致癌超級(jí)增強(qiáng)子的形成與干預(yù)研究進(jìn)展

袁婺洲,李瑞可

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410081)

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)發(fā)布的全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示:2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬(wàn)例,癌癥死亡病例996萬(wàn)例?？梢?jiàn),癌癥依然是本世紀(jì)最可怕的疾病之一,給人們的生活帶來(lái)巨大陰影和負(fù)擔(dān),因而癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及治療和預(yù)后策略一直是研究者們孜孜不倦關(guān)注的重大課題。近年很多文獻(xiàn)報(bào)道,超級(jí)增強(qiáng)子(super enhancer,SE)在癌癥發(fā)生、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答等重要生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[1～3];腫瘤細(xì)胞的許多關(guān)鍵致癌基因由超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng),超級(jí)增強(qiáng)子有潛力成為理想的抗癌靶點(diǎn)[1,4]。

1 增強(qiáng)子與超級(jí)增強(qiáng)子的概念

1981年,Banerji等[5]在猿猴空泡病毒SV40 DNA的5＇端上游發(fā)現(xiàn)了首個(gè)增強(qiáng)子,它能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶基因轉(zhuǎn)錄。隨后,人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多增強(qiáng)子,它們都能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子募集共激活因子(例如中介體復(fù)合物CREB結(jié)合蛋白CBP和p300),從而改變?nèi)旧|(zhì)的空間結(jié)構(gòu),促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與增強(qiáng)子、啟動(dòng)子及RNA聚合酶相互作用[6]。增強(qiáng)子的活性也與組蛋白的修飾狀態(tài)有關(guān),因?yàn)榛蚧钴S的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)都有H3K27me3、H3K27ac和H3K4me1標(biāo)記[7～8]。此外,增強(qiáng)子還能被轉(zhuǎn)錄為增強(qiáng)子RNA(enhancer RNA,eRNA)[9]。

與普通增強(qiáng)子不同,超級(jí)增強(qiáng)子是一種跨越8 kb以上的大型增強(qiáng)子,能與細(xì)胞中多種組織特異性轉(zhuǎn)錄因子(如胚胎干細(xì)胞的Oct4、Sox2及Nanog等)、中介體復(fù)合物(mediator,Med)、染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子及RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物結(jié)合,且這些活性分子的密度是普通增強(qiáng)子的好幾倍。因此,超級(jí)增強(qiáng)子比普通增強(qiáng)子具有更強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄的能力(圖1A),且超級(jí)增強(qiáng)子產(chǎn)生的RNA(super enhancer RNA,seRNA)水平更高[1,4]。雖然超級(jí)增強(qiáng)子具有與普通增強(qiáng)子相似的作用機(jī)制,但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中,DNA突變、插入或缺失、染色體重排、染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)改變和病毒感染則可能導(dǎo)致致癌超級(jí)增強(qiáng)子(carcinogenic super enhancer)的產(chǎn)生,促使癌細(xì)胞中癌基因高水平轉(zhuǎn)錄[10～21]。

2 超級(jí)增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)和鑒定

超級(jí)增強(qiáng)子與普通增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)類似,都能與轉(zhuǎn)錄因子、中介體復(fù)合物、啟動(dòng)子、RNA聚合酶及靶基因形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),只是它比普通增強(qiáng)子更大(現(xiàn)傾向于認(rèn)為至少跨越基因組8.7 kb大小),包含的增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄因子更多[6](圖1A)。中介體復(fù)合物、染色質(zhì)因子、H3K27ac和H3K4me1、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶、p300和CBP、RNA聚合酶Ⅱ和eRNA等,大量富集在超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域,它們具有很強(qiáng)的染色質(zhì)可及性[1]。此外,超級(jí)增強(qiáng)子在Wnt、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白血病抑制因子(leukemia-inhibitory factor,LIF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中更受末端轉(zhuǎn)錄因子的束縛,調(diào)控基因表達(dá)水平更高[4,11,16,22～23]。一些證據(jù)表明,超級(jí)增強(qiáng)子中的組成增強(qiáng)子可能彼此加強(qiáng)或共同發(fā)揮作用,在基因調(diào)控中具有非冗余功能,而刪除組成增強(qiáng)子則可能損害超級(jí)增強(qiáng)子其他成分的活性,導(dǎo)致整個(gè)超級(jí)增強(qiáng)子的功能障礙[23～25]。

