泰安櫻桃根癌病致病菌分離及生物型鑒定魏艷麗 RYDERMaarten

李紅梅

摘要 由致病性土壤桿菌侵染引起的根癌病嚴(yán)重影響了櫻桃樹的生長。利用選擇性培養(yǎng)基，以阿糖醇和赤蘚糖醇作為不同碳源，從山東泰安食用櫻桃根部瘤狀組織和感病根際土壤中分離到土壤桿菌100余株，通過胡蘿卜切片法和番茄莖部針刺接種法從中篩選到31株有致瘤活性的菌株。經(jīng)16S rDNA和recA基因序列分析，結(jié)合生物型檢測鑒定出96%以上的致病菌屬原生物Ⅱ型（Agrobacterium rhizogenes），只有1株致病菌為原生物Ⅰ型（A.tumefaciens）。根據(jù)Ti質(zhì)粒上致病相關(guān)基因保守序列設(shè)計3對引物，12株有致瘤活性菌株中11株P(guān)CR擴增到目的條帶。經(jīng)分子生物學(xué)測定和高壓紙電泳檢測，所有致病菌株的質(zhì)粒均為胭脂堿型。建立了致病型土壤桿菌的分子生物學(xué)快速鑒定方法，為定向選擇生防菌株提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 櫻桃; 根癌病; 致病菌; 生物型鑒定

中圖分類號： S 436.62

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020124

Abstract The crown gall disease caused by infection of the pathogenic Agrobacterium seriously affected the growth of cherry trees. More than 100 bacterial strains were isolated from the tumor tissues and rhizosphere soil of edible cherry trees in Taian， Shandong province， using selective media with arabinitol or erythritol as the carbon sources. Pathogenicity tests on carrot disks and tomato stems showed that 31 of the 40 strains were virulent. Based on the 16S rDNA and recA gene sequence analysis combined with identification of biovars， more than 96% of pathogenic bacteria were biovar Ⅱ （A.rhizogenes） and only one pathogenic bacteria was biovar I （A.tumefaciens）. Three pairs of primers were designed based on the conserved sequences of disease-causing genes on the Ti plasmid， and the target bands were amplified from 11 of 12 virulent strains by PCR. All strains investigated harbored nopaline-type of Ti plasmid based on molecular biology and high voltage paper electrophoresis. A rapid molecular identification method for the pathogenic Agrobacterium was established， which can provide a basis for the selection of biocontrol strains.

Key words cherry tree; crown gall disease; pathogenic agrobacterium; biovar type

由致病性土壤桿菌Agrobacterium spp.侵染植物引起的根癌病，是嚴(yán)重的細菌性病害之一，其寄主范圍達百余科上千種植物。在核果類、漿果類、堅果類果樹和其他觀賞植物中最易發(fā)生[1]。主要危害植物根莖、側(cè)根和枝干部位，典型癥狀是在受害植株的根部、根莖處甚至莖上形成大小不一的瘤狀組織使植株發(fā)育受阻，影響果樹苗木的生長。

土壤桿菌Agrobacterium spp.，屬于細菌域，細菌界，變形細菌門，α變形菌綱，根細菌目，根瘤菌科，土壤桿菌屬;是革蘭氏陰性細菌。對于它的分類，目前存在以致病性和以生理生化特性為依據(jù)的兩種不同方案?，F(xiàn)在普遍接受的是分為4個致病型種類和1個非致病型：原生物Ⅰ型根癌土壤桿菌A.tumefaciens、原生物Ⅱ型發(fā)根土壤桿菌A.rhizogenes、原生物Ⅲ型葡萄土壤桿菌A.vitis和懸鉤子土壤桿菌A.rubi，以及非致病性的放射土壤桿菌A.radiobacter [2]。根據(jù)侵染植株形成腫瘤中冠癭堿的種類，土壤桿菌又可分為章魚堿型（octopine）、胭脂堿型（nopaline）、農(nóng)桿堿型（agropine）、琥珀堿型或農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）等[3]，其中以章魚堿型和胭脂堿型最為常見。

目前國內(nèi)外對土壤桿菌的致病機理[4]研究較多，對根癌病的防治以生物防治為主，并且已篩選到多株生防菌。生防菌株對病原菌攜帶的Ti質(zhì)粒類型具有選擇性，如菌株K84只選擇性地抑制含胭脂堿型Ti質(zhì)粒的原生物Ⅰ型和Ⅱ型土壤桿菌[5]，E26只對原生物Ⅲ型土壤桿菌引起的葡萄根癌病具有防治效果[6]等。如何快速準(zhǔn)確地鑒定出致病菌和致病菌的類型，對于種苗檢疫、病害預(yù)測預(yù)報和制訂防治對策都具有重要意義。

