E-cadherin啟動(dòng)子的熒光示蹤體系的建立及驗(yàn)證

譚擁軍，吳東麗，余靂，陳燕

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長沙 410082）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal transition，EMT），是指上皮細(xì)胞程序性、可逆的轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程，根據(jù)EMT 發(fā)生的特定生物學(xué)環(huán)境將其分為1 型、2 型和3 型[1].其中，1 型主要與胚胎發(fā)育和器官形成相關(guān)；2 型主要與組織再生和傷口愈合相關(guān)[2]；3 型主要參與上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[3].三種EMT 類型共同的細(xì)胞學(xué)機(jī)制包括有細(xì)胞形態(tài)改變、極性喪失、粘附性下降、細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的增加[4].細(xì)胞的EMT 進(jìn)程除了可以受到TGF-β、Notch 和Wnt 的信號(hào)通路調(diào)控之外，也可以受到腫瘤微環(huán)境（如缺氧）的影響以及microRNA（miRNA）的差異表達(dá)的影響[5].對于肺癌來說，EMT 是惡性轉(zhuǎn)化的起始，其中有許多標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子的參與，主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物如E-cadherin 的表達(dá)缺失及一些間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、vimentin 的表達(dá)上升[6].

E-cadherin 是鈣離子依賴性的細(xì)胞表面蛋白，屬于跨膜糖蛋白的一種，主要功能是參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密連接，促進(jìn)上皮細(xì)胞之間的粘附[7].研究表明，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)或缺失與EMT 密切相關(guān)，E-cadherin 表達(dá)的缺失被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生的關(guān)鍵步驟，其下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲性增加.因此，E-cadherin 被認(rèn)為是一種重要的EMT 標(biāo)志物[8].此外，E-cadherin 的丟失與各種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)，如肺癌、胃癌、乳腺癌等[9].

啟動(dòng)子是一段能夠決定基因表達(dá)程度和表達(dá)頻率的DNA 序列.將E-cadherin 基因的啟動(dòng)子與熒光蛋白相連，由于基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)或喪失能夠引起熒光信號(hào)的變化，進(jìn)而根據(jù)熒光判斷出EMT 過程中E-cadherin 的表達(dá)情況.利用啟動(dòng)子細(xì)胞熒光示蹤是一種快速、簡捷的方法，可以根據(jù)熒光的變化快速判斷出大分子藥物、小分子多肽等是否影響腫瘤細(xì)胞的EMT 過程，進(jìn)而用來進(jìn)行對化學(xué)分子庫、小分子藥庫進(jìn)行快速篩選.我們通過構(gòu)建E-cadherin 基因啟動(dòng)子攜帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體，通過熒光的變化檢測細(xì)胞的EMT 過程，從而達(dá)到體外示蹤的目的，為進(jìn)一步研究肺癌的EMT 過程提供了材料.

1 材料與方法

1.1 材料

pLvx-EF1A-IRES-EGFP 及包裝質(zhì)粒（pVSVG、Δ8.91）由本實(shí)驗(yàn)室保存；HEK293T 細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞購自ATCC；XbaI、XhoI 限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Scientific 公司；ClonExpress II One Step Clonin購自南京諾維贊公司；EZ-trans 轉(zhuǎn)染試劑購自上海李記生物科技公司；感受態(tài)DH5α 購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；1kb DNA marker 購自廣東東盛科技公司；蛋白核酸分析儀來自Eppendorf 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；胎牛血清（FBS）為Hyclone 公司產(chǎn)品；PBS 購自北京鼎國公司；polybrene 助染試劑購自Merck-Millipore 公司；β-actin抗體購自abcam 公司；GFP 抗體購自上生工生物工程公司；Rabbit 二抗購自碧云天生物技術(shù)公司；Ecadherin 抗體購自cell signal-ling technology（CST）公司.

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增E-cadherin 基因啟動(dòng)子

利用NCBI 查找出E-cadherin 的啟動(dòng)子（-2 500～100 bp）序列，利用primer5.0 設(shè)計(jì)引物，上游引物為5'-GCAGAAATCCACTTTGGCTCGAGGATGAG CCAAGAACTCTGCT-3'，下游引物為5'-GAGGGAGAGGGGCGCGCCTCTAGAAGCGGGCTGGAGTCTGAAC-3'，上下游引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成.

