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    基于核酸適配體的AccuBlue熒光法檢測動物食品中的恩諾沙星

    2020-12-29 03:03:44劉若冰郝怡環(huán)焦文雅王向紅
    食品科學 2020年24期
    關鍵詞:熒光法雙鏈染料

    劉若冰,郝怡環(huán),楊 茜,焦文雅,王向紅

    (河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北 保定 071000)

    恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)又名乙基環(huán)丙沙星,是目前使用較為廣泛的一種氟喹諾酮類抗生素藥物。多用于治療動物感染性疾病,不管是對革蘭氏陰性菌,還是革蘭氏陽性菌都有較好的殺滅作用[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧領域也有較為廣泛的應用,常用于治療小豬仔白、黃痢和魚類弧菌癥等疾病[2]。同樣能夠抑制如梭狀桿菌、短小芽孢桿菌、消化鏈球菌等致病菌的繁殖[3-4]。但隨著這種藥物的過量使用,動物源性食品中ENR殘留問題常有發(fā)生[5],當在人體內(nèi)蓄積到一定濃度時就會產(chǎn)生毒性作用[6],可能還會導致人體過敏反應或產(chǎn)生其他比如過敏性哮喘[7]、頭痛[8]、惡心、嘔吐等人體不適的副作用[9]。因此,亟需建立一種快速、靈敏的食品中ENR的檢測方法。

    目前用于檢測ENR的方法主要有高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、免疫分析法[12]、毛細管電泳法[13]以及微生物法[14]等。這些方法雖具有較高的檢測靈敏度,但由于受到樣品前處理過程繁瑣、操作復雜、設備要求高等限制,使其不能廣泛地用于食品的快速檢測。核酸適配體是通過體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術篩選出的能夠與無機或有機分子、蛋白等目標物發(fā)生高親和性和特異性結合的一類單鏈核苷酸(DNA或RNA)[15]。它的獲取不依賴于生物體或細胞[16],是獸藥殘留檢測領域的一個主要研究方向[17-19]。針對ENR的適配體檢測方法目前已有很多,趙秋伶等[20]研制了ENR酶聯(lián)適配體分析檢測試劑盒;趙銀麗等[21]建立了膠體金核酸適配體比色法;Dolati等[22]利用氧化石墨烯通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移機制對附近熒光物質(zhì)的熒光猝滅建立了一種基于核酸適配體的ENR熒光檢測方法。這些方法快速、簡單、靈敏,已經(jīng)被廣泛用于開發(fā)便攜和現(xiàn)場使用的快速檢測。

    AccuBlue是一種極為靈敏的熒光核酸染料[23],常用于雙鏈DNA(dsDNA)的定量檢測。AccuBlue在游離狀態(tài),或與單鏈DNA(ssDNA)共存時只發(fā)出微弱的熒光,與dsDNA共存時會與之發(fā)生結合使得熒光信號顯著增強。Duan Nuo等[24]基于AccuBlue的識別特性進行了副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測,但目前并沒有適用于小分子物質(zhì)檢測的報道。

    本研究基于AccuBlue對痕量dsDNA的超敏感性和ENR核酸適配體建立檢測ENR的非標記型熒光分析方法,并用于實際樣品的測定。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛奶、蝦肉、牛肉 市購;E N R、氧氟沙星(ofloxacin,OFL)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、依諾沙星(enoxacin,ENX) 上海源葉科技有限公司; 牛血清蛋白(bovine serum protein,BSA) 美國Sigma公司;AccuBlue染料 美國Biotium公司;酶標抗原、ENR抗體(0.996 mg/mL)均為實驗室制備。

    參照文獻[25]合成ENR的核酸適配體及其互補鏈Complementary DNA(表1)。

    表1 寡核苷酸名稱與序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

    1.2 儀器與設備

    LUX多功能酶標儀、1500-823多功能酶標儀 美國 Thermo Scientific公司;F-750分光光度計 日本日立公司;1260液相色譜儀 安捷倫科技有限公司; SKP-02.300電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特有限公司;TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 原理

