煙草根黑腐病根際拮抗菌的篩選、鑒定及其促生防病效果

羅云艷 安航 何佶弦 楊洋 江連強(qiáng) 閆芳芳 徐傳濤 安德榮 李斌

摘 要：為挖掘?qū)煵莞诟【休^高拮抗效果的根際促生菌資源，從四川廣元和陜西漢中等地采集30份煙草根際土壤，以煙草根黑腐病菌為靶標(biāo)，采用溫度篩選法和平板對峙法分離篩選出有高效拮抗活性的菌株，并對該菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用抗生素標(biāo)記法和溫室盆栽法測定菌株LY79的定殖規(guī)律、對煙草的促生效果以及對煙草根黑腐病的防治效果。結(jié)果表明：（1）從煙草根際土壤分離到一株煙草根黑腐病高效拮抗菌株LY79，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定結(jié)合16S rRNA和持家基因ropB分析將菌株LY79鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。（2）抗生素標(biāo)記菌株LY79A在煙草根際土定殖規(guī)律為先下降后上升再下降最終趨于穩(wěn)定，且施藥40 d后仍能在煙草根際土、根系、莖、葉分離到1.34×106、2.91×104、1.81×104、1.01×104 CFU/g的菌株LY79A，說明其定殖能力較強(qiáng)。（3）菌株LY79對煙草促生效果較好，處理60 d后，煙草的株高、莖粗、整株干質(zhì)量、根干質(zhì)量分別增加了34.68%、37.85%、103.79%、72.55%。（4）1×109 CFU/mL濃度的菌株LY79發(fā)酵液對煙草根黑腐病的盆栽防效達(dá)71.54%，僅略低于對照藥劑70%甲基托布津500倍液。解淀粉芽孢桿菌LY79在煙草根黑腐病防治中具有較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：煙草根黑腐病;根際促生菌;定殖;促生;防效

Abstract： In order to explore the plant growth promoting rhizobacteria （PGPR） resources with high antagonistic effect against tobacco root black rot， 30 tobacco rhizosphere soil samples were collected from Hanzhong and Guangyuan. The strains with high antagonistic activities against Thielaviopsis basicola were isolated and screened by temperature screening and the plate face-off method， and the strains were identified by phylogenetic analysis. The colonization ability of tobacco rhizosphere， the growth-promoting effect and the control effect of tobacco root black rot were determined by using the flat plate method， the antibiotic labeling method， and the greenhouse pot culture method， respectively. （1） Strain LY79， an antagonistic strain of tobacco root black rot， was isolated from tobacco rhizosphere soil and identified as Bacillus amyloliquefaciens by combining morphology， physiology and biochemistry with 16S rRNA and rpoB gene sequences. （2） The colonization of tobacco rhizosphere soil by LY79A was decreased first， then increased， then decreased and finally tended to be stable， and 1.34×106， 2.91×104， 1.81×104， 1.01×104 CFU/g LY79A strain could still be isolated from tobacco rhizomes， root， stem and leaf tissues after 40 days， This indicates that LY79A has strong colonization ability. （3） LY79 had an obvious effect on the growth of tobacco. Plant height， stem diameter， dry weight and root dry weight were increased by 34.68%，37.85%， 103.79% and 72.55%， respectively. （4） LY79 with a concentration of 1×109 CFU/mL had a control effect of 71.54% on the root black rot of tobacco in the pot experiment， slightly lower than the control effect of ? 500 X Metobuzin （70%）. In summary， Bacillus amyloliquefaciens LY79 had great potential in the control of tobacco root black rot.

Keywords： Thielaviopsis basicola; PGPR; colonization; grows; control effect

由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的煙草根黑腐病是危害嚴(yán)重的土傳真菌病害，煙草苗期至成株期均可受害，直接影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]?；瘜W(xué)藥劑的長期高劑量使用容易導(dǎo)致“3R”問題，因此，綠色、無殘留、無公害的生物防治日益受到重視[2]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種防治煙草根黑腐病的生防菌，易龍等[3]從煙草根際土壤中分離并篩選出枯草芽孢菌株R27，并證明該菌株能夠抑制煙草根黑腐病菌菌絲的生長，抑制病菌孢子萌發(fā)，溫室盆栽防效達(dá)80.2%;易龍等[4]還發(fā)現(xiàn)棘孢木霉TB72對煙草根黑腐病的防效達(dá)84.5%;陳小均等[5]的研究表明，木霉菌T150對煙草根腐病和黑脛病均有一定的防控作用，平均防效在76%以上。