按照基因組提取試劑盒提取HEK293T 細(xì)胞基因組，并以該基因組為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：45 ul mix 酶，1 ul 模板，上下游引物各2 ul.反應(yīng)條件為：98 ℃2 min，98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃30 s，72 ℃5 min.反應(yīng)完成后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳25 min，將得到的符合長度的片段用DNA 凝膠試劑盒進(jìn)行回收，用NanoDrop 檢測回收的DNA 濃度.

1.2.2 構(gòu)建重組的慢病毒表達(dá)載體

將pLvx-EF1A-IRES-EGFP 慢病毒載體用XhoI、XbaI 兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳20 min 后，進(jìn)行膠回收.取回收后的載體2 μl，DNA 片段5 μl，酶2 μl buffer 5 μl，ddH2O 6 μl，37 ℃孵育30 min 后，冰上放置5 min.將5 μl 的連接產(chǎn)物加入到50 μl 的大腸桿菌感受態(tài)DH5α 中，冰上30 min，42 ℃熱激90 s，加入200 μl LB 液體培養(yǎng)基于37 ℃搖床振蕩1 h，取適量的菌液均勻涂布于氨芐的培養(yǎng)皿上，過夜培養(yǎng)12～16 h.第二天，挑取單菌落于100 ul 的LB 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)2 h，取1 μl 為模板，進(jìn)行菌落PCR，挑取有條帶的樣品測序.

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T 細(xì)胞和A549 細(xì)胞均用含10%的FBS和1%雙抗（100 mg/L 青霉素和鏈霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置在37 ℃、5%濃度CO2、90%相對濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)HEK293T 細(xì)胞密度達(dá)到80%可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染.

1.2.4 慢病毒的包裝和感染

當(dāng)HEK293T 的細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，加樣體系如下：pLvx-pE-cadherin-EGFP 質(zhì)粒12 μg、pVSVG 質(zhì)粒6 μg、Δ8.91 質(zhì)粒9 μg，采用Ez-trans 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，8 h 后進(jìn)行細(xì)胞換液.轉(zhuǎn)染48 h 和72 h 后分別收取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基至15 ml 離心管，4 ℃、1 000 r/min 條件下離心5 min，0.45 μm 濾器過濾去除細(xì)胞碎片，存儲(chǔ)于-80℃低溫冰箱.選取生長狀態(tài)良好的A549 細(xì)胞，將2 mL 的pLvx-pE-cadherin-EGFP 慢病毒上清加入其中進(jìn)行感染，按1 ∶1 000 加入助染試劑polybrene 培養(yǎng)48 h 后換取新鮮培養(yǎng)基，觀察感染效果，反復(fù)三次加入慢病毒上清進(jìn)行感染，直到看到明顯的綠色熒光，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞綠色熒光比例

在熒光顯微鏡下觀察感染成功的A549 細(xì)胞，進(jìn)行拍照.并以綠色熒光為標(biāo)志物，以未感染的A549細(xì)胞作為陰性對照，取104個(gè)感染成功的A549 細(xì)胞用PBS 懸浮，于488 nm 的激發(fā)光條件下檢測發(fā)綠色熒光的細(xì)胞所占的細(xì)胞比例.

1.2.6 mRNA 表達(dá)水平鑒定

將帶有綠色熒光的A549 細(xì)胞一組加入10 ng/mL TGF-β，培養(yǎng)48 h 后，于顯微鏡下觀察熒光的變化并記錄；1%的胰酶消化、富集熒光較亮的細(xì)胞，采用RNA 提取試劑盒，提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR 檢測E-cadherin 和GFP 的基因表達(dá)情況.RT-PCR 引物如下：

hE-cadherin-S：CGGGAATGCAGTTGAGGATC

hE-cadherin-AS：AGGATGGTGTAAGCGATGC

hGFP-S：GACAACCACTACCTGAGCAC

hGFP-AS：CAGGACCATGTGATCGCG

1.2.7 蛋白表達(dá)水平鑒定

收取A549 細(xì)胞，1×PBS 洗兩遍，刮取細(xì)胞進(jìn)入2 ml EP 管中，4 ℃離心1 000 r/min，5 min，加入合適體積的RIPA 裂解液，按1 ∶100 的比例加入蛋白酶抑制劑，冰上放置1 h 后，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，上清即為所需的蛋白溶液，用蛋白核酸分析儀測量蛋白濃度.經(jīng)SDS-PAGE 分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h.加入GFP抗體（1 ∶2 500），E-cadherin 抗體（1 ∶2 000 稀釋），及β-actin 抗體（1 ∶5 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1 ∶2 000），室溫孵育2 h；TBST 洗3 次，ECL 發(fā)光顯色.

