華東覆盆子果、莖與葉的酚類成分及抗氧化活性分析

陳青青，李 柯，唐曉清,*，耿 麗，王 磊，彭雅萍

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.句容市茅山仙草中藥材專業(yè)合作社，江蘇 句容 212404）

華東覆盆子（Rubus chingii Hu）為薔薇科懸鉤子屬多年生灌木，主要分布于華東地區(qū)，其果實(shí)藥食兩用，具有補(bǔ)腎固精、養(yǎng)肝明目的功效[1]。目前果實(shí)藥用價(jià)值深入研究不足，保健與食用方面的研究開發(fā)過(guò)少，成為國(guó)內(nèi)華東覆盆子產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的制約因素[2-3]。華東覆盆子葉具有治療發(fā)燒、糖尿病、月經(jīng)疼痛、腹瀉和絞痛的功效[4]。 在枝葉更替過(guò)程中，需要大量的修剪，合理利用修剪的廢棄枝葉有助于開發(fā)華東覆盆子的莖葉資源。

薔薇科懸鉤子屬的果實(shí)富含酚類化合物且具有抗氧化力，Vanessa等[5]研究發(fā)現(xiàn)巴西樹莓的總酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力顯著高于櫻桃和藍(lán)莓，陸維克等[6]研究發(fā)現(xiàn)10 個(gè)樹莓品種都表現(xiàn)較高的氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），ORAC值范圍為172.71～205.17 μmol/g，具有抗氧化活性。華東覆盆子果實(shí)含鞣花酸、槲皮素及山柰酚-3-O-蕓香糖苷等化學(xué)成分，這些成分被證明具有顯著的清除自由基 能力[7-8]。吳峰華等[9]用不同溶劑提取華東覆盆子其果實(shí)，發(fā)現(xiàn)提取物的羥自由基清除能力（IC50=1.34 mg/mL） 高于2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（2,6-d i-tert-buty l-4-methylphenol，BHT）（IC50=1.45 mg/mL）。研究發(fā)現(xiàn)，漿果類植物的葉片中酚類化合物含量明顯高于果實(shí)，且具有更高的抗氧化活性[10-11]。Zhang Tiantian等[12]研究得出華東覆盆子葉的多糖相對(duì)于果實(shí)有更強(qiáng)的清除自由基能力及更好的抗炎、抗腫瘤效果，顯示華東覆盆子葉具有潛在的利用價(jià)值。目前還鮮見報(bào)道華東覆盆子莖葉酚類成分的分析及抗氧化活性的比較。

因此，本研究測(cè)定華東覆盆子果、莖及葉的醇提物中總黃酮、總多酚和原花青素含量，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)分析果、莖及葉的主要酚類物質(zhì)成分，采用分光光度法測(cè)定各部位的DPPH自由基清除率、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除率及鐵離子總還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）以比較各部位的抗氧化活性，旨在為開發(fā)華東覆盆子不同部位成為抗氧化劑提供理論參考，促進(jìn)其果、莖及葉的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華東覆盆子莖、嫩葉和老葉于2019年5月15日采摘于句容市九板橋和樸園，105 ℃殺青5 min后，60 ℃干燥至恒質(zhì)量；果為由綠變黃時(shí)采摘，置沸水中略燙取出曬干[1]， 經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康才教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的果、莖及葉。

蘆丁、兒茶素、鞣花酸、沒(méi)食子酸、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridy1)-1,3,5-triazine，TPTZ）、ABTS、水溶性VE（Trolox） 上海源葉生物科技有限公司；DPPH 美國(guó)Sigma公司；山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-QU70A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HK01-10BT超聲波清洗機(jī) 上海漢克科學(xué)儀器有限公司；5810R離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；G2-XS超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 華東覆盆子果、莖及葉的活性成分含量測(cè)定

1.3.1.1 樣品處理

樣品干燥后粉碎，過(guò)篩（100 目），取樣品0.5 g，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇，45 ℃、360 W超聲提取30 min，反復(fù)提取2 次，合并濾液后置于4 ℃冰箱保存，此溶液即為提取液。

1.3.1.2 總酚含量測(cè)定

參照Kim等[13]的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為：y=0.005 9x＋0.013（R2=0.996 2），結(jié)果以每克干物質(zhì)中沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

1.3.1.3 總黃酮含量的測(cè)定

參照Siddhuraju等[14]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為：y=0.001 1x＋0.016（R2=0.998 3），結(jié)果以每克干物質(zhì)中蘆丁當(dāng)量表示。

