環(huán)狀RNA在肺癌中的研究進展

葛祥偉 張智博 智曉玉 汪進良

肺癌是目前世界范圍內最常見的惡性腫瘤疾病，對人類生命健康造成嚴重威脅。據統(tǒng)計，2018年全球約有210萬肺癌新增病例和180萬肺癌死亡病例，發(fā)病率和死亡率居所有癌種中首位[1]。根據組織學分型，肺癌可以分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩種，其中SCLC和NSCLC分別約占肺癌總數的15%和85%[2]。盡管臨床診斷和治療手段均有所改善，但由于診斷不及時、受益人群有限、患者耐藥等原因，肺癌的5年生存率仍不樂觀。另外，缺乏相對特異性的腫瘤標志物為肺癌的診治及預后增添了挑戰(zhàn)。因此，有必要深入研究肺癌分子機制以探尋肺癌潛在的生物標志物及治療靶點。

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一種特殊的內源性非編碼RNA。早在20世紀70年代circRNA就被發(fā)現存在于RNA病毒中[3]。但介于當時技術的局限，circRNA被認為是剪接過程的副產物，因而并未受到廣泛關注[4]。近些年隨著高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展，circRNA被大量發(fā)現并逐漸成為RNA領域的研究熱點。目前，諸多研究證實circRNA能夠參與肺癌發(fā)生發(fā)展過程的調控，并有望為肺癌的診斷、治療及預后提供新思路[5,6]。

1 circRNA的生物學特性及功能

circRNA是共價閉合的非編碼RNA分子，在真核生物轉錄組中廣泛存在。通常根據circRNA的來源將其分為：外顯子circRNAs（ecRNAs）、內含子circRNA（ciRNAs）以及外顯子-內含子circRNA（EIciRNAs）[7]。其中以外顯子circRNAs最為常見。與線性RNA不同，circRNA沒有5’端的帽子結構和3’端的多聚腺苷酸尾，能夠抵抗核酸外切酶RNase R的降解，因而circRNA相較于線性RNA穩(wěn)定性好且半衰期更長[8]。研究[9]還發(fā)現，circRNA表現出良好的物種保守性。另外，circRNA的表達具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，提示circRNA可能參與機體多種病理生理過程的調控[10]。

circRNA的功能研究多集中在以下幾個方面：①作為分子海綿吸附miRNA。競爭性內源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）機制指出具有相同miRNA應答元件（miRNA response elements, MREs）的RNA能夠競爭性結合miRNAs，從而相互調控影響彼此的表達[11]。目前，多數circRNA研究圍繞miRNA分子海綿這一機制展開；②通過結合RNA聚合酶II調控親本基因的轉錄[12]；③與RNA結合蛋白相互結合發(fā)揮生物學作用[9]；④翻譯蛋白。例如Yang等[13]發(fā)現Circ-FBXW7編碼蛋白進而抑制膠質瘤發(fā)生。

2 circRNA與肺癌的診斷

早期且準確的診斷對肺癌的治療至關重要。盡管已有多種診斷方法應用于臨床，但由于費用、準確度以及患者接受程度等原因，當前的手段仍有改進空間。因此對肺癌診斷標志物的探索依然很有必要。circRNA具有保守性、穩(wěn)定性、特異性等優(yōu)勢，因而具有成為肺癌新興標志物的潛能[14]。一項針對中國肺癌人群的meta分析匯集了8項關于肺癌組織和血液中circRNA診斷效能的研究顯示，納入的circRNA總靈敏度和特異度分別為0.77和0.76，總受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的曲線下面積（area under curve,AUC）為0.78，提示circRNA在中國肺癌人群中具有診斷潛能[15]。

2.1 肺癌組織circRNA的診斷價值 Wang等[16]發(fā)現，在區(qū)分NSCLC和正常組織方面，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821的AUC分別為0.921和0.863，展現了這兩種circRNA對肺癌的診斷價值。Liu等[17]證實hsa_circ_11780在NSCLC組織和細胞系中表達均顯著下降，且低表達hsa_circ_11780的患者出現較大腫瘤（>3 cm）、遠處轉移和較差生存預后的風險更大。Zhao等[18]對61對配對的肺癌和癌旁組織進行分析，發(fā)現hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516在NSCLC中低表達，二者的AUC分別為0.81和0.82，同樣表現出較好的診斷能力。而聯合hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516后的總AUC提升至0.90，提示肺癌組織circRNA聯合診斷的重要性。