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)

首先在NCBI 網(wǎng)站及UCSC 網(wǎng)站比對確認(rèn)Ecadherin 的啟動(dòng)子區(qū)域.運(yùn)用EPD The Eukaryotic Promoter Database（https：//epd.epfl.ch//cgi-bin/）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約3 000 bp 區(qū)域，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域具有很強(qiáng)的活性.將-2 746 bp～+74 bp 區(qū)域作為啟動(dòng)子的候選區(qū)域，根據(jù)此區(qū)域的DNA 序列設(shè)計(jì)引物.

2.2 E-cadherin 基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增及鑒定

以HEK293T 基因組為模板進(jìn)行pcr，條帶預(yù)計(jì)長度為2 800 bp 左右，圖1 中可看出有條帶位置正確.將pLvx-EF1A-IRES-EGFP 慢病毒載體進(jìn)行雙酶切線性化之后，與目的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，進(jìn)行菌落PCR 鑒定.

圖1 E-cadherin 基因啟動(dòng)子PCR 產(chǎn)物及菌落PCR 鑒定Fig.1 Identification of PCR product and colony PCR of E-cadherin gene promoter

2.3 慢病毒載體的包裝和感染

培養(yǎng)HEK293T 細(xì)胞，在細(xì)胞長至70%～80%左右，將pLvx-pE-cadherin-EGFP 質(zhì)粒、pVSVG 質(zhì)粒、Δ8.91 質(zhì)粒共同進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后于熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光，說明慢病毒包裝成功，見圖2（a）.分別于48 h 和72 h 收集上清，將上述收集的慢病毒上清離心后并用0.45 μm 的無菌過濾頭進(jìn)行過濾，除去雜質(zhì)，得到的上清用慢病毒滴度快速檢測卡快速檢測，結(jié)果顯示病毒滴度大概為1.25×106TU/ml，見（圖2（b）（c））.當(dāng)A549 細(xì)胞生長密度達(dá)到30%左右時(shí)進(jìn)行感染，反復(fù)感染3 次，于熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光，結(jié)果如圖3（a）.說明慢病毒成功感染A549 細(xì)胞，命名為A549-p-E-cadherin；并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GFP 的陽性細(xì)胞比例達(dá)到4.2%.結(jié)果見圖3（b）；收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot 檢測，確定有GFP 的表達(dá)，結(jié)果見圖3（c）.

圖2 慢病毒的包裝及滴度測定Fig.2 Packaging of lentivirus and determination of lentivirus tit

圖3 慢病毒成功感染A549 細(xì)胞的驗(yàn)證Fig.3 Verification of successful infection of A549 cells with Lentivirus

2.4 EMT 示蹤體系的驗(yàn)證

感染成功的A549 細(xì)胞，理論上來說GFP 的變化和E-cadherin 的變化應(yīng)該保持一致.TGF-β 是一種能夠誘導(dǎo)腫瘤上皮型細(xì)胞向間質(zhì)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子，因此選用TGF-β 來驗(yàn)證該示蹤體系是否有效.當(dāng)用10 ng/ml 的TGF-β 誘導(dǎo)48 h 后，可以看到成功感染慢病毒的A549 細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度相較于未誘導(dǎo)的細(xì)胞有明顯的減弱，并且觀察到A549 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞形態(tài)由紡錘形變?yōu)榧?xì)長型，結(jié)果見圖4（a）和4（b）.收集未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR 和Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin 和GFP 的mRNA 水平和蛋白水平均降低，并且二者的變化趨勢一致，結(jié)果見圖4（c）和4（d）.因此可以用細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的變化來代表E-cadherin 的變化，說明該示蹤系統(tǒng)是有效的.