1.3.1.4 總縮合單寧含量的測(cè)定

參照Nakamura等[15]的方法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為：y=2.541 7x＋0.009 5（R2=0.996 7），結(jié)果以每克干物質(zhì)中兒茶素當(dāng)量表示。1.3.2 華東覆盆子果、莖及葉的酚類物質(zhì)的UPLC-MS/MS分析

1.3.2.1 樣品前處理

取1 mL提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取山柰酚-3-O-蕓香糖苷，椴樹苷、蘆丁及鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，制成1 mg/mL 溶液作為混合對(duì)照品溶液，在相同測(cè)定條件下，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為對(duì)照計(jì)算華東覆盆子果、莖及葉的目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.2.3 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），流速0.30 mL/min。流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。采用梯度洗脫：0～0.5 min，100%～95% A，0%～5% B；0.5～11.5 min，95%～5% A，5%～95% B；11.5～13.5 min，5%～95% A，95%～5% B。

1.3.2.4 質(zhì)譜條件

使用電噴霧源在正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)定質(zhì)量范圍m/z50～1 200。重新校準(zhǔn)時(shí)使用亮氨酸-腦啡肽（m/z556.28）鎖定質(zhì)量選項(xiàng)。毛細(xì)管電壓為3.0 kV，樣品錐為40 V，初始溫度為120 ℃，脫溶氣體溫度為400 ℃，數(shù)據(jù)采集和處理采用Massynlyx4.1。

1.3.3 華東覆盆子果、莖及葉的抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Chrysargyris等[16]的方法，對(duì)照品為Trolox，樣品提取液對(duì)DPPH自由基清除能力以清除率達(dá)到50%時(shí)（IC50，μg/mL）所需要的樣品質(zhì)量濃度表示。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算：

式中：A1為1 mL DPPH溶液、1.8 mL 70%甲醇溶液、0.2 mL樣品溶液混合的吸光度；A2為2.8 mL 70%甲醇溶液和0.2 mL樣品溶液混合的吸光度；A0為1 mL DPPH溶液和2 mL 70%甲醇溶液混合的吸光度。

1.3.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參考Zhou Ying等[17]的方法，對(duì)照品為Trolox，樣品提取液對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以IC50表示。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按式（2）計(jì)算：

式中：As為3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL 70%甲醇溶液混合均勻的吸光度；Am為3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL樣品溶液混合的吸光度。

1.3.3.3 FRAP測(cè)定

參照劉瑜新等[18]的方法，對(duì)照品為Trolox，F(xiàn)RAP以吸光度（A593nm）0.3時(shí)樣品質(zhì)量濃度（A0.3，μg/mL）表示，A0.3越小，F(xiàn)RAP越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各處理3 次重復(fù)，結(jié)果以±s表示，用SPSS Statistics 17.0及Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位的總酚、總黃酮和原花青素含量

表1 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的總酚、 總黃酮和原花青素含量（n= 3）Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids and procyanidins in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n = 3)mg/g

由表1可知，華東覆盆子的果、莖、嫩葉和老葉總黃酮、總酚及原花青素含量具有顯著差異（P＜0.05）。嫩葉的總酚含量和總黃酮含量均高于果和莖，分別是果的2.28 倍和1.91 倍，莖的1.71 倍和1.51 倍，差異性顯著。與嫩葉相比，老葉的總酚含量比嫩葉低18.63%，而總黃酮含量最高，顯著高于其他部位；果的總黃酮含量和總酚含量與其他部位相比均最低，僅為莖的74.82%和78.95%，而原花青素顯著高于莖和葉（P＜0.05），分別是莖、嫩葉和老葉的2.61、3.04、4.04 倍；莖和嫩葉的原花青素含量相近，差異性不顯著（P＞0.05），分別是老葉原花青素含量的1.54 倍和1.32 倍?？傮w上，各部位間的總酚含量為嫩葉＞老葉＞莖＞果，總黃酮含量為老葉＞嫩葉＞莖＞果，而原花青素含量為果＞莖＞嫩葉＞老葉。

Veljkovic等[19]對(duì)巴爾干中部地區(qū)的野生樹莓種群研究發(fā)現(xiàn)葉的酚類含量高于果實(shí)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。賈仕杰[20]和寧瑋鈺[21]等研究了6 種東北紅樹莓葉的原花青素發(fā)現(xiàn)，葉中的原花青素含量在1.8～3.06 mg/g之間，低于果實(shí)和果籽中的原花青素的含量，這與本實(shí)驗(yàn)果的原花青素含量高于莖葉的結(jié)果一致。而本實(shí)驗(yàn)中嫩葉及老葉的原花青素含量略高于賈仕杰等[20]所測(cè)的結(jié)果，可能與區(qū)域差異及樣品采摘時(shí)間不同有關(guān)。