    AccuBlue是一種定量檢測dsDNA的染料,靈敏度較高,當它與dsDNA結合后,熒光強度會在短時間內(nèi)達到峰值,熒光強度會增強1 000 倍以上,并且不與ssDNA結合。向含有核酸適配體的緩沖液體系中加入ENR,核酸適配體就會與之結合,能結合ENR的適配體空間結構就會改變,使之不能再與其互補鏈堿基互補配對。不能與ENR特異性結合的核酸適配體與反應體系中核酸適配體互補鏈雜交生成dsDNA。AccuBlue不結合單鏈核苷酸,僅識別dsDNA的螺旋溝結構,從而釋放熒光信號。結合原理如圖1所示,向相同濃度的核酸適配體體系中添加不同濃度的ENR,反應體系中的熒光強度不同,因此,可以借助熒光信號強度的變化確定樣品中ENR濃度,從而實現(xiàn)快速定量檢測ENR的目的[26]。

    圖1 AccuBlue熒光法反應原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of AccuBlue fluorescence reaction

    1.3.2 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

    分別取10 μL 10 nmol/LENR 核酸適配體與Complementary DNA溶液,95 ℃加熱5 min,冰浴10 min,恢復至室溫。然后加入到96 孔黑色酶標板中混勻,25 ℃反應10 min。再加入200 μL AccuBlue熒光染料避光反應5 min,利用多功能酶標儀的熒光功能檢測熒光強度(參數(shù)設置:激發(fā)波長為468 nm,發(fā)射 波長為507 nm)。

    1.3.3 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別時間的優(yōu)化

    將ENR核酸適配體與Complementary DNA溶液經(jīng)預變性后加入反應體系,在25 ℃培養(yǎng)箱中分別反應5、10、15、20、25、30 min,再分別加入200 μL AccuBlue熒光染料,固定孵育時間后通過多功能酶標儀連續(xù)20 min檢測熒光強度。

    1.3.4 ENR定量檢測

    將0、20、50、100、500、1 000 μg/L和2 000 μg/L系列質(zhì)量濃度的ENR溶液與ENR核酸適配體溶液在孔內(nèi)混勻,25 ℃孵育10 min,再加入Complementary DNA溶液和AccuBlue,重復3 次檢測熒光強度。ENR藥物質(zhì)量濃度為0時體系中熒光強度用F0表示。以ENR藥物質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標,以F/F0為縱坐標,建立標準曲線。

    1.3.5 特異性實驗

    按照1.3.2節(jié)方法分別測定終質(zhì)量濃度為1 000 μg/L ENR、OFL、CIP、ENX溶液體系的熒光強度,重復3 次,結果與空白對比。

    1.3.6 實際樣品的檢測

    稱取5.0 g脫脂奶粉溶于 10 mL的1×PBS,經(jīng)14 000 r/min離心20 min,保留上清液用Tris緩沖液進行10 倍的稀釋。選取蝦肉和牛肉可食用部分剁碎混勻,準確稱取5.0 g肉樣,加入無水硫酸鈉5.0 g研磨均勻后加入提取溶劑(4 mL乙腈、0.04 mL乙酸)于3 000 r/min離心12 min,保留上清液;將殘渣重復上述操作1 次,合并上清液后氮氣吹干,再用Tris緩沖液溶稀釋20 倍[27]。然后向樣品中添加終質(zhì)量濃度為200、500、1 000 μg/L的ENR標準品,經(jīng)優(yōu)化好的方法重復3 次測定熒光強度值,計算添加回收率。

    1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及HPLC驗證

    基于抗體的ELISA方法樣品前處理為將15 g奶粉溶解于15 mL磷酸鹽緩沖溶液(1×PBS),加入5 mL三氯乙酸,5 000 r/min離心15 min,保留上清液,調(diào)節(jié)pH值為中性。準確稱取蝦肉與牛肉均質(zhì)樣本1.0 g,加入5 mL 1%氨水的乙腈溶液及2.5 mL正己烷,超聲提取10 min,4 000 r/min離心5 min,棄去上層有機相,將提取液氮氣吹干,緩沖液復溶。ENR加標量分別設定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平,重復3 次測定樣品中ENR含量,計算回收率。