圖4 A549 細(xì)胞EMT 示蹤體系的驗(yàn)證Fig.4 Verification of A549 cell EMT tracer system

3 討論

已有臨床組織學(xué)表明，有近一半的非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin 基因的RNA 水平比正常組織中明顯下降，主要與其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平有關(guān)[10].而E-cadherin 由于其在細(xì)胞粘附中的重要作用，被認(rèn)為是肺腺中的抑制基因，研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式與肺癌的分期進(jìn)展直接相關(guān)[11].在肺癌中，E-cadherin 可以受其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如snail、slug 可以結(jié)合E-cadherin 啟動(dòng)子上的E-box 原件抑制E-cadherin 的表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT 進(jìn)程[12].而GFP 是一種小分子的綠色熒光蛋白，已經(jīng)廣泛用于多種細(xì)胞的示蹤[13].本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了帶有E-cadherin 啟動(dòng)子的慢病毒載體，進(jìn)而感染E-cadherin 高表達(dá)的上皮型的A549 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光，在經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)EMT 之后，綠色熒光減少，并且E-cadherin的表達(dá)也隨之下降.根據(jù)綠色熒光的變化實(shí)現(xiàn)對肺癌細(xì)胞EMT 過程的示蹤，簡單方便，有利于對腫瘤細(xì)胞EMT 早期進(jìn)行監(jiān)控，并且適合對EMT 治療藥物的篩選，是一個(gè)快速、方便的篩選平臺(tái).

TGF-β 與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT 過程中，有多條信號(hào)通路如TGF-β-Smad 信號(hào)、Wnt/β-catenin、Notch 信號(hào)等參與[14].其中，TGF-β 信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT 的經(jīng)典途徑，其信號(hào)調(diào)控通過Smad 和非Smad 兩種途徑誘導(dǎo)和維持細(xì)胞的EMT[15].此外，研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β 誘導(dǎo)EMT的過程中，可以通過SMAD3 和ERK-MAPK 途徑誘導(dǎo)Notch 通路中配體Jagged1 的合成，從而激活Notch 信號(hào)通路，而激活的Notch 通路則可以促進(jìn)TGF-β 信號(hào)誘導(dǎo)EMT 的過程[16].此外，TGF-β 與Wnt 信號(hào)通路之間也存在相互聯(lián)系，如Wnt 信號(hào)通路的下游分子Axin 通過與Smad 蛋白相互作用促進(jìn)其與Ⅰ型TGF-β 受體結(jié)合，進(jìn)而激活TGF-β信號(hào)通路[17].因此，TGF-β 被認(rèn)為是經(jīng)典的誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子.

慢病毒是一種基因工程中普遍使用的逆轉(zhuǎn)錄載體，相較于其他的逆轉(zhuǎn)錄載體，慢病毒載體不僅具有容納外源片段大、無毒性且不易誘發(fā)免疫反應(yīng)安全性好等特點(diǎn)，而且還有感染譜廣、效率高等優(yōu)勢[18].基于其以上優(yōu)點(diǎn)，慢病毒載體被廣泛應(yīng)用于基因改造的臨床治療中，如目前的CAR-T 療法，就是通過向患者的T 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR 序列以達(dá)到對患者的T細(xì)胞進(jìn)行改造的目的[19].我們通過對慢病毒的載體進(jìn)行改造，切去其原有的啟動(dòng)子，換上E-cadherin 基因的啟動(dòng)子，進(jìn)而感染肺癌A549 細(xì)胞，使綠色熒光蛋白能夠穩(wěn)定長期表達(dá)，并根據(jù)綠色熒光的變化判斷出E-cadherin 的變化過程，進(jìn)而完成對肺上皮細(xì)胞EMT 示蹤.

綜上所述，我們選擇以帶有綠色熒光的慢病毒為載體，將其原有啟動(dòng)子替換為E-cadherin 基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建E-cadherin 基因啟動(dòng)子的慢病毒質(zhì)粒.在HEK293T 細(xì)胞中包裝成慢病毒顆粒，并成功感染肺腺上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞，經(jīng)TGF-β 誘導(dǎo)后驗(yàn)證該細(xì)胞能有效示蹤EMT 過程，為肺癌的EMT 的研究提供了材料.