熒光假單胞菌CZ菌株定殖及抗病毒活性研究

曲瀟玲 張俊英 劉笑瑋

摘要 熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CZ能分泌包括堿性磷酸酶在內(nèi)的抗病毒蛋白抑制煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）侵染。本文利用抗生素利福平逐級誘導(dǎo)獲得抗藥性標(biāo)記菌株CZ-rif，生測試驗(yàn)顯示：野生型和抗藥型菌株的發(fā)酵上清和粗蛋白液對TMV的體外鈍化效果均大于90%，無顯著差異。滅菌和非滅菌的根際土拌CZ-rif菌液后盆栽煙苗，取根際土在含抗生素的平板上檢測定殖菌量，結(jié)果顯示，CZ-rif能夠在煙株根際土壤中有效定殖，第31天在滅菌土中的定殖菌量為4.3×104 cfu/g，顯著大于在非滅菌土中的定殖菌量6×103 cfu/g，在葉面上的定殖菌量顯著低于根際土壤。葉面噴施CZ-rif菌液后24 h接種病毒，對TMV-GFP的預(yù)防效果為4585%。田間試驗(yàn)中噴淋菌株發(fā)酵稀釋液，對煙草花葉病毒病的防效為42.02%。此外，水培試驗(yàn)顯示生防菌發(fā)酵液對煙草幼苗具有促生作用?？傊?，熒光假單胞菌CZ能在煙草根際定殖和促進(jìn)植株生長，葉面噴施能鈍化TMV并抑制其初侵染，可以研發(fā)防治病毒病害的生物制劑。

關(guān)鍵詞 植物根際促生細(xì)菌; 熒光假單胞菌; 定殖; 促生

中圖分類號： S 435.72

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019501

Abstract Pseudomonas fluorescens CZ can secrete antiviral proteins including alkaline phosphatase to inhibit the infection of Tobacco mosaic virus （TMV）. The resistant strain named CZ-rif was obtained by inducible screening and culture with antibiotic rifampicin. Both wild type and resistant strain could produce antiviral proteins to remarkably inactivate TMV in vitro with an efficiency of above 90%， showing no significant difference. In colonization experiments by planting tobacco in sterilized or unsterilized soil mixed with CZ-rif bacteria， the population of colonizing bacteria in rhizosphere soil was checked by using the colony-counting method on plates with antibiotics. The results showed that CZ-rif could colonize the tobacco-planted soil. The population in unsterilized soil was 4.3×104 cfu/g， higher than that in sterilized soil （6×103 cfu/g） at 31 d. The population on the tobacco phylloplane was lower than that in the soil. Spraying bacteria could suppress TMV-GFP infection by 45.85% at 24 h. In field experiments by showering with bacteria fermentation， CZ had an inhibition effect of 42.02% against plant viruses. Furthermore， in water planting experiments， CZ fermentation broth could promote tobacco plant growth. In conclusion， P.fluorescens CZ could colonize the tobacco rhizosphere to promote plant growth， and inactivate TMV to suppress virus initial infection， showing the potential as a biological agent.

Key words plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR）; Pseudomonas fluorescens; colonization; growth-promoting

1989年-1991年第一次煙草侵染性病害調(diào)查指出，我國煙草上發(fā)生的病毒病害有16種[1]，2010年-2014年第二次侵染性病害調(diào)查時，病毒病種類上升至25種[2]。病毒病已成為煙草上的毀滅性病害，常年高頻發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前登記在煙草上的抗病毒劑有鹽酸嗎啉胍、混合脂肪酸、氯溴異氰尿酸、甾烯醇、寧南霉素、嘧肽霉素、氨基寡糖素、香菇多糖、殼寡糖、超敏蛋白、寡糖·鏈蛋白。近年來，α-氨基膦酸酯化合物毒氟磷以及噻二唑類雜環(huán)化合物甲噻誘胺獲得農(nóng)藥登記，用于防治植物病毒病[3]。

抗病毒劑的作用機(jī)制主要有三種：1）通過鈍化病毒和封閉侵染位點(diǎn)來抑制病毒的初侵染;2）通過干擾病毒蛋白的合成和病毒粒子裝配來抑制病毒增殖和擴(kuò)散;3）通過提高寄主防御酶活性和激活抗性相關(guān)基因的表達(dá)來誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[4]。但是，由于植物沒有完整的免疫系統(tǒng)，且病毒對植物細(xì)胞具有絕對寄生性，病毒一旦在植物體內(nèi)完成侵染，就會迅速擴(kuò)展，無藥根除。對來自真菌、細(xì)菌和植物的天然抗病毒活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定和分離，創(chuàng)制基于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的新型抗病毒劑成為研究熱點(diǎn)之一[3]。隨著環(huán)境安全問題日益突顯，生物農(nóng)藥及生物防治越來越受重視。

熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens能抑制多種土傳病原真菌、卵菌和線蟲;還能改善植物營養(yǎng)促進(jìn)生長，因而廣泛應(yīng)用于生物防治[5-11]。熒光假單胞菌的作用方式有兩種：1）定殖于植物根際，在幼根表面形成保護(hù)層，降低病原菌侵染機(jī)會[12]，同時產(chǎn)生水楊酸、脂多糖、嗜鐵素等物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[13-15];2）產(chǎn)生抗生素、嗜鐵素、細(xì)胞壁降解酶等拮抗物質(zhì)，直接抑制根際病原菌的生長[16-19]。

模式菌株CHA0、Pf5、Cab57全基因組測序表明，熒光假單胞菌含有編碼典型抗生素的4個基因簇：2，4-二乙?；冱S酚（2，4-diacetyl phloroglutinol， Phl）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin， Prn）、藤黃綠膿菌素（pyoluteorin， Plt）、氫化氰（hydrogen cyanide， Hcn）[20-22]。熒光假單胞菌M18菌株中含有1-羧基吩嗪（phenazine-1-carboxylic acid， PCA）和藤黃綠膿菌素兩種抗生素合成基因[23-24]。2P24菌株含有抗生素2，4-二乙酰藤黃酚合成基因[25]。FD6菌株中含有硝吡咯菌素、2，4-二乙酰藤黃酚、藤黃綠膿菌素、嗜鐵素、氫氰酸和蛋白酶等抗菌物質(zhì)的合成基因[26-27]。全基因組為有益基因的克隆、功能鑒定提供了依據(jù)[28]。

前期研究中，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌CZ菌株能分泌包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）在內(nèi)的抗病毒蛋白抑制煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）初侵染[29-31]。在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得AKP蛋白，生物測定顯示該抗病毒蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)，對TMV的LD90為0.285 0 mg/mL。作用機(jī)制主要為體外鈍化病毒和封閉初侵染點(diǎn)[32]。應(yīng)用中，是以抗病毒蛋白鈍化病毒抑制初侵染，還是以活菌定殖促生防病為宜，尚需驗(yàn)證。

本文通過抗生素利福平誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)，獲得抗性標(biāo)記菌株CZ-rif，確認(rèn)其抗病毒活性后，檢測其在煙草葉面和根際土壤中的定殖能力和促生防病效果，以期為種子包衣和菌劑應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生防細(xì)菌、病毒、煙草品種及侵染性克隆

熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CZ菌株，煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV），三生NN煙Nicotiana tobacum ‘Samsun NN、本氏煙N.benthamiana、普通煙‘NC89 N.tobacum ‘NC89，TMV-GFP（清華大學(xué)劉玉樂教授饋贈）。

1.2 菌株抗藥性標(biāo)記

采用利福平（Rif）進(jìn)行抗藥性標(biāo)記。將CZ菌株在LA固體培養(yǎng)基上劃線活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含利福平5 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min培養(yǎng)16～24 h后，在含利福平5 μg/mL的LA上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)入下一個濃度梯度中，依次經(jīng)過含利福平10、20、40、80、120、160、200 μg/mL的LB中誘導(dǎo)，直至篩選到穩(wěn)定生長的抗利福平200 μg/mL的突變菌株[33]。與野生型比較，記錄突變菌株CZ-rif的培養(yǎng)性狀。

1.3 抗病毒物質(zhì)的提取

將在LB中30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h的CZ和CZ-rif菌液，10 000 r/min離心10 min去菌體，為發(fā)酵上清。發(fā)酵上清于95℃水浴10 min滅活蛋白，為蛋白失活液。4℃條件下，向100 mL發(fā)酵上清中緩慢加入硫酸銨（56.1 g）至最終濃度為80%，輕輕攪拌溶解后4℃靜置過夜，10 000 r/min離心20 min，得上清與沉淀。上清用截留分子量為500 Da的透析袋透析，冷凍干燥后用10 mL PBS溶解，為去蛋白上清。沉淀用10 mL PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）溶解后，放入透析袋中透析過夜除去硫酸銨，冷凍干燥后用10 mL PBS溶解，為粗蛋白液[34]。

1.4 抗病毒物質(zhì)對TMV的抑制效果

取TMV感染的煙草病葉1 g，于液氮中充分研磨，加入40 mL PBS后濾去殘渣，為病毒接種液。

將發(fā)酵上清、蛋白失活液、去蛋白上清、粗蛋白液分別與等體積病毒接種液混合;以等體積的LB與接種液混合作為發(fā)酵上清和蛋白失活液的對照，以等體積的PBS與接種液混合作為去蛋白上清和粗蛋白液的對照。靜置15～20 min后，采用半葉法在三生NN煙葉片的左側(cè)摩擦接種抗病毒物質(zhì)與病毒的混合液，右側(cè)接種相應(yīng)的對照。每株接種3～4片展開葉，每處理4株重復(fù)。接種后噴清水去除石英砂，26℃培養(yǎng)4 d后調(diào)查枯斑數(shù)，按以下公式計算抑制效果[32]。