研究人員提出了一種相分離模型來(lái)解釋超級(jí)增強(qiáng)子的形成機(jī)制[26～31]。通過(guò)類似于聚合物縮合的相分離現(xiàn)象,蛋白質(zhì)和DNA的異質(zhì)混合物被組裝成無(wú)膜細(xì)胞器結(jié)構(gòu)[28]。其中,溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain protein 4,BRD4)和Med 1(mediator 1)的內(nèi)部無(wú)序區(qū)域(inner disorder,IDR)可能在超級(jí)增強(qiáng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)形成相分離的液滴(圖1B),促進(jìn)特定基因轉(zhuǎn)錄成分的分隔和集中[29]。缺乏黏連蛋白會(huì)導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子在細(xì)胞核中廣泛融合,從而限制超級(jí)增強(qiáng)子之間的相互作用[30～31]。

圖1 超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)與相分離模型[31](A)增強(qiáng)子或超級(jí)增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合,包括轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子和RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體。黏連蛋白將增強(qiáng)子或超級(jí)增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子黏連在一起形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。E表示增強(qiáng)子;TF表示轉(zhuǎn)錄因子;Med表示中介體復(fù)合物;RNA PolⅡ表示RNA聚合酶Ⅱ;(B)超級(jí)增強(qiáng)子激活的相分離模型。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之間的高密度相互作用在超級(jí)增強(qiáng)子基因座處形成了相分離的多分子復(fù)合物,從而導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。Fig.1 Structure of super enhancer and phase separation model[31](A)Enhancers or super enhancers bind to transcriptional regulators,including transcription factors,co-activators,and the RNA polymerase Ⅱ complex.Cohesin binds to enhancers or super enhancers and forms a loop with transcriptional regulators.E:Enhancer,TF:Transcription factor,Med:Mediator,RNA polⅡ:RNA polymerase Ⅱ;(B)A phase-separation model of super enhancer activation.High-density interactions among transcriptional regulators form phase-separated multimolecular complexes at super enhancer loci,resulting in super enhancer-driven gene transcription.

如何鑒定超級(jí)增強(qiáng)子呢？Young等[4,32～34]提出一個(gè)三步鑒定超級(jí)增強(qiáng)子的方法。第一步,運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)獲得小鼠胚胎干細(xì)胞DNA序列上Oct4、Sox2和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的信號(hào)強(qiáng)度,其中轉(zhuǎn)錄因子與增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)密集結(jié)合的位點(diǎn)被用作超級(jí)增強(qiáng)子的候選片段[4]。第二步,在候選片段中選出共定位于12.5 kb DNA片段內(nèi)的增強(qiáng)子,將其定義為復(fù)合增強(qiáng)子(stitched enhancer)。他們一共篩選出8 794個(gè)復(fù)合增強(qiáng)子。第三步,確定超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子之間的閾值。首先,將復(fù)合增強(qiáng)子和單個(gè)增強(qiáng)子按照ChIP-seq所測(cè)Med1信號(hào)水平的強(qiáng)度排序,繪制一張曲線圖;隨后,將曲線上斜率為1的切線點(diǎn)所得的Med1信號(hào)值設(shè)定為區(qū)分超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子的閾值,高于該閾值為超級(jí)增強(qiáng)子,低于該閾值為普通增強(qiáng)子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在8 794個(gè)復(fù)合增強(qiáng)子中,一共有231個(gè)DNA片段的Med1信號(hào)值斜率大于1,這231個(gè)復(fù)合增強(qiáng)子片段即被鑒定為超級(jí)增強(qiáng)子[32～34](圖2)。

圖2 普通增強(qiáng)子與超級(jí)增強(qiáng)子示意圖[32](A)增強(qiáng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)遠(yuǎn)端的具有方向和位置獨(dú)立性的順式調(diào)控元件[33～34]。共定位于12.5 kb DNA片段之內(nèi)且Med1信號(hào)值大于閾值的增強(qiáng)子被稱為超級(jí)增強(qiáng)子。超級(jí)增強(qiáng)子通常比普通增強(qiáng)子大一個(gè)數(shù)量級(jí),具有更高的轉(zhuǎn)錄因子密度和更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活能力。TSS表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);(B)根據(jù)ChIP-seq信號(hào)水平的強(qiáng)度對(duì)增強(qiáng)子進(jìn)行排序,確定閾值從而區(qū)分普通增強(qiáng)子和超級(jí)增強(qiáng)子。Fig.2 Schematic diagram of typical enhancers and super enhancers[32](A)Enhancers are orientation-and position-independent cis-regulatory elements distal to the transcription start site[33～34].Enhancers that co-localize within the 12.5 kb DNA fragment and their Med1 signal values are greater than threshold are called super enhancers.Super enhancers are usually an order of magnitude larger than ordinary enhancers,with higher density of transcription factors and stronger transcriptional activation capacity.TSS:Transcription start site;(B)Enhancers are ranked according to the intensity of ChIP-seq signal levels,and thresholds are determined to distinguish typical enhancers from super enhancers.