    HPLC在參考文獻[28-30]中ENR測定方法的基礎上稍作修改,建立了奶粉、蝦肉、牛肉中ENR檢測的HPLC法。樣品處理方法為準確稱取10 g奶粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液,加入35 mL乙腈,超聲提取30 min后加入200 g/L乙酸鋅2.0 mL,乙腈定容至50 mL,10 000 r/min離心5 min,收集上清液經(jīng)0.22 μmol/L有機濾膜過濾;準確稱取蝦肉與牛肉均值樣本2.00 g,分別加入12 g無水硫酸鈉和12 mL酸化乙腈,超聲提取15 min,4 500 r/min離心15 min,收集上清液移至分液漏斗中,加入25 mL正己烷,振蕩5 min。充分靜置后,將下層液體55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1 mL流動相充分溶解殘渣,4 500 r/min離心5 min,保留上層溶液,經(jīng)0.45 μm膜微孔過濾。待測樣品經(jīng)HPLC儀重復3 次進行測定。HPLC分析條件為:Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;流動相:0.05 mol/L的磷酸三乙胺-乙腈(pH 3)(82∶18,V/V);流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長450 nm[31]。ENR的加標量分別設定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平。

    將ELISA方法和HPLC方法測定結果與熒光法檢測結果進行比較,分析相關性。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

    使用Excel 2010及Origin 2017軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表的繪制。

    2 結果與分析

    2.1 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

    建立基于AccuBlue熒光染料和核酸適配體方法檢測ENR的前提是確定AccuBlue與緩沖液、適配體和互補鏈之間形成的雙鏈核苷酸反應后是否釋放熒光,該熒光信號是否可以被儀器識別。AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA檢測結果如圖2所示,緩沖液本身不具有熒光信號且ENR核酸適配體與Complementary DNA的雜交產(chǎn)物dsDNA結合AccuBlue釋放的熒光信號遠大于AccuBlue熒光染料本身,且由此可以證明,利用AccuBlue熒光檢測ENR方法可行。

    圖2 ENR核酸適配體形成的dsDNA與AccuBlue結合后的 熒光檢測(n=3)Fig. 2 Fluorescence intensity of AccuBlue in the presence and absence of ENR aptamer hybridizer (n = 3)

    2.2 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別雙鏈時間的優(yōu)化

    熒光染料AccuBlue通過識別核酸適配體與其互補鏈之間的堿基配對位點,在初始階段隨著反應時間的推移,釋放出的熒光信號不斷增強,直到反應體系中AccuBlue與dsDNA不再結合為止。雙鏈孵育時間優(yōu)化結果如圖3所示,ENR核酸適配體與其互補鏈反應10 min時,體系中相對熒光強度達到最大值,且處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此確定ENR適配體與其互補鏈、ENR藥物的孵育時間為10 min。

    圖3 ENR核酸適配體與其互補鏈孵育時間優(yōu)化(n= 3)Fig. 3 Optimization of incubation time of ENR aptamer and its complementary chain (n = 3)

    當加入體系中的AccuBlue和ENR核酸適配體濃度一定時,需要確定在當前濃度條件下熒光強度達到峰值的時間。熒光染料識別雙鏈的時間優(yōu)化如圖4所示。相對熒光強度在第6分鐘時達到最高點且處于穩(wěn)定狀態(tài)。AccuBlue熒光染料的濃度一定時,相對熒光強度隨dsDNA的增多而增強,達到峰值之后又有輕微的猝滅。因此,選擇6 min作為AccuBlue與樣品的最優(yōu)反應時間。

    圖4 熒光染料識別雙鏈的時間優(yōu)化(n=3)Fig. 4 Optimization of reaction time between AccuBlue and dsDNA (n = 3)

    2.3 ENR定量檢測結果

    根據(jù)上述確定的最佳反應條件,建立AccuBlue熒光法檢測不同質(zhì)量濃度ENR的標準曲線。當ENR核酸適配體的量一定時,ENR質(zhì)量濃度越大,體系中能與互補鏈結合的核酸適配體越少,形成的dsDNA越少,AccuBlue識別dsDNA產(chǎn)生的熒光強度F值越小。溶液中沒有ENR藥物存在時,核酸適配體完全與其對應的互補鏈結合,此時熒光強度F0最大。因此,以F/F0為縱坐標,以ENR質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標建立標準曲線。該方法的標準曲線為Y=-0.186 8x+1.186,R2=0.945 7。ENR在20~1 000 μg/L的質(zhì)量濃度梯度范圍內(nèi)存在良好的線性關系,檢出限為9.96 μg/L,定量限為29.97 μg/kg。此外,由表2可知,該方法的平均板內(nèi)變異系數(shù)為6.63%,平均板間變異系數(shù)為8.05%。目前應用于ENR的熒光檢測方法還有很多。對比文獻報道的其他熒光分析方法 (表3)可以看出,本實驗建立的AccuBlue熒光法線性范圍較寬、檢測限低,且AccuBlue免標記,操作簡便,整個實驗過程不超過1.5 h。

