MB和CMC液體培養(yǎng)基對禾谷鐮孢產(chǎn)孢水平的影響

畢亞琪 王禹賀 羅泗川

摘要 禾谷鐮孢分生孢子定量接種是研究作物抗禾谷鐮孢的必要手段。本試驗(yàn)利用綠豆（mung bean， MB）與羧甲基纖維素（carboxylmethyl cellulose， CMC）液體培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)禾谷鐮孢，比較兩種培養(yǎng)基對禾谷鐮孢產(chǎn)孢效率的影響;并用兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)分生孢子制成相同濃度孢子懸浮液，對75個玉米家系進(jìn)行人工接種鑒定，檢測不同培養(yǎng)基所產(chǎn)分生孢子致病性差異。結(jié)果表明，CMC培養(yǎng)基誘導(dǎo)分生孢子增長率（k2=1.125）大于MB培養(yǎng)基誘導(dǎo)增長率（k1=0.844）。在培養(yǎng)第14天，MB培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得的分生孢子平均濃度為2.51×105個/mL，CMC培養(yǎng)基誘導(dǎo)的為3.62×105個/mL，比MB培養(yǎng)基誘導(dǎo)多44.22%。用兩種培養(yǎng)基誘生的孢子進(jìn)行田間接種，玉米穗腐病發(fā)病程度無明顯差異。CMC培養(yǎng)基具有產(chǎn)孢快、孢子濃度高的優(yōu)點(diǎn)，是一種適宜禾谷鐮孢分生孢子誘生的高效液體培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞 禾谷鐮孢; 玉米穗腐病; 分生孢子; 培養(yǎng)基

中圖分類號： S 435.121

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019393

Abstract Artificial inoculation with the conidial suspension of Fusarium graminearum is an important technique for studying the diseases of maize ear and wheat related to F.graminearum. In this study， we used mung bean （MB） medium and carboxylmethyl cellulose （CMC） medium to cultivate the conidia of F.graminearum to compare their cultivating efficiencies. The two kinds of media were used to prepare conidial suspensions for artificial inoculation. The suspensions of F.graminearum from MB and CMC media were separately used to inoculate 75 families of maize recombinant inbred lines （RIL）， in order to observe the differences in the infectious potential of the two suspensions. The results showed that， under the same conditions， the growth rates of F.graminearum spores in CMC medium （k2） and MB medium （k1） were 1.125 and 0.844， respectively. Higher growth rate led to higher spore concentration. After 14 days of incubation， the concentrations of F.graminearum conidia in MB medium and CMC medium were 2.51×105 spores/mL and 3.62×105 spores/mL， respectively， and the first was 44.22% higher than the latter. The ear rot identification after artificial inoculation indicated that there was no significant difference in maize ear rot infection between MB and CMC spore suspensions for the same concentration. Therefore， CMC medium was a more effective culture for producing F.graminearum conidia， because more spores could be harvested from CMC medium in a shorter time than from MB medium.

Key words Fusarium graminearum; maize ear rot; conidium; culture medium

禾谷鐮孢Fusarium graminearum是玉米穗腐病的主要致病菌[1]，也是小麥赤霉病和莖基腐病的重要病原菌[2-6]。禾谷鐮孢主要侵染小麥、大麥、玉米和其他禾本科作物，在世界范圍內(nèi)均可造成病害發(fā)生，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。在我國，禾谷鐮孢可造成玉米10%～20%的田間損失率，高感品種損失率甚至高達(dá)65%[5];我國北方冬小麥夏玉米一年兩作輪作區(qū)或兩年三作區(qū)內(nèi)，小麥赤霉病和玉米莖基腐病均有發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失巨大[6]。利用禾谷鐮孢分生孢子進(jìn)行定量接種是研究玉米穗腐病和小麥赤霉病等以禾谷鐮孢為致病菌的病害發(fā)生規(guī)律、品種抗性鑒定和防治技術(shù)的必不可少的手段。禾谷鐮孢一般通過分生孢子侵染宿主，因此獲得適宜的禾谷鐮孢分生孢子懸浮液是進(jìn)行禾谷鐮孢相關(guān)病害定量接種和抗性鑒定的基礎(chǔ)。禾谷鐮孢在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）上只能進(jìn)行營養(yǎng)生長而幾乎不產(chǎn)生分生孢子[7]，其大型分生孢子的誘生需采用其他培養(yǎng)基。目前常見的禾谷鐮孢分生孢子誘生培養(yǎng)基主要有康乃馨葉瓊脂（carnation leaf agar，CLA）培養(yǎng)基[8]、綠豆（mung bean，MB）液體培養(yǎng)基[9-11]和羧甲基纖維素（carboxylmethyl cellulose， CMC）培養(yǎng)基。生產(chǎn)上利用CLA培養(yǎng)基產(chǎn)孢需要近紫外光的誘導(dǎo)，且產(chǎn)生的大型分生孢子數(shù)量少，難以達(dá)到田間接種時的菌液濃度要求，故實(shí)際應(yīng)用不多。本文將利用MB培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基對禾谷鐮孢進(jìn)行分生孢子產(chǎn)孢培養(yǎng)，比較兩種培養(yǎng)基的禾谷鐮孢產(chǎn)孢效率，并用兩種培養(yǎng)基獲得的禾谷鐮孢分生孢子配制相同濃度孢子懸浮液進(jìn)行田間接種，研究兩種培養(yǎng)基所誘生的禾谷鐮孢分生孢子對玉米的致病性差異。