3 致癌超級(jí)增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)

腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤細(xì)胞可能獲得特定的超級(jí)增強(qiáng)子來(lái)促進(jìn)癌基因表達(dá),介導(dǎo)信號(hào)通路失調(diào),這種特定的超級(jí)增強(qiáng)子被稱為致癌超級(jí)增強(qiáng)子[1,11,17,35]。致癌超級(jí)增強(qiáng)子首先發(fā)現(xiàn)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(multiple myeloma cell),具有與Med1和BRD4富集結(jié)合的特點(diǎn)。根據(jù)H3K27ac ChIP-seq的數(shù)據(jù),在直腸癌、前列腺癌及胰腺癌等18種人類癌癥細(xì)胞中人們也鑒定到了超級(jí)增強(qiáng)子[7];后來(lái)又在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、食道癌、胃癌等發(fā)現(xiàn)超級(jí)增強(qiáng)子[36],說(shuō)明腫瘤中普遍存在致癌超級(jí)增強(qiáng)子。

致癌超級(jí)增強(qiáng)子通過(guò)增加癌基因轉(zhuǎn)錄促使細(xì)胞向惡性腫瘤發(fā)展[23]。例如,致癌超級(jí)增強(qiáng)子可能激活MAPK信號(hào)通路,從而抑制細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞增殖[37];或者介導(dǎo)成紅細(xì)胞病毒E26癌基因同源物ERG過(guò)表達(dá),促進(jìn)癌癥發(fā)生[38]。另外,致癌超級(jí)增強(qiáng)子增加CYP24A1(1,25-dihydroxyvitamin D 24-hydroxylase)、GJA5(gap junction proteinα5)、SLAMF7(signaling lymphocyte activation marker family member 7)和 ETV1(E twenty-six variant 1)的表達(dá)[39]。相關(guān)研究報(bào)道,超級(jí)增強(qiáng)子增加了腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(telomerasereversetranscriptase,TERT)的表達(dá)[40];結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)相關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子在TCF4結(jié)合位點(diǎn)富集[23]。TCF4是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶標(biāo),與c-MYC基因座結(jié)合,在癌細(xì)胞獲得致癌超級(jí)增強(qiáng)子后顯示出強(qiáng)H3-K27Ac信號(hào)[23]。針對(duì)MCF-7細(xì)胞中H3K27Ac的ChIP-seq分析表明,超級(jí)增強(qiáng)子靶向的ESR1(estrogenreceptor1)基因僅編碼雌激素受體α(estrogen receptor,ERα)。在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中,超級(jí)增強(qiáng)子靶向基因富集并與ERα結(jié)合,而在三陰性乳腺癌細(xì)胞中,超級(jí)增強(qiáng)子富集位點(diǎn)與致癌轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)不同[41]。

4 致癌超級(jí)增強(qiáng)子的形成機(jī)制

大量的全基因組研究表明,與疾病相關(guān)的體細(xì)胞變異主要發(fā)生在非編碼基因組中,且經(jīng)常在基因調(diào)節(jié)區(qū)域富集[42～43]。生殖細(xì)胞和體細(xì)胞似乎通過(guò)多種機(jī)制獲得超級(jí)增強(qiáng)子,包括基因組缺失、重復(fù)、易位、插入、倒位和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)等。這些DNA序列改變可以破壞特定超級(jí)增強(qiáng)子中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),改變超級(jí)增強(qiáng)子的拷貝數(shù),并改變基因組構(gòu)像,從而導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子的激活或抑制,最終導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子附近靶基因的失控[15,19]。除了基因突變和基因組改變,染色體重排、3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化和病毒感染等也能導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子形成[13～14,17,20-22,31,35,44～51]。