植物根際促生菌（PGPR）可對植物產(chǎn)生有益作用，包括促生效應(yīng)、誘導(dǎo)抗性及拮抗病原菌等[6-7]，其機(jī)理復(fù)雜多樣，這些作用機(jī)制之間互相協(xié)調(diào)、互為補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)對植物病害的防御，具有非常大的應(yīng)用潛力。利用PGPR既能控制病原菌，又能促進(jìn)植物生長，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求[8-9]。芽孢桿菌作為PGPR的一員，其產(chǎn)生的芽孢對高溫、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗逆性，具有獨(dú)特的生防優(yōu)勢[10-13]。目前可應(yīng)用的高效生防菌株資源明顯匱乏，且防治效果不穩(wěn)定。本文從煙草根際土壤分離出一株高效拮抗煙草根黑腐病的芽孢桿菌，并對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定。通過探索其煙草根際定殖規(guī)律、促生效果以及對煙草根黑腐病的防治效果，進(jìn)一步豐富煙草根黑腐病根際促生菌菌種資源，同時(shí)為菌株的田間開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)土壤樣品分別采自陜西省漢中市南鄭縣新集鎮(zhèn)煙區(qū)、寧強(qiáng)縣二郎壩鎮(zhèn)煙區(qū)、四川省廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)煙區(qū)。供試煙草品種K326由陜西省煙草研究所提供。煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani.sorauer）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、蘋果腐爛病菌（Valsa ceratosperma）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源微生物與植物病毒實(shí)驗(yàn)室保存和提供。培養(yǎng)基：LB和PDA，配制參考沈萍等[14]的方法。

1.2 方法

1.2.1 根際拮抗菌的分離 分別于2019年6—9月從各煙草主栽區(qū)的發(fā)病田中采集健康煙草植株根際土壤，共計(jì)采集30份土樣。采用溫度篩選法（60 ℃恒溫水浴30 min）和平板稀釋涂布法，分離菌株，純化后4 ℃冰箱保存[15]。

1.2.2 根際拮抗菌的篩選 拮抗菌的初篩采用平板對峙法[16]，用接種環(huán)蘸取拮抗菌點(diǎn)接于距供試病原菌相等距離的十字交叉線的四端，以單獨(dú)接種病原菌為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)。根據(jù)抑菌帶寬度確定拮抗程度，選取拮抗效果好的菌株。拮抗菌的復(fù)篩參考周德慶[17]的方法，測量拮抗菌無菌濾液對煙草根黑腐病菌的相對抑制率。相對抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-5）×100。

1.2.3 菌株LY79抑菌譜的測定 采用平板對峙法，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的病原菌測定拮抗菌的抑菌廣譜性。

1.2.4 菌株LY79的鑒定 形態(tài)和生理生化鑒定：菌株LY79的菌體形態(tài)觀察、生理生化測定參照《芽孢桿菌屬》[18]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]中介紹的芽孢桿菌生理生化試驗(yàn)進(jìn)行。分子鑒定：用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F（5?-GTTTGATCMT GGCTCAG-3?）和1492R（5?-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3?）擴(kuò)增菌株LY79的16S rRNA基因序列，用細(xì)菌rpoB基因通用引物rpoB-F（ATCGAAACGCCTGAAGGTCCAAACT）和rpoB-R（ACACCCTTGTTACCGTGACGACC）擴(kuò)增菌株LY79的rpoB持家基因，送往上海生工測序[20]。測得16S rRNA基因序列通過數(shù)據(jù)庫Ezbiocloud與已知模式菌株進(jìn)行比較[21]，rpoB基因序列在NCBI中經(jīng)BLAST比對后進(jìn)行同源性比較，均使用MEGA 7.0軟件的最大似然法（Maximum Likelihood Method）構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢測。

1.2.5 菌株LY79對煙草的促生作用 煙草種子（K326）50 ℃溫湯浸種30 min后播種于土壤中（V基質(zhì)：V滅菌土壤=1：1），于防蟲溫室中25 ℃培養(yǎng)，光周期L：D=12 h：12 h。挑選6～8葉期的煙草，每株灌根1×108 CFU/mL菌株LY79發(fā)酵液15 mL，每處理30株，3次重復(fù)。共施藥3次，每次間隔5 d，LB液體培養(yǎng)基為對照。60 d后，測量煙草株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量[22-23]。

1.2.6 菌株LY79定殖規(guī)律檢測 利用抗生素標(biāo)記法[24]標(biāo)記菌株LY79，以5、20、40、60、80、100、150、200和300 μg/mL等不同濃度利福平對菌株LY79在LB培養(yǎng)基上逐級誘導(dǎo)，篩選出抗利福平濃度達(dá)300 μg/mL的菌株LY79A，經(jīng)穩(wěn)定性和活性檢測后保存、備用，未標(biāo)記菌株不能在含300 μg/mL利福平平板上生長。挑選6～8葉期的煙草，標(biāo)記菌株LY79A發(fā)酵液（1×108 CFU/mL）灌根，每盆灌根10 mL，分3次處理，每次間隔3 d。于灌根處理結(jié)束后第1、3、5、7、10、15、20、30、40 天分離煙草根際土壤、根系、莖、葉的菌株LY79A[15]。煙草根際土壤LY79A的分離：將根際土壤菌懸液梯度稀釋后涂布于含有300 μg/mL利福平的LB平板。煙草植株LY79A的分離：將煙草根系、莖、葉片研磨后稀釋涂布，3次重復(fù)，計(jì)算含菌量（CFU/g）。

