大黃酚對(duì)腦缺血損傷模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子表達(dá)的影響

張亞洲 蔡友德 胡斐然 郭青 李宇鴻 何前松

摘 要 目的：研究大黃酚對(duì)腦缺血損傷模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子表達(dá)的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和大黃酚高、中、低劑量組[7.88、3.94、1.97 mg/（kg·d）]，每組20只（復(fù)制模型過程中如死亡或造模不成功則補(bǔ)足）。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均采用改良線栓法建立中動(dòng)脈閉塞模型。于缺血2 h后，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射生理鹽水1 mL，各給藥組大鼠腹腔注射相應(yīng)藥液1 mL，每日1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后，記錄各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，采用TTC染色法觀察大鼠腦組織梗死情況并計(jì)算腦梗死面積百分比，采用免疫熒光染色法觀察大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，采用Western blotting法檢測(cè)大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死區(qū)域;其腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞較少且呈分枝狀。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域明顯;腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞明顯增多，且呈阿米巴形或圓形;其神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比以及腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，大黃酚各劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域均有不同程度縮小;腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性表達(dá)細(xì)胞有所減少;其神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比以及腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：大黃酚對(duì)腦缺血損傷模型大鼠具有一定的腦保護(hù)作用，可減輕其神經(jīng)損傷;其機(jī)制可能與抑制Notch信號(hào)通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 腦缺血損傷;大黃酚;小膠質(zhì)細(xì)胞;炎癥因子;Notch信號(hào)通路;大鼠

ABSTRACT?OBJECTIVE： To study the effects of chrysophanol on the activation of microglia and the expression of inflammatory factors in cerebral ischemia model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and chrysophanol high， medium， low dose groups [7.88， 3.94， 1.97 mg/（kg·d）]， with 20 rats in each group （the number was complemented in cases of death or unsuccessful modeling during modeling process）. Except for sham operation group， middle cerebral artery occlusion model was established in other groups by improved thread method. After 2 hours of ischemia， sham operation group and model group were intraperitoneally injected with 1 mL normal saline， and each administration group was intraperitoneally injected with 1 mL corresponding drug， once a day， for 7 consecutive days. After last medication， the score of neurological impairment was recorded; cerebral infarction of rats was observed by TTC staining， and the percentage of cerebral infarction area was calculated. The expression of Iba-1 positive cells in ischemic penumbra of rats was observed by immunofluorescence staining. The expression of Notch-1， TNF-α and ICAM-1 in the ischemic penumbra of rats were detected by Western blotting assay. RESULTS： In sham operation group， there was no infarction area in the brain tissue， and the Iba-1 positive cells in the ischemic penumbra were few and branched. Compared with sham operation group， the infarction area of cerebral tissue in rats was obvious in model group; the number of Iba-1 positive cells in ischemic penumbra were increased significantly， and they were in amoeba or round shape; the neurological impairment score， the percentage of cerebral infarction area， relative expression of Notch-1， TNF-α and ICAM-1 protein in ischemic penumbra were increased significantly （P<0.05）. Compared with model rats， the infarction area of cerebral tissue in each dose group of chrysophanol was reduced to different extent; the number of Iba-1 positive cells in ischemic penumbra was decreased; neurological impairment score， the percentage of cerebral infarction area， relative expression of Notch-1， TNF-α and ICAM-1 protein were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Chrysophanol has a certain protective effect on the brain tissue of cerebral ischemia model rats， and can relieve the nerve injury. Its mechanism may be associated with inhibiting the activation of microglia and expression of inflammatory factors mediated by Notch pathway.

KEYWORDS ? Cerebral ischemia; Chrysophanol; Microglia; Inflammation factor; Notch signaling pathway; Rats

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致患者殘疾和死亡的主要原因，其中缺血性卒中約占總卒中病例的60%～80%，具有發(fā)病率高、致殘率高和病死率高等特點(diǎn)，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。卒中后的腦損傷是由一系列復(fù)雜的病理生理事件（如興奮性氨基酸毒性損傷、鈣調(diào)節(jié)障礙、氧化應(yīng)激、炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞凋亡等）所導(dǎo)致的不可逆的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。缺血后炎癥反應(yīng)已被認(rèn)為是缺血性卒中關(guān)鍵的病理生理學(xué)因素，其中小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)器，在缺血性卒中后可通過形態(tài)和表型改變而迅速活化，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞可介導(dǎo)促進(jìn)腦損傷恢復(fù)的有益活動(dòng)，例如吞噬細(xì)胞碎片和分泌抗炎物質(zhì)、神經(jīng)生長因子等[3]。但是在缺血性卒中的急性階段，小膠質(zhì)細(xì)胞活化被認(rèn)為是繼發(fā)性損傷的潛在原因，其可通過釋放炎癥因子[如細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等]而導(dǎo)致腦組織損害[4]。最近的研究表明，Notch信號(hào)在小膠質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可在腦損傷后被激活;同時(shí)，Notch信號(hào)也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞活化后神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放，與腦缺血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[5]。由此可見，抑制腦缺血后Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及活化小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)有望成為防治缺血性卒中的有效策略。

