山蒼子油對斜紋夜蛾細胞增殖和凋亡的影響

李湘洲，王力群，黃露，周軍，張勝，李文生，3

（1.中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院，湖南長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學南方林業(yè)生態(tài)應用技術國家工程實驗室，湖南長沙 410004；3.湖南大學化學化工學院，湖南長沙 410082）

山蒼子Litsea cubeba（Lour.）Pers.，又名山雞椒、木姜子、黑木姜子、香葉等，多年生落葉小喬木，樟科木姜子屬植物，廣泛分布于長江以南的各個省區(qū)，是我國南方特有的香料植物資源之一.山蒼子油是從山蒼子果實的果皮中提取的主要由單萜和倍半萜類化合物組成的精油，其主要成分為檸檬醛，同時還含有檸檬烯、甲基庚烯酮、芳樟醇、α-松油醇、香葉烯、α-蒎烯、β-蒎烯、檜萜和石竹烯等[1-2].研究發(fā)現(xiàn)山蒼子油具有較好的生物活性，如抑菌活性、抗炎活性、抗癌活性、抗氧化活性等[3-7].Liu 等[8]研究了山蒼子油對雌性埃及伊蚊具有良好的驅避活性；Park 和Chen等[9-10]報道了山蒼子油對赤擬谷盜、玉米象成蟲、谷蠹成蟲和長角扁谷盜成蟲顯示較強的驅避和觸殺作用；Vong 等[11]報道了山蒼子油對伊蚊和庫蚊均具有一定的驅避活性.

山蒼子油中主要成分檸檬醛的含量一般達到60%以上[12].檸檬醛[13]是由順、反兩種幾何異構體香葉醛（反式）和橙花醛（順式）以混合的形式存在于自然界中.大量文獻研究表明，檸檬醛對昆蟲具有趨避活性，如檸檬醛對蠶蛾具有引誘作用，能使埃及伊蚊卵不能正常孵化[14].檸檬醛對玉米象和綠豆象均具有較高的熏死率[15].在空氣中，當檸檬醛濃度達到2.2 mg/mL 時，兩天內可以使白蟻全部死亡[16].

斜紋夜蛾，Spodopdera litura，東南亞廣泛分布的害蟲之一，可對大豆、棉花和蔬菜等作物產(chǎn)生極大的危害.目前防治這類蟲害的主要手段依然為使用化學藥劑，但化學藥劑使用過多不僅會對環(huán)境造成污染，強化害蟲的抗藥性，而且還會對農作物品質造成不良影響[17].

與傳統(tǒng)化學農藥[18-19]相比，植物源農藥[20-22]由于有效成分為天然物質，因此具有施用后較易分解、對環(huán)境影響小、組分多元化以及不容易使施用害蟲產(chǎn)生抗藥性、對有益生物（即害蟲天敵）相對安全等優(yōu)勢，是新型、高效、無殘留、無公害的“綠色農藥”.從植物源山蒼子中提取得到的活性物質可以對一些害蟲進行滅殺.

利用離體昆蟲細胞代替活體進行毒力測定是一種直接反映化合物毒性作用的檢測方法.本文通過CCK、MTT 法研究山蒼子油抑制SL 細胞的活性，利用流式細胞術研究山蒼子油對離體SL 細胞凋亡的影響.采用氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）技術對山蒼子油的主要化學成分進行分析，同時利用流式細胞術進一步研究了山蒼子油中主要成分檸檬醛對SL細胞凋亡的作用.論文力圖從細胞水平層面探究山蒼子油對離體昆蟲細胞的毒殺活性，并初步確定山蒼子油毒殺昆蟲細胞的主要活性成分，為山蒼子油基新型植物源農藥的開發(fā)與利用提供科學依據(jù).

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

供試細胞：斜紋夜蛾細胞，上海哈靈生物科技有限公司提供；并添加昆蟲細胞培養(yǎng)基，于28 ℃孵育箱中常規(guī)培養(yǎng).

供試試劑及儀器：山蒼子油、檸檬醛，產(chǎn)于湖南省永順縣，其中山蒼子油為水蒸氣蒸餾法提取，通過減壓精餾法精制得到，其檸檬醛含量大于96%；魚藤酮、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶消化液、CCK 試劑、MTT 試劑、Annexin V-FITC-PI 雙染試劑盒，均購自上海生物科技有限公司.