抑制率=對照單葉平均枯斑數(shù)-處理單葉平均枯斑數(shù)對照單葉平均枯斑數(shù)×100%。

1.5 抗藥性標(biāo)記菌株在根際土壤和葉面的定殖及對TMV-GFP的防效

取煙田根際土樣，進(jìn)行滅菌和非滅菌處理后，將CZ-rif菌液按1%的比例分別添加到土樣中，混勻后裝入8 cm小花盆中，植入5葉期煙苗，每處理4盆，置于溫室中，隔日澆水。于0、3、10、17、24、31、38、45、52、59 d，稱取1 g根際土于20 mL滅菌生理鹽水中振蕩漂洗30 min，取20～100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培養(yǎng)16 h后，在菌落計數(shù)儀上測定目標(biāo)菌量，以cfu/g土樣表示[35-37]。

將菌液噴灑于盆栽的7葉期本氏煙上（每株10 mL），置于28℃、相對濕度60%～80%的溫室中培養(yǎng)，隔日澆水。一部分植株于0、3、8、13、18、23、30 d，剪取5 g葉片于20 mL滅菌生理鹽水中振蕩漂洗，取100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培養(yǎng)16 h，以cfu/g鮮葉計數(shù)目標(biāo)菌量。另取部分植株于噴灑菌液后1 d，摩擦接種TMV-GFP病汁液，以噴灑培養(yǎng)基為對照，每處理4株重復(fù)，接種后4 d調(diào)查侵染斑數(shù)目，計算對病毒的預(yù)防效果。

1.6 CZ菌液對病毒病的田間預(yù)防效果

將CZ菌液用水稀釋15倍，菌量為106～108 cfu/g（現(xiàn)配現(xiàn)用），采用噴淋法進(jìn)行病毒病預(yù)防試驗(yàn)。普通煙‘NC89移栽時第一次施藥，間隔7～10 d，再連續(xù)噴淋2次。每處理設(shè)置4次重復(fù)，每重復(fù)25株，每株50 mL。以噴施0.5%香菇多糖水劑400倍液、20%鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑600倍液為藥劑對照。于末次施藥后10、20 d各調(diào)查1次病情，每小區(qū)調(diào)查全部煙株[38]。按下式計算預(yù)防效果，對各處理防治效果采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)級數(shù)）調(diào)查總株數(shù)×9×100;防治效果=空白對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)處理區(qū)病情指數(shù)×100%。

1.7 CZ菌株對煙草的促生效果測定

平皿濾紙法萌芽試驗(yàn)：向9 cm的平皿中加入0.3 mL CZ發(fā)酵上清和3 mL去離子水，以0.3 mL LB培養(yǎng)基和3 mL去離子水為空白培養(yǎng)基對照，以3.3 mL去離子水為清水對照。混勻后鋪一層濾紙，每皿點(diǎn)種100粒，4皿重復(fù)，用封口膜封口后，26℃培養(yǎng)9 d，統(tǒng)計發(fā)芽率并稱量百芽鮮重。CZ發(fā)酵上清稀釋15倍后浸種48 h，種子包衣時再包裹菌體粉末制備包衣劑，采用平皿濾紙點(diǎn)播法測試發(fā)芽率。

水培法促生試驗(yàn)：向盛有550 mL霍格蘭氏營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中加入20 mL CZ發(fā)酵液，以550 mL霍格蘭氏營養(yǎng)液和20 mL LB培養(yǎng)液為LB培養(yǎng)液對照，以570 mL霍格蘭培養(yǎng)液為空白對照。取長勢一致的四葉期煙草幼苗，洗去根土插入培養(yǎng)孔中，每組8株，3次重復(fù)。每日添加去離子水10 mL，26℃培養(yǎng)14 d，觀察幼苗根冠生長并稱量植株鮮重[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗藥性標(biāo)記菌株CZ-rif的性狀及對TMV的抑制活性

野生型菌株經(jīng)Rif抗性誘導(dǎo)后，獲得穩(wěn)定的抗性標(biāo)記菌株CZ-rif，其在平板和斜面上的生長性狀與野生型無顯著差異。提取發(fā)酵產(chǎn)物，利用半葉法測定對TMV的抑制效果，如表1所示，CZ的發(fā)酵上清、去蛋白上清、粗蛋白液、蛋白失活液對TMV的抑制率分別為96.13%、0%、91.76%、28.96%。CZ-rif的抑制效果分別為96.91%、0%、10000%、66.67%，顯示二者的發(fā)酵上清、粗蛋白液均有良好的鈍化作用，利福平抗性篩選不影響菌株的抗TMV活性。此外，菌株的蛋白失活液仍有一定的抑制效果，說明起抗病毒作用的除了大分子蛋白類，還包括非蛋白類物質(zhì)。試驗(yàn)效果如圖1所示。