由兩個函數(shù)可見，MB培養(yǎng)基增長曲線中增長率k1=0.844，而CMC培養(yǎng)基增長曲線中增長率k2=1.125， k2>k1，即CMC培養(yǎng)基中禾谷鐮孢分生孢子增長速度大于MB培養(yǎng)基。至14 d觀察期結(jié)束時，CMC培養(yǎng)基內(nèi)分生孢子平均濃度為3.62×105個/mL，比MB培養(yǎng)基（2.51×105個/mL）產(chǎn)孢多44.22%。

方差分析結(jié)果顯示，禾谷鐮孢分生孢子濃度在兩種培養(yǎng)基中差異顯著（P<0.05），相同處理下重復(fù)間差異不顯著（表1）。結(jié)果表明，用CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮孢分生孢子比用MB培養(yǎng)基更高效，同等環(huán)境條件下可在更短時間內(nèi)培養(yǎng)出更高濃度的禾谷鐮孢分生孢子。

2.2 兩種孢子懸浮液對玉米致病力比較

由表2可見，75個家系經(jīng)兩種相同濃度的孢子懸浮液接種后，各有平均7.5個家系因未出苗、未出穗和錯過接種時期造成數(shù)據(jù)缺失，其余的平均67.5個家系，經(jīng)CMC培養(yǎng)的孢子懸浮液接種后，抗性對應(yīng)1、3、5、7級和9級的家系在兩個重復(fù)間平均有7.0、4.5、7.0、11.5個和37.5個，而經(jīng)MB孢子懸浮液接種后，表現(xiàn)為1級至9級抗性的家系分別有4.5、4.5、3.5、12個和43個（表2）。MB培養(yǎng)基誘導(dǎo)的分生孢子懸浮液接種后玉米群體平均表型為感?。?級）和高感（9級）的家系略多于CMC培養(yǎng)基誘導(dǎo)的分生孢子懸浮液接種后的家系;而群體表型平均為高抗（1級）、

抗?。?級）和中抗（5級）的家系略少于CMC培養(yǎng)的分生孢子接種的家系（表2）。利用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析各家系用兩種孢子懸浮液接種后穗腐病病情指數(shù)，結(jié)果顯示用MB和CMC培養(yǎng)基制備的禾谷鐮孢分生孢子懸浮液在田間接種試驗(yàn)中對玉米穗腐病致病性無顯著差異（P>0.05）（表3）。綜上所述，利用CMC培養(yǎng)基進(jìn)行禾谷鐮孢分生孢子培養(yǎng)，耗時短、濃度高，且致病性與MB培養(yǎng)基培養(yǎng)的相同濃度的禾谷鐮孢相同。因此，CMC培養(yǎng)基是一種可以替代MB培養(yǎng)基進(jìn)行禾谷鐮孢分生孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)、并用于玉米穗腐病田間接種的高效培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行禾谷鐮孢分生孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)并配制孢子懸浮液進(jìn)行人工定量接種是玉米穗腐病相關(guān)研究的關(guān)鍵技術(shù)。由于禾谷鐮孢在多種培養(yǎng)基上主要以營養(yǎng)生長為主，不易產(chǎn)生分生孢子，而不適宜的培養(yǎng)條件容易引起病原菌的變異及致病力的退化[9]。常用的禾谷鐮孢大型分生孢子培養(yǎng)方法中，康乃馨葉瓊脂培養(yǎng)基（CLA）需要近紫外燈光的誘導(dǎo)才能產(chǎn)孢，培養(yǎng)難度大，一般在病原菌接種上利用較少。當(dāng)前大部分用于玉米田間接種的禾谷鐮孢分生孢子誘導(dǎo)多采用MB液體培養(yǎng)基[9-11]，而MB培養(yǎng)基產(chǎn)孢速度慢、孢子濃度低，難以滿足田間大規(guī)模試驗(yàn)定量接種的要求。因此，探索禾谷鐮孢大量產(chǎn)生大型分生孢子的培養(yǎng)方法是進(jìn)行禾谷鐮孢相關(guān)病害研究的基礎(chǔ)。本研究利用CMC和MB液體培養(yǎng)基分別于相同條件下進(jìn)行禾谷鐮孢大型分生孢子培養(yǎng)，根據(jù)孢子濃度計(jì)算兩種培養(yǎng)基的產(chǎn)孢增長率，結(jié)果表明，CMC培養(yǎng)基孢子增長率k2=1.125，MB培養(yǎng)基孢子增長率k1=0.844，說明禾谷鐮孢分生孢子在CMC培養(yǎng)基內(nèi)比MB培養(yǎng)基增長快，且分生孢子可達(dá)到的最大濃度更高。CMC培養(yǎng)基中分生飽和狀態(tài)。浸根法根部直接暴露在菌液中，沒有土壤環(huán)境的干擾，利于發(fā)病，且不需要控制濕度。與灌根法和果實(shí)接種法相比，本研究建立的接種方法具有菌需求量小，需求空間小，對接種環(huán)境要求小，鑒定時間短等優(yōu)點(diǎn)，適于大批量種質(zhì)資源的篩選。本研究可為辣椒抗病育種工作提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）