食用櫻桃Cerasus pseudocerasus是山東泰安地區(qū)的主栽果樹之一，近幾年根癌病對其生長造成嚴(yán)重的影響，部分苗圃的發(fā)病率接近90%。本研究旨在研究該地區(qū)櫻桃根癌病病原細菌的分類地位，明確其生物分型，為生產(chǎn)上有針對性地防病治病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要培養(yǎng)基

YMA培養(yǎng)基：K2HPO4 0.5 g，CaCl2 0.2 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母浸粉 1 g，甘露醇 10 g，微量元素（1 000×）2 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4，瓊脂 15 g，121℃滅菌 20 min后備用。其中微量元素（1 000×）的配方為：FeCl3 5 g/L，MnCl2 0.1 g/L，ZnCl2 0.5 g/L。

1A培養(yǎng)基[7]：阿糖醇 3.04 g，NH4NO3 0.16 g，KH2PO4 0.54 g，K2HPO4 1.04 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，?；悄懰徕c0.29 g，0.1%結(jié)晶紫溶液2 mL。蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4，瓊脂 15 g，121℃滅菌 20 min。平板傾倒前每升加入2%放線菌酮10 mL，1%Na2SeO3·5H2O 10 mL。

2E培養(yǎng)基[7]：赤蘚糖醇3.05 g，NH4NO3 016 g，KH2PO4 0.54 g，K2HPO4 1.04 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，?；悄懰徕c0.29 g，1%酵母提取物溶液 1 mL，0.1%孔雀綠溶液5 mL。蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4，瓊脂 15 g，121℃滅菌 20 min。平板傾倒前每升加入2%放線菌酮10 mL，1%Na2SeO3·5H2O 10 mL。

1.2 對照菌株

A. tumefaciens K354，含質(zhì)粒pTi58，為產(chǎn)胭脂堿和農(nóng)桿菌素堿A的生物Ⅰ型致病性土壤桿菌;菌株A.rhizogenes K1026屬非致病性土壤桿菌;以上菌株均由澳大利亞阿德萊德大學(xué)Ryder Maarten教授提供。

1.3 感病土壤及櫻桃根癌組織取樣地點

取樣地點位于山東泰安岱岳區(qū)夏張鎮(zhèn)尹家莊村金旺大櫻桃專業(yè)合作社的櫻桃種植基地，土壤類型為棕壤，pH 6.34，經(jīng)檢測土壤中總氮、磷、鉀和有機質(zhì)的含量分別為1.35、1.24、1.9 g/kg和22.4 g/kg。試驗地塊有連續(xù)5年的中國櫻桃育苗史，冠癭病發(fā)病4年，部分地塊發(fā)病嚴(yán)重。

取樣時，小心完整地挖出感病植株根部，取部分根際土置于冰盒中。然后清水清洗根部，用鋒利的刀子取下瘤狀組織，置于冰盒中帶回實驗室。

1.4 根癌病原菌分離

根部瘤狀組織上病原菌分離采用常規(guī)分離法，選取根系上幼嫩瘤狀組織用無菌水清洗干凈，刮去表皮老化部分，切取10 g瘤狀組織，先用無菌水沖洗，放入0.52%的次氯酸鈉溶液浸泡 5 min，然后浸入75%乙醇30 s，再用無菌水沖洗3次。將組織搗碎后加入90 mL無菌水振蕩，即為10-1浸提液，依次梯度稀釋至10-6，每個稀釋度取100 μL分別涂布1A和2E培養(yǎng)基，設(shè)3個重復(fù)，放于26℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4 d，挑取不同形態(tài)菌株在YMA培養(yǎng)基上劃線接種，直至純化，保存。

根際土中病原菌的分離采取梯度稀釋法，稀釋至10-5后，分別涂布1A和2E培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)2～4 d后，挑取不同形態(tài)菌株在YMA培養(yǎng)基上劃線接種，直至純化，保存。

1.5 分離病原菌的鑒定

1.5.1 致病性鑒定

采用胡蘿卜切片法和番茄莖部針刺接種法[8]檢測分離菌株的致病性。供試胡蘿卜根莖購買自菜市場，品種為‘春紅二號;供試番茄品種為‘佳粉15號。

選擇新鮮、無損傷的胡蘿卜根莖，自來水清洗干凈，用70%乙醇擦洗后火焰干燥，橫切成5 mm厚的圓片，用干凈的手術(shù)刀片切除胡蘿卜圓片外周部分，放在鋪有水瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi)，靠近根端的一面朝上。挑取在YMA培養(yǎng)基上生長24 h的待測菌株，用無菌水制備成A600=0.3左右的菌懸液，各吸取30 μL涂于胡蘿卜圓片上。每個菌株重復(fù)接種2～3個胡蘿卜片，同時設(shè)無菌水對照，25℃培養(yǎng)2周左右觀察結(jié)果。