    表2 板內(nèi)與板間變異實驗(n=6)Table 2 Inter-plate and intra-plate coefficients of variation (n = 6)%

    表3 ENR不同熒光檢測方法結果比較Table 3 Comparison of different fluorescence methods for enrofloxacin detection

    2.4 特異性實驗結果

    圖5 AccuBlue與ENR核酸適配體檢測ENR的特異性分析(n=3)Fig. 5 Specificity evaluation of AccuBlue and ENR aptamer for the detection of ENR (n = 3)

    為了考察ENR的核酸適配體與其他結構類似物是否發(fā)生交叉反應,同時對ENR、CIP、OFL、ENX進行了檢測,結果如圖5所示。當向反應體系中加入相同質(zhì)量濃度(1 000 μg/L)的抗生素藥物時,AccuBlue檢測ENR的反應體系所釋放的熒光強度小于其他3 種。這說明反應體系內(nèi)中有ENR存在時,ENR核酸適配體與ENR發(fā)生了特異性結合,只能激發(fā)產(chǎn)生少量熒光。而其他抗生素反應體系中,ENR核酸適配體幾乎與互補鏈完全結合,與AccuBlue結合激發(fā)產(chǎn)生更多的熒光。由此可知,ENR核酸適配體可特異性識別并結合ENR,與CIP、OFL、ENX基本上不發(fā)生交叉反應。

    2.5 實際樣品的檢測結果

    本實驗選取奶粉、蝦肉和牛肉3 種樣品進行加標回收實驗。按照1.3.6節(jié)的方法處理樣品,每種樣品添加3 個不同水平的ENR標準品,用熒光法進行檢測,根據(jù)標準曲線計算樣品回收率。由表4可知,3 種樣品的加標回收率范圍為76.54%~98.79%。結果表明,該檢測方法準確可靠,可用于實際動物性樣品中ENR含量的快速檢測。

    表4 熒光法測定樣品的加標回收結果(n=3)Table 4 Recoveries of spiked samples by the fulorescence method (n = 3)

    2.6 熒光法與ELISA及HPLC測定結果的相關性分析

    為了進一步驗證AccuBlue熒光法的準確性,使用ELISA和HPLC方法檢測加入ENR標準的相同樣品(奶粉、蝦肉和牛肉)。ENR標準品及3 種動物食品加標樣品的HPLC見圖6。3 種方法的線性回歸分析結果如圖7所示,采用熒光法測定加標樣品回收率與其他兩種方法都呈現(xiàn)良好的線性關系(R2>0.96;R2>0.98),證實了本實驗建立的熒光法檢測ENR殘留方法準確可靠,可應用于實際樣品的快速檢測。

    圖6 ENR標準品(a)及奶粉(b)、蝦肉(c)、牛肉(d) 樣品HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of ENR standard (a), milk powder (b), shrimp (c), and beef (d) samples

    圖7 熒光法和ELISA(a)及HPLC(b)測定結果的線性回歸分析Fig. 7 Linear regression analysis of fluorescence method versus ELISA (a), and fluorescence method versus HPLC (b)

    3 結 論

    利用核酸適配體及AccuBlue熒光染料的特點,建立一種基于核酸適配體快速檢測ENR的方法,并對熒光法反應體系進行優(yōu)化。結果表明,本研究建立的AccuBlue適配體方法在pH 8.5的緩沖溶液中,熒光染料識別雙鏈的時間為6 min,雙鏈孵育時間為10 min的最優(yōu)反應條件下,ENR在20~1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好,檢出限為9.96 μg/L,定量限為29.97 μg/kg。且與OFL、CIP、ENX無交叉反應,板內(nèi)變異系數(shù)范圍為4.97%~9.31%,板間變異系數(shù)范圍為5.83%~10.96%。在3 個不同水平,樣品回收率在76.54%~98.79%之間。通過ELISA方法與HPLC方法進行驗證,R2均大于0.96。由此表明,該檢測特異性、穩(wěn)定性和重復性良好。本研究建立的AccuBlue熒光法所需設備簡單、成本低、效率高,為食品中ENR的快速和高靈敏檢測提供了新的方案。

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