4.1 DNA序列改變形成致癌超級(jí)增強(qiáng)子

超級(jí)增強(qiáng)子的DNA序列突變能改變啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的功能。例如,在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)中,TAL1(T-cellacutelymphocyticleukemiaprotein1)基因上游非編碼區(qū)域的2～18 bp小片段插入產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄因子MYB的從頭結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子形成并驅(qū)動(dòng)TAL1表達(dá)。MYB募集CBP/p300乙酰轉(zhuǎn)移酶和TAL1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物,進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)白血病關(guān)鍵基因表達(dá)(圖3A)。除了小片段插入外,SNP也經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)可以啟動(dòng)致癌超級(jí)增強(qiáng)子的活性。例如:在神經(jīng)細(xì)胞瘤(neuroblastoma)中,LMO1(LIMdomainonly1)癌基因座超級(jí)增強(qiáng)子的形成取決于GATA3與保守GATA位點(diǎn)的結(jié)合。位于超級(jí)增強(qiáng)子附近的SNP改變了保守的GATA結(jié)合位點(diǎn),將GATA變?yōu)門ATA位點(diǎn),導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子活性和LMO1表達(dá)顯著降低[46]。另外,SNP破壞與腫瘤抑制基因相關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示,BMF(BCL2-modifyingfactor)基因的15q15.1風(fēng)險(xiǎn)基因座具有慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)易感性。15q15.1風(fēng)險(xiǎn)基因座中的SNP產(chǎn)生超級(jí)增強(qiáng)子,以調(diào)節(jié)促凋亡基因BMF,并破壞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)與超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)合,從而增強(qiáng)BCL2抗凋亡功能,促進(jìn)腫瘤發(fā)生[45](圖 3B)。

4.2 染色體重排形成致癌超級(jí)增強(qiáng)子

染色體重排、倒位、易位和缺失使超級(jí)增強(qiáng)子從其天然基因區(qū)域轉(zhuǎn)移至癌基因區(qū)域,從而激活癌基因。這種現(xiàn)象被稱為“超級(jí)增強(qiáng)子劫持”,并已在多種癌癥中得到報(bào)道,包括急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌[13,15,20,35,47]。最經(jīng)典的例子是,AML細(xì)胞中一個(gè)9 kb片段的倒位,引起超級(jí)增強(qiáng)子從原來(lái)的GATA2腫瘤抑制因子重新定向到EVI1(ecotropicvirusintegration-1)癌基因增強(qiáng)子,從而導(dǎo)致腫瘤抑制因子的下調(diào)和癌基因激活[13]。增強(qiáng)子劫持的另一個(gè)例子是,在腺樣囊性癌中一個(gè)染色體易位將MYB基因遠(yuǎn)端超級(jí)增強(qiáng)子重新定位到MYB基因的近端,導(dǎo)致MYB高表達(dá)[49]。進(jìn)一步的染色體構(gòu)象捕獲(chromosome conformation capture,3C)分析證實(shí),MYB啟動(dòng)子和異常轉(zhuǎn)移的超級(jí)增強(qiáng)子之間的染色質(zhì)相互作用[52],而且易位的超級(jí)增強(qiáng)子元件包含MYB結(jié)合位點(diǎn),可被MYB自身主動(dòng)結(jié)合并形成正反饋環(huán),從而進(jìn)一步增強(qiáng)MYB表達(dá)。新近發(fā)現(xiàn)的一例增強(qiáng)子劫持是C19MC-TTYH1(chr19q13.41miRNAcluster-Tweetyhomologue1)基因融合產(chǎn)生的復(fù)合超級(jí)增強(qiáng)子,其擴(kuò)增了C19MC-LIN28A-MYCN(chr19q13.41miRNAcluster-Lin28homologA-MYCN)致癌回路,并驅(qū)動(dòng)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B6(DNMT3B6)的表達(dá),從而促進(jìn)了胚胎腫瘤的惡性表觀遺傳狀態(tài)[53]。除基因組重排外,拷貝數(shù)變異也可以導(dǎo)致致癌超級(jí)增強(qiáng)子激活。體細(xì)胞拷貝數(shù)和12種癌細(xì)胞的組織特異性表觀遺傳分析表明,KLF5(krüppellikefactor5)、USP12(ubiquitin-specificprotease12)、PARD6B(par-6familycellpolarityregulatorbeta)、MYC和其他癌癥相關(guān)基因附近超級(jí)增強(qiáng)子的局部擴(kuò)增,可以驅(qū)動(dòng)癌基因的異常表達(dá)[48]。