取生長50 d左右的健康番茄植株，每株番茄各取3個不同的枝條進行處理。先用75%乙醇表面消毒，再用無菌注射針頭輕刺并注射菌懸液10 μL左右，以無菌水為陰性對照，2～3周后調(diào)查創(chuàng)傷處瘤狀組織的產(chǎn)生情況。

1.5.2 生理生化指標(biāo)鑒定

參照Schaad等[9]的方法檢測待測菌株的3-酮基乳糖產(chǎn)生及對K2TeO3的耐受程度等。

1.5.2.1 3-酮基乳糖檢測

將分離純化的病原菌接種至培養(yǎng)基上，置于26℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至有明顯菌落形成時，向平板上倒入Benedict試劑，室溫放置30 min以上，如果菌落四周出現(xiàn)黃色則為陽性，判斷為原生物Ⅰ型。

培養(yǎng)基組分：乳糖10 g，酵母膏1 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

Benedict試劑：CuSO4·H2O 17.3 g，Na2CO3 100 g，檸檬酸鈉173 g，蒸餾水1 L。

1.5.2.2 對K2TeO3的耐受程度[10]

將分離純化的病原菌接種至含不同濃度K2TeO3的YMA培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)48 h以上觀察待測菌株對K2TeO3的耐受程度，一般原生物Ⅱ型的耐受程度高。

1.5.3 致病菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取在YMA培養(yǎng)基上生長24 h的待測菌株，接種至YM液體培養(yǎng)基中，26℃搖床培養(yǎng)36 h（菌量約108 cfu/mL），采用細菌DNA提取試劑盒（Omiga D3350），按照說明書的方法提取基因組DNA。通過凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量并稀釋至濃度為10～20 ng/μL，分裝并儲存于-20℃用于進一步分析。

2.5 菌株致病性相關(guān)基因的分子檢測

分別以K354和K1026作為陽性和陰性對照菌株，采用普通PCR法擴增12株病原菌的致病相關(guān)基因。結(jié)果顯示：除菌株C11-34和陰性對照菌株K1026外，12株待測菌中的11株均可擴增得到與3個目的基因virD2、tms2 和ipt大小一致的特異片段（圖6），3個基因之間的檢測結(jié)果一致性為100%。

2.6 致病土壤桿菌Ti質(zhì)粒的生物堿類型分子檢測

分別用擴增章魚堿型和胭脂堿型土壤桿菌Ti質(zhì)粒上iaaH基因的引物進行PCR擴增12株病原菌均擴增獲得420 bp的片段;用nos引物擴增，所有菌株（含胭脂堿型對照菌株K354）均擴增到206 bp的片段;而用ocs引物擴增，12株檢測菌均未獲得目的片段（表3）。表明分離的致病菌均為胭脂堿型土壤桿菌。

2.7 致病菌質(zhì)粒生物堿類型化學(xué)檢測

檢測了原生物Ⅰ型和原生物Ⅱ型中5株致病菌接種胡蘿卜切片后，產(chǎn)生的瘤狀組織生物堿的類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株致病菌產(chǎn)生的冠癭堿類型全部為胭脂堿型（圖7），未檢測到章魚堿類的生物堿，由此認為分離的致病性土壤桿菌質(zhì)粒類型均為胭脂堿型。

3 討論

以櫻桃根部瘤狀組織和感病土壤為研究對象，利用選擇性培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)瘤狀組織中原生物Ⅱ型土壤桿菌達到108 cfu/g的數(shù)量級，原生物Ⅰ型菌數(shù)僅占1%～5%;根際土壤中原生物Ⅱ型根癌農(nóng)桿菌為105 cfu/g，李茜等[16]研究認為當(dāng)土壤帶菌量達到103 cfu/g時，可導(dǎo)致桃樹根癌病的發(fā)生，本研究選擇的地塊中櫻桃根癌病發(fā)生嚴(yán)重，90%以上植株根部產(chǎn)生瘤狀組織。