2.2 血液circRNA的診斷價值 相比于傳統(tǒng)活檢，液體活檢具有操作簡單、侵入性小、成本低等優(yōu)點，因此研究前景廣闊。目前已有文獻初步證實血漿circRNA具有較好的診斷能力，如circRNA-002178[19]、circMAN1A2[20]等。Chen等[21]通過高通量測序技術以識別肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者血漿外泌體中差異表達的circRNA。與對照組相比，105個circRNA表達升高，78個circRNA表達降低。進一步研究發(fā)現，hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346在LUAD早期即表達明顯上調，而對照組血漿幾乎檢測不到，提示hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346可能成為早期LUAD診斷候選標記物。

Liu等[22]檢測分析hsa_circ_0005962和hsa_circ_0086414在LUAD患者血漿中差異表達。二者聯合診斷AUC達到0.81，提示雙circRNA可能作為診斷LUAD的非侵入性生物標志物。另外，血液circRNA可能與腫瘤進展有關，LUAD患者術后hsa_circ_0005962表達較術前明顯下降。而hsa_circ_0086414的表達水平與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變相關。與野生型患者相比，EFGR突變型患者hsa_circ_0086414高表達。該研究表現了血液circRNA多方面的應用價值。當然，為實現血液circRNA肺癌診斷的臨床轉化，尚需更大的樣本量以及更為深入的機制探索。

3 circRNA與肺癌的治療

既往研究發(fā)現circRNA能夠作為調控分子促進或者抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展，因而調控circRNA的表達水平對肺癌的惡性生物學行為具有重要意義。目前，多項研究依據circRNA的ceRNA機制進行肺癌惡性生物學行為的機制探索（表1）。例如，Yao等[23]發(fā)現circGFRA1在肺癌細胞內表達升高，并通過circGFRA1/miR-188-3p/PI3K/AKT通路促進肺癌的惡性增殖。LIMK1作為一種絲蘇氨酸蛋白激酶，通過影響肌動蛋白細胞骨架參與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），調控腫瘤進程[24]。Qin等[25]發(fā)現circ_0012673在肺癌組織和細胞系中高表達。circ_0012673海綿吸附miR-320a導致下游靶蛋白LIMK1表達升高，從而抑制肺癌細胞凋亡，促進其增殖、遷移和EMT進程。

3.1 circRNA與肺癌耐藥 隨著抗腫瘤藥物的不斷問世，為肺癌患者帶來了更多希望，但是耐藥問題依然是困擾臨床治療的一大難題。因此，亟待對肺癌耐藥機制進行深入探索以探尋高效的生物標志物或治療靶點。研究發(fā)現，部分circRNA能夠參與肺癌的耐藥進程（表2）。Hong等[44]研究發(fā)現，circCPA4作為let-7的分子海綿，其下調可以影響程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1,PD-L1）使其表達降低，進而抑制NSCLC細胞的生長、遷移和EMT過程。另外，NSCLC來源的含PD-L1的外泌體能夠促進其干細胞特性，增強NSCLC細胞對順鉑的耐受性。Li等[42]報道circ_0002483能夠降低miR-182-5p表達水平，解除其對靶分子GRB2、FOXO1、FOXO3的抑制，進而增強NSCLC對紫杉醇的敏感性。circRNA_103762在肺癌中高表達，通過抑制靶蛋白CHOP誘導肺癌的多藥耐藥[45]。

3.2 circRNA與肺癌免疫治療 腫瘤細胞能夠表達多種機制來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，為自身的生長創(chuàng)造條件。程序性死亡受體1（programmed death protein 1, PD-1）是一種跨膜蛋白，已被發(fā)現幾乎表達于各種類型的腫瘤細胞表面，并通過于PD-L1相互作用參與腫瘤的免疫逃逸機制[53]。近些年，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）為肺癌治療提供了強大武器。Wang等[19]研究發(fā)現，circRNA-002178在肺腺癌組織中異常高表達，通過吸附miR-34促進肺癌細胞PD-L1的表達。同時，肺癌細胞能夠分泌外泌體circRNA-002178并傳遞給T細胞，通過抑制miR-28-5p進而促進T細胞PD-1的表達。文獻[54]證實，CXCR4參與細胞毒性T淋巴細胞耗竭、誘導抗PD-1藥物耐藥等過程。Zhang等[55]發(fā)現circFGFR1/miR-381-3p/CXCR4通路通過促進肺癌細胞對抗PD-1治療藥物的耐藥進程，進而發(fā)揮免疫抑制效應。提示circRNA能夠參與腫瘤免疫逃逸機制，相關通路抑制劑的聯合使用有望提高臨床療效，為腫瘤的免疫療法提供新的思路。