4.3 3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化形成致癌超級(jí)增強(qiáng)子

哺乳動(dòng)物基因組被劃分為一系列平均大小約為1 Mb的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域(topologically associating domain,TAD)。這些TAD是染色體的結(jié)構(gòu)和功能單元,不同細(xì)胞類型中TAD結(jié)構(gòu)是保守的[30,54]。TAD具有限制長(zhǎng)距離增強(qiáng)子與啟動(dòng)子相互作用的功能,從而使啟動(dòng)子與遠(yuǎn)端增強(qiáng)子和超級(jí)增強(qiáng)子隔離[12,19,54](圖 3C)。

圖3 致癌超級(jí)增強(qiáng)子形成的各種機(jī)制[31](A)在TAL1癌基因上游非編碼區(qū)域的小片段插入誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄因子MYB的從頭結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)TAL1表達(dá)的超級(jí)增強(qiáng)子形成。MYB結(jié)合并募集其H3K27乙?；附Y(jié)合伴侶CBP,即含有RUNX1和GATA3的TAL1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物;(B)15q15.1風(fēng)險(xiǎn)基因座中的SNP產(chǎn)生促凋亡基因BMF的超級(jí)增強(qiáng)子,并破壞轉(zhuǎn)錄因子RELA與超級(jí)增強(qiáng)子的結(jié)合,從而激活BCL2的抗凋亡功能,促進(jìn)腫瘤發(fā)生;(C)致癌基因的激活通過(guò)結(jié)構(gòu)變異或表觀遺傳效應(yīng)改變而發(fā)生。Fig.3 Various mechanisms of carcinogenic super enhancer formation[31](A)Insertion of a small fragment in a noncoding region upstream of the TAL1 oncogene induces a de novo binding site for the transcription factor MYB,resulting in the formation of a super enhancer that drives TAL1 expression.MYB binds and recruits its H3K27 acetylase-binding partner CBP,the TAL1 transcription complex containing RUNX1 and GATA3;(B)SNPs in the 15q15.1 risk locus generate a super enhancer of the pro-apoptotic gene BMF and disrupt the binding of transcription factor RELA to the super enhancer,thereby activating the anti-apoptotic function of BCL2 and promoting tumorigenesis;(C)Activation of oncogenes occurs through structural variation or altered epigenetic effects.

TAD由染色質(zhì)環(huán)組成,通常涉及CTCF(CCCTC-binding factor)和黏連蛋白。與CTCF相關(guān)的邊界元件的存在可防止TAD異位接觸,并使TAD與鄰近增強(qiáng)子隔離。近期,研究人員開(kāi)發(fā)了一種順式表達(dá)結(jié)構(gòu)改變作圖算法,用于系統(tǒng)預(yù)測(cè)癌癥相關(guān)基因過(guò)度表達(dá)的概率。研究者們通過(guò)這種方法發(fā)現(xiàn)了TAD邊界缺失事件,該事件導(dǎo)致活性染色質(zhì)擴(kuò)散到相鄰融合的TAD并產(chǎn)生超級(jí)增強(qiáng)子元件,從而增加IRS4(insulinreceptorsubstrate4)基因在肉瘤(sarcoma)和鱗狀癌(squamous cancer)細(xì)胞中的表達(dá)[47]。此外,研究人員通過(guò)對(duì)CTCF和黏附素結(jié)合位點(diǎn)的分析獲得了多種癌細(xì)胞類型的突變。例如,CTCF和黏附素單倍體不足的小鼠易患癌癥[55]。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中,CTCF結(jié)合位點(diǎn)破壞TAD邊界的調(diào)控元件,激活TAL1和LMO2表達(dá),從而導(dǎo)致T細(xì)胞轉(zhuǎn)化[56]。除了TAD邊界的突變外,表觀遺傳調(diào)控的改變也已被證明是膠質(zhì)瘤(gliomas)中TAD破壞的機(jī)制[57]。據(jù)報(bào)道,CTCF位點(diǎn)甲基化的增強(qiáng)和CTCF結(jié)合力的降低會(huì)引起TAD結(jié)構(gòu)的部分破壞,從而導(dǎo)致PDGFRA(platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha)基因的活化[57]。