BC-J80S 型CO2細胞培養(yǎng)箱，上海喆圖生物有限公司；AE2000 型倒置顯微鏡，上海光學生物儀器公司；TDL-5 型低速離心機，滄州雙營建筑儀器設備有限公司；HBS-1096C 型酶標儀，上海沛歐分析儀器有限公司；流式細胞儀，上海儀檢測科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 CCK 法檢測山蒼子油對SL 細胞存活的影響

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的SL 細胞，收集上層培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶用PBS 洗滌1 次，棄去PBS，加入1 mL 胰蛋白酶-EDTA 靜置消化1 min，于顯微鏡下觀察消化完全后棄去胰酶，加入含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打收集細胞.1 200 r/min 離心5 min 后，計數(shù)，調節(jié)細胞密度為5×104個/mL 分別接種于96 孔每孔100 μL，恒溫箱中于28 ℃，過夜.用二甲基亞砜（DMSO）溶解山蒼子油，在實驗前用培養(yǎng)基稀釋至山蒼子油濃度分別為0、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%體積比，按各分組加入不同濃度的山蒼子油，每孔終體積為150 μL.每24 h后取出1 塊96 孔板，每孔中避光加入CCK 溶液15 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，酶聯(lián)檢測儀檢測波長為450 nm 處吸光度（OD），記錄數(shù)據(jù)，按式（1）計算細胞存活率.

1.2.2 MTT 檢測山蒼子油對SL 細胞增殖能力的影響

用胰酶消化收集對數(shù)期SL 細胞，調整各組細胞懸液濃度至5×105cell/mL；取1 塊96 孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液，鋪板使待測細胞為2×104cell/孔（邊緣孔用無菌PBS 填充以消除邊緣效應），每組設置5 個復孔；5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，用DMSO 分別溶解山蒼子油和魚藤酮，實驗前用培養(yǎng)基溶液分別將山蒼子油濃度稀釋至0 %、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%體積比，魚藤酮質量濃度稀釋至30、60、100 μg/mL，按分組加入所需試劑至每孔終體積為150 μL.每24 h 后取出96孔板檢測，移除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含10%MTT 溶液培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 的DMSO，使結晶物充分溶解；加DMSO 后10 min 內，用酶標儀檢測各孔波長570 nm 的吸光值.

1.2.3 細胞流式法檢測山蒼子油對SL 細胞凋亡的影響

細胞準備及藥物處理，培養(yǎng)SL 細胞至80%～90%滿瓶，收集細胞，以5×105個/瓶的細胞密度接種T25 細胞培養(yǎng)瓶，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細胞密度達80%后，換液，加入不同濃度的山蒼子油和魚藤酮，處理48 h.流式檢測用PBS 洗滌各組細胞2 次（1 000 r/min，離心5 min）收集細胞；再加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細胞.

1.2.4 山蒼子油化學成分的分析

山蒼子油經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取獲得，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用對山蒼子油的主要化學成分進行分析.

GC 條件：Elite-5MS 分析色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；高純He 為載氣；流速1 mL/min；進樣口溫度260 ℃；進樣量0.5 μL；分流比20 ∶1.

MS 條件：EI 離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；m/z 掃描范圍30～600.山蒼子油升溫程序：初溫80 ℃，保持3 min，5 ℃/min升溫，至100 ℃，保持1 min，10 ℃/min 升溫速率升至130 ℃，保持3 min，20 ℃/min 升溫速率升至230 ℃，保持6 min；溶劑延遲5 min.

1.2.5 細胞流式法檢測檸檬醛對SL 細胞凋亡的影響

按1.2.3 中所述方法驗證不同濃度的檸檬醛處理SL 細胞對其的凋亡作用.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS22.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用P 檢驗進行顯著性分析，*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 CCK 法檢測山蒼子油對SL 細胞存活的影響

CCK 法所用試劑中含有WST-8 [其化學名稱為2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二（1-Merhoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料（Formazandye）.生成的產(chǎn)物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析.

按1.2.1 中所述方法以不同濃度的山蒼子油（0%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%）分別處理SL 細胞，得到不同濃度的山蒼子油對SL 細胞存活率的影響，結果見圖1.

圖1 CCK 法檢測山蒼子油對SL 細胞存活率的影響Fig.1 Effect of SL cell survival rate on LCEO by CCK method

由圖1 可知，山蒼子油抑制SL 細胞存活與其處理時間和山蒼子油的濃度有關.當處理時間為24 h時，隨著山蒼子油濃度的增大，SL 細胞的存活率明顯降低（P＜0.05）；當山蒼子油濃度增大至0.01%時，SL 細胞的存活率下降至40%；繼續(xù)增大山蒼子油的濃度，SL 細胞的存活率略有降低（P＞0.05）.當山蒼子油濃度一定時，延長處理時間，SL 細胞的存活率也呈下降趨勢；山蒼子油濃度為0.01%時，其處理SL細胞24 h 和48 h 的細胞存活率分別為40%和30%；而處理72 h 后，SL 細胞的存活率僅為0.9%，呈顯著降低的趨勢（P＜0.01）.

