胞中都能檢測到ecDNA。肺癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等腫瘤中較常見，而白血病、淋巴瘤、前列腺癌等中較為罕見[6]。

Wu等[3]利用二代測序、雙色熒光原位雜交技術（ fluorescenceinsituhybridization, FISH）等方法，分析了60個常見的腫瘤細胞和臨床樣本，進一步證明ecDNA為環(huán)狀結構且能夠直接、大量產(chǎn)生含癌基因mRNA的特點。利用免疫熒光、ATAC-seq和MNase-seq技術對其的進一步研究顯示，ecDNA不僅含有癌基因和調控序列，還在相應位置（如啟動子）上含有活躍型組蛋白修飾，并能夠形成核小體。ecDNA擁有比染色體DNA開放性更強的染色質，且這種特點由ecDNA本身性質決定，不依賴于染色體DNA。ecDNA還可以形成拓撲相關結構域，產(chǎn)生DNA超遠距離相互作用，以調控基因表達[3]。上述結論也已通過數(shù)據(jù)庫在臨床大樣本中得到了進一步的驗證[6]。

2 ecDNA在腫瘤細胞中的產(chǎn)生機制

ecDNA在腫瘤細胞中的形成、維持、復制、消除等機制尚不清楚，以下都是基于實驗現(xiàn)象提出的可能猜想與推斷。目前得到較多認可的ecDNA形成模型如下所述：胞內先產(chǎn)生雙鍵斷裂、染色體重排或其他染色體異常事件，使DNA片段環(huán)化形成ecDNA。接著在喪失腫瘤抑制因子的情況下，可能繞過細胞衰老反應發(fā)生ecDNA復制，進而導致ecDNA拷貝數(shù)的迅速累積[24]。

染色體碎裂和附加體形成都可能導致ecDNA的形成。染色體碎裂涉及一個或多個染色體斷裂和多重重排[25]。染色體碎裂導致的染色體端粒融合參與膠質母細胞瘤和小細胞肺癌中的ecDNA發(fā)生[26,27]。對急性髓性白血病中含MYC基因的ecDNA結構研究[28,29]發(fā)現(xiàn)，不同的ecDNA可以在相同的白血病細胞群中共存，提示其逐步進化而非單一起源的產(chǎn)生過程。誘導DLD-1細胞系中染色體分離錯誤能觀察到一系列染色體間和染色體內基因組重排。同時還觀察到染色體碎裂直接導致ecDNA形成，進而導致ecDNA上所含基因的擴增[30]。一項對結直腸癌細胞的研究[31]證明雙鏈斷裂能誘導ecDNA聚合，同時發(fā)現(xiàn)聚合發(fā)生在S期，提示同源重組可能參與其中。研究者以此提出了附加體模型。還有一種與斷裂-融合-橋循環(huán)（breakagefusion-bridge, BFB）周期相關的模型，也被認為與ecDNA產(chǎn)生相關[32]。幾種ecDNA產(chǎn)生的可能機制如圖1所示。

已經(jīng)觀察到ecDNA擴增子的形成與染色體不穩(wěn)定及DNA缺陷修復機制相關。有研究[33-35]通過引入包含哺乳動物復制起始區(qū)和核基質附著區(qū)的質粒，成功擴增了ecDNA并對其形成過程進行描述，即含哺乳動物復制起始區(qū)（initiation region, IR）/基質附著區(qū)（matrix attachment region, MAR）質粒開始復制為小的染色體環(huán)，再融合形成較大結構。

不同的信號通路可以參與誘導含有不同癌基因的ecDNA形成。PI3K/Akt/BRCA1-Abraxas通路參與了SEI1誘導的ecDNA的形成，激活和抑制該通路可以分別導致小鼠體內ecDNA數(shù)量增加和減少[36]。抑制MAPK信號轉導通路中ERK1/2的激活能顯著減少ecDNA的數(shù)量及其攜帶基因的擴增和表達程度[37]。

3 ecDNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展

ecDNA通過多種途徑幫助細胞獲得競爭優(yōu)勢。ecDNA在隨機位點上形成的過程中，含有致癌基因和調控元件的位點被優(yōu)先選擇。ecDNA傳代過程中環(huán)狀擴增子的不均等分離，增加了子代細胞ecDNA的表達，這種表達不受基因劑量影響，能夠幫助癌基因進一步表達，并使拷貝數(shù)快速增加[38]。ecDNA的重新整合也能幫助細胞獲得更多選擇優(yōu)勢。一項對擴增子序列重新整合到DCLK1基因位點中的研究[39]表明該序列導致雜合性丟失，隨后腫瘤抑制功能喪失。