4.4 病毒感染形成致癌超級(jí)增強(qiáng)子

病毒感染也能誘導(dǎo)超級(jí)增強(qiáng)子形成,從而驅(qū)動(dòng)與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的關(guān)鍵基因的高水平轉(zhuǎn)錄。具有致癌活性的病毒包括EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)、人T細(xì)胞白血病病毒(human T cell leukemia virus,HTLV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)。EBV感染人類B細(xì)胞后,會(huì)產(chǎn)生癌蛋白,包括EBNA2(Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 2)、EBNA3A、EBNA3C 和 EBNALP(Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen leader protein)。這些癌蛋白激活NF-κB亞基并與超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)合,以驅(qū)動(dòng)一些癌基因和抗凋亡基因表達(dá),包括MYC、miR155、IKZF3和BCL2,從而促進(jìn)淋巴母細(xì)胞生長(zhǎng)[14,21]。此外,EBV超級(jí)增強(qiáng)子(EBV super-enhancer,ESE)能被轉(zhuǎn)錄為seRNA,促進(jìn)MYC癌基因的轉(zhuǎn)錄激活[50]。Ⅰ型HTLV(HTLV-1)經(jīng)常引發(fā)成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell leukemia/lymphoma,ATLL)。ATLL細(xì)胞的增殖依賴于BATF3(basic leucine zipper ATF-like transcription factor 3)和 IRF4(interferon regulatory factor 4)的表達(dá),它們共同驅(qū)動(dòng)ATLL特異性基因表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)錄因子HBZ(HTLV-1 basic leucine zipper factor)在所有ATLL病例中表達(dá),且HBZ與BATF3超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)合調(diào)節(jié)BATF3和MYC基因的表達(dá),從而促進(jìn)ATLL細(xì)胞增殖[58]。

5 致癌超級(jí)增強(qiáng)子涉及的信號(hào)通路

致癌超級(jí)增強(qiáng)子富含與癌癥信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因激活包括Wnt、TGF-β和LIF在內(nèi)的幾種信號(hào)通路[2,23,59～61]。

致癌超級(jí)增強(qiáng)子介導(dǎo)的Wnt通路在腫瘤發(fā)生中起重要作用。先前的研究表明,在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,與Wnt通路相關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子富含TCF4結(jié)合位點(diǎn)[23]。在基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma,BCC)的小鼠模型中,細(xì)胞是維持干細(xì)胞特性還是分化為特種細(xì)胞,與染色質(zhì)狀態(tài)改變、Wnt信號(hào)的快速激活以及超級(jí)增強(qiáng)子的重新編程都有關(guān)系。用Wnt信號(hào)抑制劑治療BCC可減少殘留的腫瘤負(fù)荷并增強(qiáng)細(xì)胞分化[59]。近期研究表明,Wnt信號(hào)和AHCTF1(AT-hook containing transcription factor 1)通過(guò)超級(jí)增強(qiáng)子介導(dǎo)的基因促進(jìn)致癌基因MYC表達(dá)[60]。MYC的癌細(xì)胞特異性門控由AHCTF1調(diào)控,它通過(guò)β-catenin將核孔蛋白與致癌超級(jí)增強(qiáng)子連接起來(lái)[60]。

此外,TGF-β和LIF信號(hào)在癌癥的發(fā)生中也起著至關(guān)重要的作用。在胰腺癌(pancreatic cancer)細(xì)胞中,TGF-Ⅱ型受體(TGF beta typeⅡreceptor,TGFBR2)中超級(jí)增強(qiáng)子的缺失顯著下調(diào)了TGFBR2的表達(dá),導(dǎo)致TGF-β誘導(dǎo)癌細(xì)胞的遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)受損[2]。用LIF重組蛋白處理的骨肉瘤(osteosarcoma)細(xì)胞顯示出致癌細(xì)胞的遷移速率增加。X染色體上的UTX(ubiquitouslytranscribedtetratricopeptiderepeat)基因是LIF轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵激活因子。UTX抑制劑GSK-J4損害LIF基因位點(diǎn)的超級(jí)增強(qiáng)子,導(dǎo)致LIF信號(hào)通路受到抑制[61]。

除了上述信號(hào)通路外,其他一些信號(hào)途徑也與致癌超級(jí)增強(qiáng)子有重要的關(guān)系。例如,突變的RAS活性促進(jìn)致癌超級(jí)增強(qiáng)子形成,抑制RAS信號(hào)將導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子失活,同時(shí)降低癌基因表達(dá)[62]。