2.2 MTT 法檢測山蒼子油抑制SL 細胞增殖能力的影響

MTT 法是利用活細胞代謝產(chǎn)生琥珀脫氫酶將MTT 還原，且形成不溶于水的藍紫色甲臜（Formazam）結晶，通過顏色反應觀察細胞代謝的活化程度，從而直接檢測細胞的活性.

按1.2.2 中所述方法以不同濃度（0%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%）的山蒼子油分別處理SL 細胞24 h、48 h 后，得到不同濃度的山蒼子油對SL 細胞存活率的影響見圖2，不同濃度（30 μg/mL、60 μg/mL、100 μg/mL）的魚藤酮對照組處理SL細胞24h、48h 后，SL 細胞存活率的影響見圖3.

由圖2 可知，利用MTT 法檢測山蒼子油對SL細胞存活率的影響與CCK 法的結果類似.當作用時間均為24 h 時，隨著山蒼子油濃度的增大，SL 細胞的存活率呈下降趨勢；當山蒼子油濃度為0.015%時，SL 細胞的存活率顯著降低（P＜0.05）；繼續(xù)增大山蒼子油濃度，SL 細胞存活率略有降低（P＞0.05）.當作用時間延長至48 h 時，隨著山蒼子油濃度的提高，SL 細胞的存活率也呈下降趨勢，當山蒼子油濃度為0.01%時，SL 細胞的存活率僅為10%；繼續(xù)增大山蒼子油濃度，SL 細胞的存活率略有下降.

圖2 MTT 法檢測山蒼子油對SL 細胞存活率的影響Fig.2 Effect of SL cell survival rate on LCEO by MTT method

圖3 MTT 法檢測魚藤酮對SL 細胞存活率的影響Fig.3 Effect of SL cell survival rate on rotenone by MTT method

魚藤酮是從豆科植物的根和莖中提取的一種天然毒素，對螨蟲、線蟲等均具有較好的殺蟲活性[23].由圖3 可知，魚藤酮對SL 細胞的增殖也具有抑制作用，抑制效果與其濃度和處理時間有關.對比魚藤酮和山蒼子油抑制SL 細胞的效果可知，0.01%的山蒼子油處理SL 細胞后，其抑制SL 細胞的效果優(yōu)于30 μg/mL 的魚藤酮，說明山蒼子油對SL 細胞的抑制作用較好，研究結果與WEN 等[24]的基本一致.

2.3 流式細胞法檢測山蒼子油對離體SL 細胞的凋亡作用

在細胞凋亡的早期，細胞膜表面將發(fā)生破損，同時細胞內膜的磷脂腺絲氨酸（PS）出現(xiàn)外翻暴露.Annexin V 是相對分子質量為35 000 的Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS 具有很高的親和性，可以與凋亡早期暴露于細胞外的PS 相結合.因此，可以將標記熒光染料的Annexin V 來識別早期的細胞凋亡.通常利用Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）雙染色來區(qū)分凋亡和壞死細胞.PI 的膜通透性很差，因而只能標記晚期凋亡和壞死的細胞.在流式細胞儀的結果中可見Annexin V-FITC（+）、PI（-）細胞為凋亡細胞，而Annexin V-FITC（+）、PI（+）為壞死細胞.

按1.2.3 中所述方法以不同濃度的（0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%）山蒼子油、魚藤酮（10 μg/mL）處理SL 細胞，得到不同濃度山蒼子油、魚藤酮對SL 細胞的凋亡效果，結果見圖4 和圖5.

圖4 流式細胞法檢測山蒼子油對SL 細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of SL cell apoptosis rate on LCEO by flow cytometry

圖5 山蒼子油處理SL 細胞的流式細胞凋亡圖Fig.5 Apoptosis of SL cells treated with LCEO

由流式細胞檢測結果圖4 可知，不同濃度的山蒼子油（0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%）處理SL 細胞48 h 后，SL 細胞的凋亡率分別為2.36%、2.38%、88.08%、91.50%、93.33%，表明山蒼子油具有促進SL 細胞凋亡的作用，且呈劑量正相關，即當山蒼子油濃度增大時，SL 細胞的凋亡率亦增大，當山蒼子油的濃度從0.01%增大至0.015%時，SL 細胞的凋亡率明顯增大（P＜0.01）.10 μg/mL 的魚藤酮處理SL 細胞48 h 后，SL 細胞凋亡率僅為18.89%.