大黃酚（Chrysophanol）是從大黃屬植物中分離出來的重要的游離蒽醌化合物之一，具有抗炎、改善脂質(zhì)代謝、抗抑郁、抗心肌缺血、保護(hù)腦組織等廣泛的藥理活性[6-7]。既往研究表明，大黃酚可拮抗腦缺血/再灌注損傷，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥因子[白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β]釋放而減輕炎癥損傷[8]。但大黃酚抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化是否與Notch信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)，尚未見相關(guān)報(bào)道。基于此，本研究擬使用改良線栓法制作腦缺血損傷大鼠模型，初步探討大黃酚對(duì)模型大鼠腦缺血后Notch信號(hào)通路以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥因子表達(dá)的影響，為中藥及其活性成分治療缺血性卒中篩選新的靶點(diǎn)，并為將大黃酚開發(fā)為神經(jīng)保護(hù)藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DMIL LED型熒光顯微鏡（德國Leica公司）;Mini Protean 3 Cell型電泳儀（美國Bio-Rad公司）;Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）;TB-718D型生物組織包埋機(jī)（泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）;DHG-9023A型恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司）;EOS 1300D/1500D型單反相機(jī)（日本Cannon公司）。

1.2 藥品與試劑

大黃酚原料藥[上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T18S10F97987，純度：≥98%;以N，N-二甲基甲酰胺-聚山梨酯80-生理鹽水（體積比為1 ∶ 1 ∶ 8）混合溶液為溶劑，配制成0.1%、0.01%、0.001%大黃酚藥液，備用];小鼠抗大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體Iba-1多克隆抗體（美國GeneTex公司，批號(hào)：GT10312）;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SA00003-9）;兔抗小鼠ICAM-1、TNF-α、Notch-1多克隆抗體和兔抗小鼠β-actin單克隆抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為PAB31662、PAB37416、PAB44149、WB9111-MAB43672）;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0028-1）;封閉用山羊血清、BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、抗熒光衰減封片劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為SL038、PC0020、P8020、S2110）;PVDF膜（美國Millipore公司，批號(hào)：IPVH00010）;2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京奧博特生物科技有限公司）;氯化鈉注射液（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20033974，規(guī)格：100 mL ∶ 900 mg;作生理鹽水用）;ECL化學(xué)發(fā)光底物（環(huán)亞生物科技有限公司）;4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美國Sigma公司，批號(hào)：24894305）;其余試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20） g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。所有雌雄大鼠均自由攝食飲水，并分籠飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、濕度40%～60%的環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組以及大黃酚高、中、低劑量組[7.88、3.94、1.97 mg/（kg·d），分別根據(jù)人臨床用量的21、14、7倍劑量換算而得，且前期研究證實(shí)高劑量無明顯毒性]，每組20只。參考文獻(xiàn)[9]采用改良線栓法建立腦缺血損傷模型：所有大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）麻醉后，以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，消毒頸部皮膚;于頸正中切開，鈍性分離并暴露頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），用動(dòng)脈夾夾閉CCA和ICA，在CCA上作一楔形切口，由此插入線栓（直徑0.26 mm），松開動(dòng)脈夾，將線栓緩慢向ICA入顱方向推進(jìn)，輕推至大腦中動(dòng)脈起點(diǎn)，遇阻力停止（進(jìn)線約18～20 mm），即實(shí)現(xiàn)了大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）;隨后結(jié)扎CCA并逐層縫合頸部切口、消毒。假手術(shù)組大鼠同法分離CCA、ECA、ICA，除不插入線栓外，其余操作同上。在手術(shù)過程中和術(shù)后，所有大鼠均被置于恒溫[（37.0±0.5） ℃]電熱板上保溫，待其麻醉清醒后放入飼養(yǎng)籠中，自由攝食飲水。密切觀察大鼠生命體征，并根據(jù)Longa 5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[4]評(píng)價(jià)其神經(jīng)行為表現(xiàn)，并將評(píng)分為1～3分者（假手術(shù)組除外）納入實(shí)驗(yàn)（復(fù)制模型過程中如死亡或造模不成功則補(bǔ)足，保證每組20只）。于腦缺血2 h后，假手術(shù)組和模型組大鼠分別腹腔注射生理鹽水1 mL，各給藥組大鼠腹腔注射相應(yīng)藥物1 mL，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