在致病性土壤桿菌的分類鑒定中，表型特征是一類重要的指標(biāo)。利用α-乳糖產(chǎn)生3-酮基乳糖是原生物Ⅰ型土壤桿菌的獨有特征，本研究中1A培養(yǎng)基對原生物Ⅰ型土壤桿菌選擇性不強，分離的2株菌的3-酮基乳糖產(chǎn)生試驗中僅有1株為陽性。2E培養(yǎng)基對原生物Ⅱ型表現(xiàn)出高度的選擇性，這與Brisbane等[7]對澳大利亞農(nóng)田土壤的分析結(jié)果是一致的。對亞碲酸鹽的敏感性也可作為土壤桿菌生物分型的依據(jù)之一[10]，一般情況下原生物Ⅱ型對亞碲酸鹽的耐受程度較高，可耐受1 000 μg/mL的濃度;而生物Ⅰ型只能在低于300 μg/mL的濃度下生長，本研究的C31-32只可耐受80 μg/mL的濃度，與3-酮基乳糖結(jié)果一致。

在本研究中土壤桿菌的致病性采用胡蘿卜切片和番茄植株針刺接種，所有對胡蘿卜致病的菌株都可使番茄莖部產(chǎn)生瘤狀組織。在試驗過程中，為了不把瘤狀組織與胡蘿卜正常愈傷組織相混淆，只使用了基底面，因為正常愈傷組織總是生長在離體培養(yǎng)2周或2周以上的胡蘿卜片的頂端表面。在胡蘿卜切片的基底面檢測土壤桿菌的致病性是一種比接種植株更嚴(yán)格的致病性檢測方法[17]。本研究分別選擇了20株原生物Ⅰ型和Ⅱ型的菌株進行致病性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型病原菌90%以上具有致病性，而原生物Ⅰ型僅有10%有致病性，說明引起該地區(qū)冠癭病的主要病原菌是原生物Ⅱ型。

在細菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育地位研究方面，16S rDNA是最常用的分子工具，通常認為同源性大于97.5%的細菌可視為同種[18]，然而在土壤桿菌龐大的分支系統(tǒng)中，許多親緣關(guān)系較遠的菌株同源性大于98%，已不能準(zhǔn)確地確定菌株的系統(tǒng)分類學(xué)地位。recA基因是廣泛存在于細菌中重要的持家基因，在DNA重組和DNA損傷修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用，常用于包括土壤桿菌屬、紫色色桿菌屬等多種細菌的分型，越來越多地作為系統(tǒng)分類學(xué)研究工具[19]。本研究基于recA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析出生物Ⅰ型菌株C31-32與K354菌株處于一個分支，親緣關(guān)系更近，表明recA 基因比16S rDNA 具有更好的辨別能力，可作為土壤桿菌屬分型鑒定的依據(jù)。

采用胡蘿卜切片法和番茄莖部針刺接種法鑒定根癌土壤桿菌的致病性，需要2～3周的時間，而分子檢測因其快速、簡便，得到廣泛的研究及應(yīng)用[20-21]。根癌土壤桿菌的致病性與Ti 質(zhì)粒的Vir區(qū)和T-DNA區(qū)密切相關(guān)，其中Vir 區(qū)與病原菌的附著、T-DNA加工和轉(zhuǎn)移相關(guān)，T-DNA區(qū)為致瘤區(qū)，二者在決定病原菌的致病性時缺一不可。利用分子方法檢測致病性，至少需要Vir區(qū)與T-DNA區(qū)各一對引物相結(jié)合才能確定病原菌的致病性。本研究選用T-DNA 上ipt基因，Ti質(zhì)粒Vir 區(qū)的VirD2和tms2保守序列，12株菌株中有11株P(guān)CR擴增為陽性，與胡蘿卜切片和番茄植株活體接種一致。

植物根癌病的生物防治與病原菌攜帶的Ti質(zhì)粒類型密切相關(guān)[7]，明確致病菌在侵染植物形成瘤狀組織時產(chǎn)生的生物堿的類型，對篩選有效的生防菌至關(guān)重要。如放射性土壤桿菌HLB-2[22]可利用章魚堿和胭脂堿作為氮源，抑制由葡萄土壤桿菌引起的冠癭病;菌株E26可抑制由胭脂堿型、章魚堿型、農(nóng)桿菌堿型引起的冠癭病[6];工程生防菌K1026可抑制胭脂堿型土壤桿菌引起的冠癭病[8]。本研究利用PCR方法檢測的12株致病菌均為胭脂堿型，與利用傳統(tǒng)的高壓紙電泳法鑒定結(jié)果一致。

本研究分析表明，引起山東泰安大櫻桃根癌病的主要致病菌為原生物Ⅱ型的土壤桿菌A.rhizogenes，產(chǎn)生的生物堿類型為胭脂堿型，可選用K1026作為生防菌進行防治，這與本文作者前期的田間試驗結(jié)果[8]相一致。采用分子生物學(xué)方法確定病原菌的分類特征，可縮短鑒定時間，有助于病害早期診斷，為有針對性地開展生物防治提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）