3.1 ecDNA與腫瘤細胞癌基因擴增 一項對3,212例癌癥患者全基因組測序數(shù)據(jù)分析的結果[6]證明，許多重要的原癌基因主要以ecDNA為載體進行擴增，如MDM2、MYC、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、CDK4、ERBB2等經(jīng)典基因，表明它與腫瘤細胞癌基因拷貝數(shù)增加和基因轉錄水平提高相關[3]。同時，也發(fā)現(xiàn)了多個攜帶不同癌基因（MYC和EGFR）的ecDNA[4]。

為了探究ecDNA與癌基因擴增的關系，Turner等[5]開發(fā)出一種無偏差圖像及計算機分析方法用與檢測胞外基因，發(fā)現(xiàn)所有癌基因的完全性擴增或者于ecDNA單獨完成，或者與ecDNA及染色體同時進行。這種ecDNA相關的擴增將大大增強腫瘤異質性，使基因拷貝數(shù)快速到達并維持在較高水平。并且基因擴增在腫瘤體內和體外生長過程中都被保留。在對膠質母細胞瘤的一項研究[4]中，MYC、MYCN、EGFR、MET等基因都能觀察到這一現(xiàn)象。

圖 1 幾種ecDNA可能的產(chǎn)生機制Fig 1 Models of how ecDNA is formed.BFB: breakage-fusion-bridge; ecDNA: extrachromosomal DNA.

對神經(jīng)母細胞瘤基因組研究[39]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)染色體內部和之間的基因重排，與ecDNA區(qū)域相符合，表明染色體間的重組位點能在環(huán)狀位置形成樹狀形式，推測ecDNA可以重新整合到線性基因組中形成嵌合體，促使癌基因重塑。這些事件在幫助腫瘤基因擴增的同時，也有助于腫瘤基因組模式化。

去除腫瘤細胞核DNA能使擴增癌基因丟失[33]。對人類早幼粒細胞白血病HL-60細胞系研究[40-42]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的自發(fā)分化涉及c-MYC拷貝數(shù)主動清除，并且在羥基脲存在下，于有絲分裂形成富含ecDNA的微核后，ecDNA的丟失加速。

3.2 ecDNA與腫瘤細胞均勻染色區(qū)（homogeneously staing regien, HSR） ecDNA可以動態(tài)整合到異?；蚪M位置，如HSR上[5,23]。HSR是腫瘤細胞g顯帶標本上染色均勻的區(qū)域，與基因重復擴增相關，為癌細胞的一種特有結構，含有癌基因。GBM39細胞系中ecDNA導致的耐藥機制之一就是ecDNA在HSR上的可逆重定位[43]。

一項對異種移植的人少突膠質細胞瘤的研究[44]發(fā)現(xiàn)，EGFR和MYC基因座共擴增在傳代早期以ecDNA形式出現(xiàn)，晚期則以HSR形式出現(xiàn)。這種轉變的過程中，擴增區(qū)域有多次重排和缺失。兩種擴增形式中，普遍存在的是非同源末端連接和微同源介導的末端連接。ecDNA在連續(xù)傳代過程中作為HSR重新定位，并積累額外斷點簇。研究[44]還發(fā)現(xiàn)，一些片段不是隨機融合，而是由可能的遠端DNA序列相互作用時，相鄰斷點的伴隨修復導致。

在對結直腸癌細胞中ecDNA和HSR抗性HT-29細胞系的同源重組活性檢測實驗[45]中，發(fā)現(xiàn)該細胞系比氨甲蝶呤敏感細胞有更活躍的同源重組活性。通過沉默BRCA1抑制同源重組（homologous recombination, HR）活性能夠減少ecDNA及ecDNA來源的擴增基因拷貝數(shù)，且該變化隨細胞周期和MTX敏感性增加而增加。但上述現(xiàn)象在HSR抗性細胞中沒有被觀察到。這表明HR途徑在染色體外和染色體內基因擴增中起著不同作用。同一細胞系的研究中，抑制非同源末端連接相關關鍵基因，也能觀察到ecDNA的減少[46]。提示HR通路可能是針對染色外擴增的新靶點。

3.3 ecDNA與增強子 ecDNA能使得癌基因利用增強子增強其轉錄能力。ecDNA相比線性DNA，核小體結構不緊密，開放性強，能夠實現(xiàn)超遠距離染色質接觸，能夠與調控元素產(chǎn)生遠距離相互作用[3]。在一項研究[3]中，5種不同實體腫瘤中都觀察到，癌基因和其附近增強子通過ecDNA形式共同擴增。這種情況在神經(jīng)母細胞瘤及Wilms腫瘤中MYCN和髓母細胞瘤中MYC基因中最為顯著。并且癌基因不僅能通過ecDNA上的內源增強子進行擴增，還可以從其他拓撲相關域中選擇調控元件。一項研究[47]中ecDNA的EGFR1擴增體被觀察到經(jīng)歷了增強子重組，內源和異位增強子被合并至每個能增強細胞適應性的增強子中。Helmsauer和他的同事[48]觀察到神經(jīng)母細胞瘤細胞系中MYCN擴增子缺乏內源性增強子，從同一遠端區(qū)域劫持異位增強子進入ecDNA結構。