2.4 山蒼子油的化學成分分析

通過CKK 法、MTT 法和流式細胞法確定了山蒼子油對SL 細胞具有促進凋亡的作用，且呈劑量正相關，為確定山蒼子油對SL 細胞凋亡的主要活性成分，首先按1.2.4 中所述方法研究了水蒸氣蒸餾法提取的山蒼子油的化學成分，結果見圖6 和表1.

圖6 山蒼子精油的總離子流圖Fig.6 Total ion flow diagram of LCEO

表1 山蒼子精油成分分析Tab.1 Composition analysis of LCEO

由檢測結果可知，水蒸氣蒸餾法提取的山蒼子油共分離出43 個組分，經(jīng)與Nist 標準譜庫對照，鑒定出23 個主要的化學成分，占精油中化合物總量的97.98%，其中主要包括單萜、倍半萜及其含氧衍生物，含量較高的組分有香葉醛（35.24%）、橙花醛（33.63%）、檸檬烯（9.05%）、香茅醛（3.14%）、桉樹腦（1.84%）、芳樟醇（1.80%）和1-石竹烯（1.64%）等，檸檬醛的含量（香葉醛和橙花醛之和）高達68.87%.

2.5 流式細胞法檢測檸檬醛對SL 細胞凋亡的影響

檸檬醛作為山蒼子油的主要活性成分，其對昆蟲具有趨避活性的研究已有報道[14-16].為驗證檸檬醛對SL 細胞的影響，利用1.2.5 中所述的流式細胞法研究了檸檬醛對離體SL 細胞的凋亡作用，結果見圖7 和圖8.

圖7 流式細胞法檢測檸檬醛對SL 細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of SL cell apoptosis rate on LCEO by flow cytometry

圖8 檸檬醛處理SL 細胞的流式細胞凋亡圖Fig.8 Flow cytometry of SL cells treated with citral

由圖7、8 可知，SL 細胞的凋亡率與檸檬醛濃度呈正相關，不同濃度的檸檬醛（0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%）處理SL 細胞48 h 后，SL 細胞的凋亡率分別為2.89%、20.77%、21.89%、24.88%、81.97%、82.63%.當檸檬醛濃度大于0.015%時，SL細胞的凋亡率顯著增大（P＜0.01），說明檸檬醛作為山蒼子油的主要成分，具有促進SL 細胞凋亡的作用，且隨檸檬醛濃度的增大，SL 細胞的凋亡率也隨之增大.這與Oliveira 等[25]對麥冬草精油及其主成分檸檬醛對草地貪夜蛾的毒理研究結果一致，同時也從細胞水平層面驗證了Zhang 等[26]利用檸檬醛熏蒸昆蟲的趨避效果.研究初步表明，檸檬醛是山蒼子油抑制SL 細胞凋亡的主要活性成分.

3 結論

本文利用CCK、MTT 和流式細胞法分別研究了不同濃度的山蒼子油對SL 細胞增殖與凋亡的作用，研究結果表明：不同檢測方法得到的結果一致，表明山蒼子油具有抑制SL 細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，且呈一定濃度和作用時間的依賴關系.同時進一步采用流式細胞凋亡法檢測山蒼子油中主要活性成分檸檬醛對SL 細胞增殖與凋亡的作用，初步確定了檸檬醛是山蒼子油中誘導SL 細胞凋亡的主要活性成分.

據(jù)文獻報道魚藤酮是一種普遍使用的殺蟲劑，其分子式為C23H22O6[27].魚藤酮是一個典型的作用于昆蟲的植物源殺蟲劑，其進入細胞后會阻斷NADH與輔酶Q 之間的電子傳導，影響ATP 的生成[28-29].山蒼子油對離體細胞的毒殺活性與魚藤酮的毒殺效果基本一致，但目前關于山蒼子油及檸檬醛對離體昆蟲細胞毒殺活性的機制尚不明確，有待進一步深入研究.

將諸如山蒼子油等傳統(tǒng)的林產(chǎn)化工產(chǎn)品應用于害蟲防治并開發(fā)高效低毒的綠色新農藥，為林業(yè)資源高效利用和林業(yè)產(chǎn)業(yè)高質量發(fā)展提供了新思路，值得關注并深入研究.