于末次給藥后，采用Longa 5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法對(duì)全部大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]——0分：無任何神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，即正常;1分：垂直提起大鼠時(shí)，其未能充分伸展前肢;2分：大鼠行走時(shí)身體向一側(cè)傾斜，轉(zhuǎn)大圈;3分：大鼠行走時(shí)身體向一側(cè)跌倒，轉(zhuǎn)小圈;4分：大鼠沒有運(yùn)動(dòng)或自發(fā)行走，意識(shí)水平低落。

2.3 大鼠腦組織梗死情況

采用TTC染色法檢測(cè)。末次給藥及神經(jīng)功能評(píng)分后，各組隨機(jī)選取6只大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，用生理鹽水進(jìn)行心內(nèi)灌注并斷頭取腦。于離額極2 mm處向后連續(xù)等距切取5個(gè)冠狀切片（厚度約為20 μm），在37 ℃條件下置于2%TTC染色液中避光染色30 min，再在4 ℃條件下置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h后，使用相機(jī)拍攝（正常腦組織顯示為紅色，而腦梗死灶顯示為白色）。由Image Pro plus 6.0圖像處理軟件分析圖像并計(jì)算腦梗死面積百分比：腦梗死面積百分比=（對(duì)側(cè)半球面積-同側(cè)半球非梗死面積）/對(duì)側(cè)半球面積×100%。

2.4 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞的表達(dá)情況

采用免疫熒光染色法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下各組大鼠的腦組織切片，置于65 ℃恒溫烘箱中烤片1 h，經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化后，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，再用3%H2O2溶液在室溫下孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。將切片置于10%山羊血清中封閉30 min后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗，滴加Iba-1抗體（稀釋度為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;用PBS清洗5 min×3次，滴加FITC標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 100），避光室溫孵育1 h;用PBS清洗5 min×3次，用DAPI染料復(fù)染細(xì)胞核，以抗熒光衰減封片劑避光封片。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，模型組和各藥物組隨機(jī)選取缺血半暗帶區(qū)5個(gè)視野，假手術(shù)組選取與上述區(qū)域?qū)?yīng)的5個(gè)視野，觀察Iba-1陽性細(xì)胞（鏡下呈綠色熒光）的表達(dá)情況。

2.5 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的表達(dá)情況

采用Western blotting法檢測(cè)。末次給藥及神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，各組另隨機(jī)選取8只大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，模型組和各藥物組選取缺血半暗帶區(qū)腦組織適量，假手術(shù)組大鼠選擇與上述區(qū)域?qū)?yīng)的腦組織適量，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書方法提取總蛋白，上述蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后，于100 ℃下變性10 min。取變性后的蛋白樣品20 ? μg，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠：120 V，50 min;5%濃縮膠：80 V，40 min），并于電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4 ℃下用5%脫脂奶粉封閉過夜;加入Notch-1、TNF-α、ICAM-1抗體和內(nèi)參β-actin抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;用PBST溶液洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫下孵育1 h;用PBST溶液洗滌3次后，以ECL法顯色，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀成像。使用Image J V1.8.0.112軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比表示Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃酚對(duì)腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死面積百分比的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死區(qū)域;模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域明顯，其神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死面積百分比均較假手術(shù)組顯著升高（P<0.05）;大黃酚各劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域均有所縮小，其神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死面積百分比均較模型組顯著降低（P<0.01），詳見表1、圖1（每組隨機(jī)展示了3只大鼠的TTC染色觀察結(jié)果）。

3.2 大黃酚對(duì)腦缺血模型大鼠半暗帶區(qū)Iba-1表達(dá)的影響

假手術(shù)組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞較少，且呈分枝狀;模型組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增多，且呈阿米巴形或圓形;大黃酚各劑量組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞均較模型組有所減少，詳見圖2。

3.3 大黃酚對(duì)腦缺血模型大鼠缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，大黃酚各劑量組大鼠上述蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表2。