3.4 ecDNA與基因組重排 對神經(jīng)母細胞瘤的研究[39]意外發(fā)現(xiàn)，ecDNA還參與體細胞基因組重排，它可通過嵌合體循環(huán)、重新整合進入線性基因組等方式，促進腫瘤基因組重塑。腫瘤進展也可能引起ecDNA重排，與臨床不良預后相關。ecDNA的多點突變對腫瘤基因組重塑有重要的意義。在1例復發(fā)的膠質母細胞瘤中，ecDNA在KIT/PDGFRA/PI3K/mTOR軸上漸進進化。最終，包含PDGFRA、KIT和CDK4的ecDNA以相互排斥的方式，取代原發(fā)腫瘤中異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase I,IDH1）的突變優(yōu)勢，使得復發(fā)腫瘤呈現(xiàn)出新的克隆突變表型[35]。

3.5 ecDNA與腫瘤耐藥性

3.5.1 ecDNA拷貝數(shù)動態(tài)變化調節(jié)癌基因表達 環(huán)境對細胞癌基因數(shù)量改變也可能通過ecDNA變化水平反映。ecDNA和細胞外基質在培養(yǎng)過程中被癌細胞丟失，并且野生型和突變型ecDNA可能在同一腫瘤中共存[49]，表明包含ecDNA的腫瘤細胞有快速適應環(huán)境變化的能力。

這種ecDNA數(shù)量動態(tài)變化也與腫瘤耐藥性相關。在膠質母細胞瘤患者臨床樣本和單細胞分析患者的衍生模型中，應用EGFR酪氨酸激酶抑制劑時，細胞能夠動態(tài)調節(jié)突變型EGFR的表達，使自身到達生長平衡的最佳狀態(tài)。其中對抑制劑抗性通過從ecDNA中消除EGFR實現(xiàn)。停藥后，EGFR突變能夠可逆地重新在ecDNA上出現(xiàn)，表明癌細胞可以通過這種途徑逃避針對ecDNA的治療[43]。相似的是，癌癥藥物吉西他濱能導致卵巢癌細胞株UACC-1598內ecDNA丟失[50]。在對人類結直腸癌細胞系NCI-H716和人類惡性原始神經(jīng)外胚層腫瘤細胞系SK-PN-DW研究中發(fā)現(xiàn)，抑制癌基因在ecDNA上表達，可以導致ecDNA數(shù)量減少，并使細胞增殖和侵襲能力也一定程度降低[51]。對GBM39細胞系EGFRvIII基因擴增的分析[5,43]證明，厄洛替尼使ecDNA重組為HSRs。去除藥物后，ecDNA擴增物重新出現(xiàn)。

在一項經(jīng)典研究[52]中，用甲氨蝶呤處理結直腸癌細胞HT-29，可觀察到位于ecDNA片段上的二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase,DHFR）基因拷貝數(shù)增加，克服了甲氨蝶呤對葉酸代謝抑制性作用，使腫瘤產(chǎn)生耐藥性。

膠質母細胞瘤具有群體異質性。將EGFR突變體高表達和低表達的細胞分離分別體外培養(yǎng)一段時間又會變成混雜表達群體。使用表皮生長因子受體抑制劑，能夠在細胞、小鼠、患者體內都觀察到高表達細胞減少，而低表達細胞存活。藥物撤除后，EGFR高拷貝數(shù)細胞重新出現(xiàn)，異質性恢復。這種現(xiàn)象依賴于ecDNA在細胞中期對EGFRVIII基因拷貝數(shù)的調節(jié)機制，而EGFRVIII基因幾乎完全在ecDNA上被擴增。這種廣泛的胞外不穩(wěn)定性，使腫瘤逃避藥物攻擊，增加耐藥性[43]。

3.5.2 ecDNA增加腫瘤細胞異質性 ecDNA驅動的拷貝數(shù)擴增可使腫瘤細胞增加瘤內基因異質性，而ecDNA在子代細胞中的不均等分離則能夠增加細胞多樣性，使其迅速適應環(huán)境壓力。