6 針對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子靶標(biāo)的癌癥治療策略

既然超級(jí)增強(qiáng)子能引起相關(guān)癌基因轉(zhuǎn)錄水平提高,那么,阻斷超級(jí)增強(qiáng)子應(yīng)該是一種可行的抗癌治療策略。圖4展示了兩種通過(guò)靶向與超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)的復(fù)合物來(lái)抑制癌基因表達(dá)的潛在癌癥治療策略。

圖4 靶向超級(jí)增強(qiáng)子復(fù)合物的兩種方法示意圖[95]小分子抑制劑和基因編輯可以靶向超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)復(fù)合物(例如BRD4和CDK7),從而破壞超級(jí)增強(qiáng)子功能。Fig.4 Schematic diagram of two methods for targeting super enhancer complexes[95]Small molecular inhibitors and gene editing can target super enhancer associated complexes such as BRD4 and CDK7,thereby disrupting super enhancer function.

6.1 小分子抑制劑

目前,設(shè)計(jì)用于癌癥治療的小分子抑制劑包括周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)抑制劑(如 THZ1)、BRD4 抑制劑(如 JQ1或BETi)及其他抑制劑3種類型[11,16,22,37,49,63～95](表1)。

表1 致癌超級(jí)增強(qiáng)子的小分子抑制劑Table 1 Small molecular inhibitors of carcinogenic super enhancers

CDK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和癌基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[96]。據(jù)報(bào)道,CDK7不僅影響細(xì)胞周期,還與超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的癌基因調(diào)控有關(guān),因此CDK7已成為有吸引力的抗癌靶標(biāo)[72,97]。THZ1是最有效的CDK小分子抑制劑(CDK7i)之一,在多種腫瘤中具有抗癌作用,這主要?dú)w因于它對(duì)癌基因轉(zhuǎn)錄或超級(jí)增強(qiáng)子功能的干擾[97～98]。不過(guò),研究表明THZ1也能抑制肌肉細(xì)胞的分化,提示THZ1在治療癌癥過(guò)程中可能對(duì)肌肉功能產(chǎn)生副作用[99]。CDK7i也可以與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用,以提高療效并減少副作用。例如,在彌漫性橋腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(diffuse intrinsic pontine glioma)中,CDK7i與組蛋白脫乙?；敢种苿┞?lián)用時(shí),癌細(xì)胞對(duì)CDK7i的敏感性顯著提高[97]。

BRD家族由4個(gè)成員組成:BRD2、BRD3、BRD4和BRDT,它們可以識(shí)別組蛋白乙?；⒋龠M(jìn)相應(yīng)癌基因的表達(dá)[100～101]。BETi(bromodomain and extraterminal domain inhibitor)主要抑制中介體復(fù)合物BRD4與超級(jí)增強(qiáng)子的結(jié)合,從而抑制超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的癌基因表達(dá)并減弱癌細(xì)胞的增殖[102]。不過(guò),BETi抑制MYC基因的表達(dá)存在爭(zhēng)議的報(bào)道。一方面,一些研究發(fā)現(xiàn)BETi會(huì)優(yōu)先影響超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的MYC癌基因在多發(fā)性骨髓瘤和結(jié)腸癌中的表達(dá),表明BETi敏感性與c-MYC基因水平顯著相關(guān)[16,80];另一方面,也有研究沒(méi)有觀察到結(jié)腸癌中JQ1(BETi的一種)敏感性與c-MYC表達(dá)之間的顯著相關(guān)性[37]。這說(shuō)明針對(duì)患者需要量身定制個(gè)性化的治療方法[83]。目前,多個(gè)Ⅰ期臨床試驗(yàn)報(bào)告,BETi具有嚴(yán)重的副作用,包括心臟毒性、胃腸道毒性、貧血、腹瀉、疲勞、惡心、中性粒細(xì)胞減少和血小板減少癥等[91,103～104]。但是,BETi與維生素C的組合使用,可以在很大程度上減輕這些副作用[105]。