2.2 不同部位的酚類化合物分析

為進(jìn)一步明確華東覆盆子各部位的酚類物質(zhì)的具體組成，利用UPLC-MS/MS對(duì)提取液進(jìn)行分析。由圖1可知，果、葉及莖的內(nèi)在組分具有差異，而嫩葉和老葉的內(nèi)在組分相似。如表2所示，UPLC-MS/MS共分析出了18 種黃酮類化合物和3 種酚酸，嫩葉和老葉的酚類化合物組成相似，主要為山柰酚衍生物和槲皮素及其衍生物，果和莖中的黃酮類成分相對(duì)于葉較少，這與曠慧[22]和肖洪明[23]等的研究結(jié)果相似。本研究對(duì)相對(duì)含量較高的化合物進(jìn)一步定性定量分析（圖1～3、表3）。嫩葉中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量最高，分別為莖的4.13 倍與23.25 倍，為果的4.38 倍與2 倍，不同部位間差異顯著。莖中的椴樹苷含量較高，為果的4.21 倍及老葉的6.65 倍，而與嫩葉差異不顯著（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)果中的鞣花酸含量最高，達(dá)到了1 165.69 μg/g，分別為莖的1.57 倍、嫩葉的6.31 倍和老葉的4.82 倍，差異較大。老葉的沒(méi)食子酸含量最高，達(dá)到了24.97 μg/g，與果差異顯著，嫩葉和莖中的含量較少，無(wú)明顯差異。

圖1 樣品的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of polyphenols in different parts of R. chingii Hu

圖3 各標(biāo)品的質(zhì)譜碎片圖Fig. 3 Mass spectrum of each standard

表2 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的酚類化合物鑒定結(jié)果（n= 3）Table 2 Identification of phenolic compounds in fruits, stems, young leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

表3 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的3 種黃酮和 2 種酚酸含量（n= 3）Table 3 Contents of three flavonoids and two phenolic acids in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)μg/g

2.3 抗氧化活性分析

DPPH法、ABTS法及FRAP法是評(píng)價(jià)體外抗氧化活性最可靠的方法之一，主要原理為抗氧化物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力以及對(duì)金屬離子的還原能力，具有成本低廉、應(yīng)用廣泛、操作便利等優(yōu)勢(shì)[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉的70%甲醇提取物均具有抗氧化活性，且嫩葉的DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力、FRAP均大于果、莖及老葉，具有最強(qiáng)的抗氧化活性，這與Veljkovic等[19]研究的結(jié)果一致。Ding[26]用DPPH法研究華東覆盆子果的抗氧化活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)其IC50為17.9 μg/mL，強(qiáng)于抗壞血酸（IC50為23.2 μg/mL）。 吳峰華等[9]研究了華東覆盆子果不同提取部位的DPPH自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)醇提物的IC50為17.7 μg/mL， 略高于BHT（12.5 μg/mL），與表4所示果的IC50（42.41 μg/mL）略有區(qū)別，可能是因?yàn)樗鶞y(cè)樣品的產(chǎn)地來(lái)源及采收時(shí)間不同所致。Wang等[27]研究了黑莓、草莓以及5 種懸鉤子屬植物的嫩葉及老葉酚類含量和抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)葉片的酚類含量和抗氧化活性高于果實(shí)，葉片中嫩葉的酚類含量和抗氧化活性又遠(yuǎn)高于老葉，與本實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果一致。

表4 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物的抗氧化活性比較（n=3）Table 4 Antioxidant activities of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

圖4 4 種樣品提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH-scavenging activities of four sample extracts

如圖4所示，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度逐漸增加時(shí)，4 種樣品提取物的DPPH自由基清除速率呈現(xiàn)快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)清除率低于90%時(shí)，樣品的自由基清除率與質(zhì)量濃度具有明顯的量效關(guān)系。其中，嫩葉的清除能力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了91%，其IC50為16.99 μg/mL，清除能力弱于對(duì)照Trolox （4.84 μg/mL）；其次是老葉提取物（22.61 μg/mL）和莖提取物（29.94 μg/mL），果提取物清除能力較弱，IC50值最高（42.41 μg/mL），是嫩葉提取物的2.49 倍，老葉的1.87 倍及莖的1.40 倍，與其他部位具有明顯差異。