上文已經(jīng)提及，ecDNA對于一個細胞群體來說數(shù)量分布差異很大[5]。用體細胞單核苷酸變異體標記的腫瘤細胞和擁有ecDNA的亞克隆進化是不同的，進一步證明ecDNA與染色體有不同的遺傳模式。根據(jù)ecDNA特點可以推斷，腫瘤分裂過程中，因為缺乏著絲粒，ecDNA不能均勻分配入后代細胞，或者通過不同水平、不同類型的ecDNA的不均等擴增[53]，增加腫瘤異質性，加速腫瘤進化。

ecDNA還可以在次生體細胞突變之后形成。一個包含多個ecDNA拷貝的細胞中每個拷貝都可能在復制中的同一基因組區(qū)域獲得不同突變而加速ecDNA進化。膠質母細胞瘤原發(fā)和復發(fā)樣本中，都發(fā)現(xiàn)了包括相同致癌基因的新的ecDNA。不同的ecDNA相互競爭、演化，會迅速增加腫瘤異質性[54]。

有研究[46]已經(jīng)著眼于探究通過減少染色體外基因擴增改善腫瘤藥物治療療效。非同源性末端接合（nonhomologous end joining, NHEJ）蛋白在含有ecDNA的MTX耐藥結直腸癌細胞中表達增加，抑制或缺失非同源性末端接合蛋白DNA-PKcs能減少DHFR基因擴增，使ecDNA消失，增加細胞MTX敏感性，提示NHEJ可能作為MTX耐藥結直腸癌靶點。通過沉默BRCA1來抑制HR活性也可以增加耐藥腫瘤細胞對MTX 的敏感性[55]。

以上結果顯示，擁有ecDNA的癌細胞可以更快地應對環(huán)境的各種變化，這也給腫瘤治療帶來新的挑戰(zhàn)[56,57]。治療過程中所接受的化學療法、放射療法和藥物靶向療法等，都可能影響ecDNA拷貝數(shù)而增加腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的能力[58-60]。未來需要研究ecDNA是否使腫瘤細胞更容易逃避治療和免疫系統(tǒng)監(jiān)控？如果是，可能的分子機制是怎樣的？這些都有助于進一步研究更有效的治療方案。

4 ecDNA作為生物標志物的潛力

近年來血液中循環(huán)DNA已經(jīng)展現(xiàn)其作為生物標志物的巨大潛力，但是研究多著眼于線性DNA。目前有研究[61]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞會釋放環(huán)狀微DNA入血，并且更加穩(wěn)定。另外一項對妊娠婦女血漿中染色體外環(huán)狀DNA的研究[62]顯示，胎兒可將eccDNA釋放到孕婦血漿中。這些eccDNA來源于各種組織和細胞，正常與病變情況都有，已經(jīng)顯示出與疾病有相關性，提示其作為生物標志物潛在的用于疾病監(jiān)測、治療評估和腫瘤進展監(jiān)測的價值[63]。此外，雖然ecDNA在急性骨髓性白血病等血液腫瘤和淋巴組織腫瘤中極為罕見，但仍有相關的病例報道[64]和利用ecDNA進行疾病監(jiān)測的研究[65]，研究中使用FISH和g顯帶技術檢測惡性腫瘤細胞數(shù)量變化，初診檢出率為1.23%（6/489），或許可以給我們提供一些新思路。這些研究都提示我們，環(huán)狀DNA結構或許可以更加穩(wěn)定地在血液中存在，并且在以往的研究中常常被忽略。未來可以挖掘ecDNA在分子標志物、腫瘤轉移研究等方面的潛力。ecDNA不僅能夠應用于腫瘤預后和診斷，還能了解腫瘤起源。也有研究者認為ecDNA可能是ctDNA和cfDNA的起源，相關研究有待進一步開展。

5 總結與展望

雖然染色體外DNA早就被發(fā)現(xiàn)，但一直被研究者們忽視。通常使用高通量短讀長DNA測序方法推斷腫瘤DNA拷貝數(shù)分布時，擴增基因匹配到對應染色體上導致ecDNA可能被大量丟失以致被忽略。隨著越來越多實驗證明ecDNA的普遍性和其在加速腫瘤細胞進化中的重要意義，我們有必要重新考慮這些新的基因放大途徑對于腫瘤治療的意義。目前還有很多問題需要解決：ecDNA的產(chǎn)生、維持和消除機制是什么？我們能否從自然界其他類似的圓形DNA（如質粒）的特征中類比ecDNA的性質？ecDNA為腫瘤帶來的特異性特征是否可以被用于癌癥治療？環(huán)境的壓力又會對ecDNA產(chǎn)生哪些影響？ecDNA作為生物標志物又有哪些潛力？認識到擴增癌基因的位置、空間結構和特點，對癌癥的產(chǎn)生、進展和治療相關研究都有重要的意義。