4 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是CNS內(nèi)的常駐免疫細(xì)胞，也是第一個(gè)對(duì)缺血性卒中致病理生理改變作出反應(yīng)的細(xì)胞，參與了缺血時(shí)半暗帶區(qū)內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[10]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈高度分枝狀，具有三級(jí)和四級(jí)分枝結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞間的分枝很少發(fā)生重疊。當(dāng)腦內(nèi)發(fā)生炎癥、創(chuàng)傷或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大、突起變短、細(xì)胞形態(tài)呈圓形或桿狀;同時(shí)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步被激活和調(diào)整，細(xì)胞突起消失，細(xì)胞形態(tài)呈阿米巴狀，并具有吞噬功能。小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變反映了其活化狀態(tài)，而該細(xì)胞的活化狀態(tài)與腦內(nèi)受損部位的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血半暗帶中的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，其胞體增生肥大，形態(tài)由分枝狀向阿米巴形或圓形轉(zhuǎn)變，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子，并分泌神經(jīng)遞質(zhì)至細(xì)胞外環(huán)境中，進(jìn)一步加重腦組織損害[12]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀且處于靜息狀態(tài);而當(dāng)腦缺血損傷發(fā)生后，模型組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)中的小膠質(zhì)細(xì)胞呈阿米巴形或圓形，提示腦缺血損傷激活了小膠質(zhì)細(xì)胞。

免疫反應(yīng)是參與急性腦缺血病理生理學(xué)過程并影響卒中患者預(yù)后的主要因素[13]。雖然免疫反應(yīng)僅在灌注不足的血管以及局部缺血性腦實(shí)質(zhì)中發(fā)生，但其引發(fā)的炎癥反應(yīng)可在整個(gè)生物體內(nèi)傳播;同時(shí)，上述炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷，對(duì)急性缺血性損傷和腦功能恢復(fù)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的常駐免疫細(xì)胞，在正常情況下會(huì)不斷監(jiān)測(cè)大腦的微環(huán)境;一旦發(fā)生缺血，小膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)被激活，從而產(chǎn)生有害的和神經(jīng)保護(hù)的炎癥因子，而這兩種因子的平衡決定了受損神經(jīng)元的功能狀態(tài)[3]。在腦缺血早期，小膠質(zhì)細(xì)胞激活可促進(jìn)IL-2、TNF-α、ICAM-1等炎癥因子的表達(dá)，后者可誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致腦組織損傷[15]。Notch信號(hào)通路是一種膜受體信號(hào)通路，是神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及CNS正常發(fā)育的主要參與者，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的活化中具有重要作用[16]。在CNS中，Notch信號(hào)被認(rèn)為是細(xì)胞“命運(yùn)”信號(hào)，Notch受體與其配體結(jié)合可激活Notch靶向基因的轉(zhuǎn)錄[17]。有證據(jù)表明，Notch信號(hào)在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和活化具有促進(jìn)作用，并可促進(jìn)卒中后炎癥反應(yīng)的發(fā)生[18]。最近研究報(bào)道指出，在腦缺血損傷的病理生理過程中，Notch信號(hào)通路被誘導(dǎo)激活，活化的Notch信號(hào)通路參與了小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放，從而加重腦組織損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損轉(zhuǎn)歸不良[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血7 d后，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域明顯，其神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積百分比以及腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均較假手術(shù)組顯著升高，表明腦缺血后大鼠腦組織受到損傷，Notch信號(hào)被激活，TNF-α、ICAM-1等神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放明顯增加，提示小膠質(zhì)細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路參與了腦缺血炎性損傷過程。經(jīng)大黃酚干預(yù)后，各藥物組大鼠腦梗死區(qū)域有所縮小，其Iba陽性細(xì)胞明顯減少，其神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積百分比以及腦缺血半暗帶區(qū)Notch-1、TNF-α、ICAM-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，表明該藥物可改善大鼠神經(jīng)功能損傷、縮小腦梗死區(qū)域面積，并明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，同時(shí)可下調(diào)Notch信號(hào)通路，減少ICAM-1、TNF-a等神經(jīng)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，提示Notch信號(hào)通路可能是大黃酚抗腦缺血損傷的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，大黃酚對(duì)腦缺血損傷模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，可改善其神經(jīng)功能缺失、縮小腦梗死區(qū)域面積;這種作用可能與抑制Notch信號(hào)通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。本研究初步確定了大黃酚預(yù)防腦缺血炎性損傷的可能機(jī)制，可為該藥物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-06-10 修回日期：2020-10-22）

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