4 circRNA與肺癌的預后

肺癌患者的預后監(jiān)測是評價臨床診療效果的關鍵環(huán)節(jié)，對調整用藥方案、改善患者生存時間有重要意義。研究證實，多種circRNA能夠作為肺癌患者獨立預后指標，與肺癌患者生存期緊密相關，如circSMARCA5[52]、circ_11780[17]、circCRIM1[37]。Liu等[17]對93例NSCLC患者腫瘤組織進行RT-qPCR檢測發(fā)現hsa_circ_11780異常低表達，而低表達hsa_circ_11780的患者往往腫瘤更大，伴有遠處轉移以及更嚴重的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結-轉移（tumornode-metastasis, TNM）分期。以Kaplan-Meier法進行生存分析表明低表達hsa_circ_11780的NSCLC患者總生存期（overall survival, OS）更短。circHIPK3來源于染色體11p13區(qū)的癌基因HIPK3的2號外顯子。Chen等[6]發(fā)現敲低circHIPK3能夠抑制NSCLC細胞株A549、H838和H1299增殖、遷移、侵襲能力，并誘導自噬的發(fā)生，而circHIPK3和linHIPK3對自噬的調控作用相互拮抗，circHIPK3:linHIPK3（C:L）比值能夠反映腫瘤細胞的自噬水平。對于晚期NSCLC患者來說，高C:L比值（>0.49）又是其低生存率的有效指標。這些結果提示自噬調節(jié)因子circHIPK3具有作為預后因子的潛在臨床應用價值。

表 1 circRNA通過ceRNA機制作用于肺癌惡性生物學行為的總結Tab 1 Summary of circRNA acting on malignant biological behaviors of lung cancer through ceRNA mechanism

表 2 肺癌circRNA對抗腫瘤藥物敏感性影響的總結Tab 2 Summary of the effects of circRNA on tumor drug sensitivity

EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKIs）是EGFR敏感突變的NSCLC患者的重要治療選擇。Liu等[56]通過對使用EGFR-TKI吉非替尼后有效組與無效組NSCLC患者血漿circRNA測序，檢測到1,377個差異表達的circRNA。RT-qPCR檢測證實hsa_circ_0109320與hsa_circ_0134501在吉非替尼有效組中高表達。進一步研究發(fā)現hsa_circ_0109320的高表達與患者更好的無進展生存期（progression-free survival,PFS）相關，提示hsa_circ_0109320可能是反映吉非替尼療效的生物標志物。Fu等[57]發(fā)現hsa_circRNA_012515在NSCLC的組織、細胞尤其是吉非替尼耐藥的細胞株中表達顯著升高。另外，hsa_circRNA_012515表達上調與患者淋巴結轉移、腫瘤分期及預后密切相關。高表達hsa_circRNA_012515的NSCLC患者其OS和PFS更短。研究者還發(fā)現與I期/II期NSCLC患者相比，hsa_circRNA_012515在III期/IV期患者中的表達水平更高。由此可見，hsa_circRNA_012515具有良好的臨床相關性，可能是預測NSCLC患者不良預后的生物標志物。

5 展望

隨著研究的不斷深入，circRNA與肺癌的聯系正在日益凸顯。一方面，circRNA作為促癌或抑癌因子調控肺癌的增殖、轉移、凋亡、自噬等生物學行為，調節(jié)化療或靶向藥物的敏感性以及免疫治療療效，為輔助臨床治療提供初步理論基礎；另一方面，組織或血液中circRNA的差異表達在肺癌的早期診斷及預后評估都展現了一定的相關性，有望成為肺癌潛在的生物標志物。但是目前circRNA研究尚處于早期階段，多數研究者將重點置于miRNA海綿吸附功能探索，許多機制尚未闡明。其臨床相關性研究也局限于少量樣本，其轉化價值有待商榷。相信未來circRNA領域將會有更多突破，為肺癌診療提供更多思路。