1.2.7 菌株LY79對煙草根黑腐病的防治效果 盆栽防治效果檢測做3個(gè)處理：（1）1×107、1×108、1×109 CFU/mL濃度的菌株LY79發(fā)酵液;（2）70%甲基托布津1500、1000、500倍液;（3）LB液體培養(yǎng)基作對照。采取灌根法，每株處理15 mL，每處理50株，3次重復(fù)，共施藥2次，間隔5 d。處理結(jié)束7 d后，接種1×109 CFU/mL濃度的煙草根黑腐病菌孢子懸浮液。記錄發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率[25-26]，按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39—1996[27]進(jìn)行病害調(diào)查和嚴(yán)重度分級，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 22和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié) 果

2.1 根際拮抗菌的分離、篩選

經(jīng)稀釋涂布平板法和溫度篩選法，從30份煙草根際土樣中，共計(jì)分離到127株不同的菌株。以煙草根黑腐病菌為靶標(biāo)，經(jīng)平板對峙法進(jìn)行初篩和復(fù)篩，篩選到11株對煙草根黑腐病菌有較強(qiáng)拮抗活性的菌株，其中菌株LY79對煙草根黑腐病菌拮抗效果最好，平均抑菌帶寬為12.30 mm（圖1），無菌濾液對煙草根黑腐病菌的相對抑制率為81.46%（圖1-2）。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株LY79能夠使煙草根黑腐病菌菌絲分枝增多、膨大變粗、扭曲畸形，對照菌絲生長均勻，并無畸形膨大現(xiàn)象（圖3）。

2.2 菌株LY79抑菌譜測定

利用實(shí)驗(yàn)室保存的多種病原菌檢測菌株LY79的抑菌譜。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株LY79對梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌、棉花枯萎病菌、蘋果腐爛病菌、蘋果炭疽病菌、西瓜炭疽病菌、煙草赤星病菌和玉米大斑病菌的抑菌帶寬分別為11.25±0.05、10.67±0.12、9.83±0.16、9.52±0.23、12.35±0.26、5.64±0.13、8.82±0.07、10.79±0.06 mm，具有抑菌廣譜性（圖4）。

2.3 菌株LY79的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)觀察及生理生化測定 菌株LY79在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌落呈無色透明液滴，有光澤，48 h的菌落表面光滑質(zhì)地粘稠，呈乳白色圓形。革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，芽孢橢圓形。掃描電鏡下，菌株LY79呈短桿狀、兩端鈍圓（圖5）。

生理生化測定結(jié)果顯示，菌株LY79可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖等作為營養(yǎng)物質(zhì)，甲基紅試驗(yàn)為陽性，能產(chǎn)生菌膜。菌株在4 ℃、50 ℃、pH 4.0、pH 9.0、13% NaCl下仍能生長，說明菌株LY79對溫度、酸堿度、鹽濃度的穩(wěn)定性較好（表1）。形態(tài)學(xué)和生理生化結(jié)果表明菌株LY79符合芽孢桿菌屬的基本特征。

2.3.2 分子鑒定 利用通用引物，分別擴(kuò)增菌株LY79的16S rRNA和持家基因rpoB序列，獲得1442 bp和1182 bp的基因片段。同源性比對后采用MEGA7.0軟件的最大似然法建系統(tǒng)發(fā)育樹，在16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LY79與Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus siamensis在同一分支（圖6），繼續(xù)對其持家基因rpoB序列建樹后發(fā)現(xiàn)，菌株LY79與Bacillus amyloliquefaciens在同一分支，且支持率達(dá)100%（圖7）。因此，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育分析將菌株LY79鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.4 菌株LY79對煙草的促生效果

通過盆栽試驗(yàn)檢測1×108 CFU/mL菌株LY79發(fā)酵液對煙草的促生效果，處理60 d后，煙草葉片寬厚、濃綠，根系發(fā)達(dá)，與對照相比，處理組煙草株高增加了34.68%，莖粗增加了37.85%，整株干質(zhì)量增加了103.79%，根干質(zhì)量增加了72.55%，說明菌株LY79對煙草的促生效果較好（圖8、表2）。