2.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力分析

如圖5 所示，華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力變化趨勢(shì)與DPPH自由基清除能力的變化趨勢(shì)相似，在樣品質(zhì)量濃度為30～1 800 μg/mL時(shí)，隨著樣品的質(zhì)量濃度增加，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率逐漸上升，具有明顯的劑量依賴性。果的IC50在4 種樣品提取液中最高，說(shuō)明果的自由基清除能力最低，嫩葉的自由基清除能力最強(qiáng)，IC50僅為514.00 μg/mL，約為果的1/3，與果、莖及老葉達(dá)到了顯著差異，而老葉的IC50值小于莖，說(shuō)明老葉的清除能力強(qiáng)于莖，總體看來(lái)，ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力大小依次為嫩葉＞老葉＞莖＞果。

圖5 4 種樣品提取物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging activities of four extracts

2.3.3 FRAP分析

圖6 4 種樣品提取物的FRAP Fig. 6 Ferric ion reducing power of four extracts

如圖6可知，提取物的吸光度的變化趨勢(shì)與前面2 種抗氧化評(píng)估方法變化趨勢(shì)相同。4 種提取物A0.3依次為果＞莖＞老葉＞嫩葉，其中嫩葉的還原能力最強(qiáng)，A0.3值最小，僅為39.06 μg/mL，其次是老葉和莖，A0.3值為46.51 μg/mL和58.80 μg/mL，果的總還原能力較差，具有最高的A0.3值?？傮w看來(lái)，F(xiàn)RAP大小依次為嫩葉＞ 老葉＞莖＞果。

2.4 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物的化學(xué)成分成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

表5 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物活性成分與其 抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between bioactive components and antioxidant capacity of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu

以樣品質(zhì)量濃度40 μg/mL測(cè)定DPPH自由基清除率；以樣品質(zhì)量濃度測(cè)1 500 μg/mL定ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。如表5所示，總酚含量與DPPH自由基清除能力有極顯著相關(guān)性，與ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及FRAP顯著相關(guān)，說(shuō)明各部位的抗氧化活性與總酚含量顯著相關(guān)，即總酚對(duì)各部位的抗氧化活性的貢獻(xiàn)最大，鞣花酸是漿果類的主要酚酸，研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸和沒(méi)食子酸是華東覆盆子的主要酚酸[28]。鞣花酸含量、沒(méi)食子酸含量及原花青素含量與DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及FRAP都呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明鞣花酸、沒(méi)食子酸及原花青素對(duì)總酚的抗氧化活性無(wú)顯著貢獻(xiàn)。原因一可能是果實(shí)與莖葉的成分種類和含量的差異較大[28-29]，果實(shí)中的鞣花酸和原花青素含量雖然高于嫩葉和老葉，但是總黃酮含量和種類遠(yuǎn)低于嫩葉和老葉，由此導(dǎo)致果和莖的抗氧化能力小于嫩葉和老葉，使相關(guān)性分析出現(xiàn)了負(fù)值。原因二可能是原花青素自身發(fā)生了氧化聚合，從而減弱了自身的抗氧化活性，這與代沙[30]研究發(fā)現(xiàn)紫蘇的原花青素含量和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果一致。酚類化合物除了酚酸和原花青素，還包括黃酮化合物[31]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及FRAP相關(guān)性達(dá)到了0.900、0.863及0.835；山柰酚-3-O-蕓香糖苷與DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及FRAP相關(guān)性也達(dá)到了0.9以上，且總黃酮含量與總酚含量相關(guān)性達(dá)到了0.914，山柰酚-3-O-蕓香糖苷與總酚含量顯著相關(guān)。說(shuō)明總酚的抗氧化活性極可能是由總黃酮所貢獻(xiàn)，這與賈仕杰等[20]得出東北樹莓總酚的抗氧化活性是由總黃酮呈了較高貢獻(xiàn)作用的結(jié)論一致。由于實(shí)驗(yàn)中存在未知酚類物質(zhì)的影響，無(wú)法斷定鞣花酸和總原花青素對(duì)總酚的抗氧化活性影響是否起到了相反的作用，因此仍需深入研究。

3 結(jié) 論

華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉含有豐富的酚類化合物，相對(duì)于果和莖，葉具有更高含量的總酚和總黃酮，其中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷及蘆丁等黃酮類成分含量也最高。而莖中具有較高含量的椴樹苷，果中的鞣花酸含量最高，果、莖及葉可作為這些化合物的提取潛在來(lái)源。體外抗氧化結(jié)果表明華東覆盆子嫩葉及老葉的抗氧化活性大于莖和果，嫩葉的抗氧化能力強(qiáng)于老葉。相關(guān)性顯示，總酚對(duì)抗氧化活性貢獻(xiàn)最高，因此，嫩葉的酚類化合物可作為潛在的天然抗氧化劑，具有一定的保健品開發(fā)潛力。