除了上述兩類抑制劑外,一些基因表達(dá)的小分子蛋白質(zhì)或表觀遺傳修飾也參與了阻斷超級(jí)增強(qiáng)子的功能。例如:破壞KDM5C[lysine(K)-specifichistonedemethylase5C)基因與超級(jí)增強(qiáng)子形成的甲基化修飾(H3K4me1和H3K4me3),為乳腺癌治療提供了一種新方法[106];在B細(xì)胞系急性淋巴細(xì)胞白血病中過(guò)表達(dá)IKAROS基因,可以干擾MYC超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域的H3K27ac3修飾,從而抑制MYC基因的表達(dá)[107];PAX3和PAX5是超級(jí)增強(qiáng)子在肺泡肺橫紋肌肉瘤(pulmonary alveolar rhabdomyosarcoma)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,PAX抑制劑具有顯著的抗腫瘤作用[108～109]。此外,在脊索瘤(chordoma)中,IRS4/IGF2蛋白可以直接與超級(jí)增強(qiáng)子序列相互作用,抑制超級(jí)增強(qiáng)子的功能[71]。

6.2 基因編輯

癌細(xì)胞中異常的堿基插入、缺失和染色質(zhì)重排可導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子形成。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可用于消除上述原因引起的超級(jí)增強(qiáng)子的形成,因此我們可以通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗癌治療。例如,RUNX1(RUNX family transcription factor 1)是調(diào)節(jié)正常和惡性血細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞RUNX1基因的超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域會(huì)增加急性白血病細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而改變AML小鼠的存活率[110]。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的原始樣本和細(xì)胞系中,TAL1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游7.5 kb處發(fā)生插入/缺失突變,促使MYB結(jié)合位點(diǎn)和超級(jí)增強(qiáng)子形成,從而導(dǎo)致癌基因表達(dá)上調(diào);利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除異常插入的堿基后,急性淋巴細(xì)胞白血病樣本中不再有超級(jí)增強(qiáng)子和TAL1基因過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象[17]。此外,CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)也可用于消除AML細(xì)胞中異常增強(qiáng)子的激活。

CRISPR/Cas9敲入系統(tǒng)在與SNP相關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)癌基因的表達(dá)模式中也很有前景[111～112]。在結(jié)腸細(xì)胞中,SNP rs6854845在超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域形成并影響超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域中H3K4me1和H3K27ac的轉(zhuǎn)移富集,進(jìn)而影響超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá),因此,SNP rs6854845被認(rèn)為是結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素之一[113～114]。基于CRISPR/Cas9的SNP位點(diǎn)基因編輯可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)SNP和超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)基因之間的相互作用來(lái)改善細(xì)胞中的多種致病性變化。

7 總結(jié)與展望

致癌超級(jí)增強(qiáng)子具有比普通增強(qiáng)子更強(qiáng)的激活癌基因轉(zhuǎn)錄的能力,因而是很多惡性腫瘤發(fā)病的重要原因。致癌超級(jí)增強(qiáng)子的形成主要是由于癌基因增強(qiáng)子調(diào)控區(qū)域的DNA序列突變、堿基缺失或插入、染色體結(jié)構(gòu)重排、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)TAD邊界缺失以及某些病毒感染,其導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子和中介體復(fù)合物與普通增強(qiáng)子及啟動(dòng)子形成強(qiáng)大的超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)并被異常激活,隨后通過(guò)影響Wnt、TGF-β、LIF及Ras等信號(hào)通路促使癌基因、抗凋亡基因或抑癌基因異常表達(dá),最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生。雖然迄今針對(duì)致癌超級(jí)增強(qiáng)子的精細(xì)結(jié)構(gòu)和致病機(jī)理的研究還不夠深入,但是已知的致癌超級(jí)增強(qiáng)子的形成機(jī)制,還是能為腫瘤預(yù)防和治療提供新的思路。例如:發(fā)生在增強(qiáng)子區(qū)域的有害序列變異可以通過(guò)廣泛使用的CRISPR基因編輯工具進(jìn)行修復(fù);轉(zhuǎn)錄因子和中介體復(fù)合物的異常激活可以通過(guò)一些小分子抑制劑實(shí)現(xiàn)靶向抑制。以往有關(guān)抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)主要關(guān)注癌基因或抑癌基因突變及其異常激活,但耐藥性的存在及癌基因的低突變頻率是不可忽視的影響因素[115～116]。近年來(lái),隨著表觀基因組學(xué)研究的深入及致癌超級(jí)增強(qiáng)子的不斷發(fā)現(xiàn),基于表觀遺傳修飾設(shè)計(jì)的藥物以及針對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子及其相關(guān)復(fù)合物的小分子抑制劑和基因編輯療法,可能具有更好的抗腫瘤應(yīng)用前景[117]。