2.2 CZ-rif菌株在煙草根際土壤和葉面中的定殖及對TMV-GFP的防效

由圖2結(jié)果可知，CZ-rif在非滅菌土中0～3 d內(nèi)由4.72×106 cfu/g急劇下降至1.916×106 cfu/g，降幅達(dá)59.41%，這可能與非滅菌土中微生物種群復(fù)雜且互相制約有關(guān)。第31天之后種群趨于穩(wěn)定，定殖菌量為6×103 cfu/g土樣。而在滅菌土中，0～3 d內(nèi)由9.04×106 cfu/g上升至2.76×107 cfu/g，升幅達(dá)205.31%，可能是沒有土著微生物競爭，種群有一個上升的過程。但隨后菌量下降，第17天下降至1.952×106 cfu/g，第31天有一個小高峰;之后種群趨于穩(wěn)定，定殖菌量為4.3×104 cfu/g，菌量水平明顯高于非滅菌土中的菌量。

由圖3結(jié)果可知，噴施菌液后0～30 d，菌株在煙草葉片上種群動態(tài)呈下降趨勢。0 d的菌量為3.025×107 cfu/g，第3天急劇下降至3.225×106 cfu/g，降幅達(dá)89.34%，第13天下降至3.48×105 cfu/g，隨后趨于平穩(wěn)，第30天的定殖數(shù)量為2×103 cfu/g鮮葉。前期菌量急劇下降可能與淋溶澆水有關(guān)，也說明菌株在葉面不易定殖。

2.3 生防菌培養(yǎng)液對煙草病毒病的田間預(yù)防效果

普通煙NC89自移栽時采用CZ培養(yǎng)稀釋液噴淋預(yù)防病毒病，以噴施0.5%香菇多糖水劑400倍液和20%鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑600倍液為對照，結(jié)果見表2。末次藥后7 d調(diào)查結(jié)果顯示：CZ處理的發(fā)病率16.00%、病情指數(shù)2.89，顯著低于清水對照的發(fā)病率31.33%和病情指數(shù)7.76，防治效果為62.76%，高于對照藥劑。末次藥后21 d調(diào)查結(jié)果顯示：各處理發(fā)病率均明顯上升，CZ處理的發(fā)病率8682%、病情指數(shù)27.68，顯著低于清水對照的發(fā)病率98.00%和病情指數(shù)47.74，防治效果為4202%，與對照藥劑處理的防效相當(dāng)。上述試驗(yàn)結(jié)果說明：噴淋生防菌培養(yǎng)液對煙草病毒病有較好的預(yù)防效果。

2.4 菌株對煙草幼苗生長的促進(jìn)作用

由平皿濾紙法萌芽試驗(yàn)看出，LB培養(yǎng)基、清水對照和CZ發(fā)酵上清3種處理的種子發(fā)芽率均為100%，但CZ處理（發(fā)酵上清與清水1∶10混合）中種子萌芽更健壯;第9天時，CZ處理百芽鮮重為0.15 g，略高于LB培養(yǎng)基對照（0.09 g）和清水對照處理（0.10 g）（圖5），顯示CZ對幼苗生長有一定的促進(jìn)作用。

試驗(yàn)中還觀察到CZ發(fā)酵上清或LB培養(yǎng)基與清水1∶1混合處理時，種子不萌發(fā);1∶5混合處理時，種子發(fā)芽率100%，發(fā)芽勢與對照相比無顯著差異，這說明高濃度的發(fā)酵上清對種子萌芽有抑制作用，適當(dāng)濃度才會促進(jìn)種子萌發(fā)。在種子包衣中，進(jìn)行生防菌發(fā)酵上清浸種及包裹菌體粉末處理，其發(fā)芽率與常規(guī)包衣種子無顯著差異。

煙草幼苗在添加CZ發(fā)酵液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d時，幼苗的莖葉生長和根系發(fā)育均優(yōu)于LB培養(yǎng)基和空白對照處理（圖6）。CZ處理的幼苗其根系發(fā)育粗短健壯、側(cè)根較多，單株平均鮮重（2.12 g）明顯高于LB培養(yǎng)基（1.13 g）和清水對照處理（0.85 g），說明CZ有促進(jìn)幼苗生長的作用。

3 結(jié)論與討論

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（責(zé)任編輯：田 喆）