2.5 菌株LY79在煙草體內(nèi)的定殖規(guī)律檢測

將1×108 CFU/mL標(biāo)記菌株LY79A發(fā)酵液對煙草進(jìn)行灌根處理，發(fā)現(xiàn)菌株LY79A在煙草根際的定殖量先迅速下降后少量上升再緩慢下降，最終趨于穩(wěn)定，接種第40天的定殖量為1.34×106 CFU/g。菌株LY79A在煙草根系、莖和葉的定殖量呈先上升后下降，最終趨于穩(wěn)定的趨勢，至第40天的定殖量分別為2.91×104、1.81×104、1.01×104 CFU/g。從定殖數(shù)量上看，菌株LY79A易在煙草根際和根系定殖，莖和葉片次之（圖9）。

2.6 菌株LY79對煙草根黑腐病的盆栽防治效果

采用灌根的方法檢測菌株LY79對煙草根黑腐病的盆栽防治效果（表3），與對照相比，菌株LY79和70%甲基托布津處理煙草后，發(fā)病率和發(fā)病程度均顯著降低。1×109 CFU/mL濃度的LY79發(fā)酵液對煙草根黑腐病防治效果達(dá)71.54%，且發(fā)病率為16.67%。500倍液70%甲基托布津?qū)煵莞诟》乐涡Ч_(dá)78.5%，略高于菌株LY79發(fā)酵液，但差異并不大，說明菌株LY79對煙草根黑腐病具有顯著的防治效果。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）作為植物根際促生菌，能分泌多種抗菌蛋白、β-1， 3-葡聚糖酶及伊枯草菌素A（ iturin），對多種植物的促生作用和多種病原菌的抑制作用已有報(bào)道[28-29]。生防菌株能在寄主植物中穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮促生防病作用的重要前提，了解菌株的定殖特性，可以最大程度地發(fā)揮菌株的促生防病效果，實(shí)現(xiàn)生防菌的合理利用。同時(shí)，將防病作用與促生作用相結(jié)合，更能達(dá)到理想的效果[6]。

本試驗(yàn)從陜西漢中和四川廣元煙草主栽區(qū)發(fā)病田中采集健康煙草根際土壤，從中分離、篩選到煙草根黑腐病菌的高效拮抗芽孢桿菌LY79，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA和rpoB基因?qū)⑵滂b定為解淀粉芽孢桿菌，因采用根際土壤，篩選出的拮抗菌對煙田土壤環(huán)境和煙草具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，有利于其在煙草上定殖并發(fā)揮其促生、防病效果。

李苗苗等[30]篩選出一株解淀粉芽孢桿菌GY10能夠在煙草根際良好定殖，根際定殖量呈緩慢下降的趨勢，15～30 d 趨于平穩(wěn)，且多菌株復(fù)配相對于單一菌株在根際定殖更具優(yōu)勢。本試驗(yàn)中，菌株LY79在煙草根際土壤中呈先下降后上升再下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢，這和李苗苗的研究略有差異，但是總體趨勢是一樣的，原因可能是本試驗(yàn)施用生防菌的量較多，增加了生防菌之間的種內(nèi)競爭。另外，申莉莉等[31]觀察到解淀粉芽孢桿菌Ba33發(fā)酵液灌根處理的煙苗鮮質(zhì)量、最大葉長和葉寬均高于清水對照處理，葉色濃綠，長勢良好。黃智華等[32]也從云南煙區(qū)烤煙根際土中篩選的解淀粉芽孢桿菌具有解磷、解鉀或IAA促生功能。本試驗(yàn)測定了菌株LY79對煙草的促生效果，煙草整株干質(zhì)量和根干質(zhì)量分別增加了103.79%和72.55%，說明菌株LY79促進(jìn)了煙草有機(jī)物積累以及根系生長，尤其是側(cè)根明顯增多。最后，比較了不同濃度梯度的菌株LY79和煙草根黑腐病常用農(nóng)藥70%甲基托布津的防治效果，結(jié)果顯示菌株LY79對煙草根黑腐病的防效達(dá)71.54%，略低于70%甲基托布津，但較LB培養(yǎng)基對照防效明顯。這與宋玉娟等[33]研究的棘孢木霉T-6對煙草根黑腐病的防治效果達(dá)75.14%相近。綜上，雖然菌株LY79的防效略低于70%甲基托布津，但生物農(nóng)藥尤其是芽孢桿菌制劑較化學(xué)農(nóng)藥優(yōu)勢明顯，在田間應(yīng)用中，若發(fā)病嚴(yán)重，考慮使用菌株LY79與農(nóng)藥配合防治，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，減少化學(xué)農(nóng)藥使用，減少農(nóng)藥殘留，推進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)分離到一株對煙草根黑腐病菌有較高拮抗活性的解淀粉芽孢桿菌LY79，具有抑菌譜廣，耐高低溫、耐酸堿、耐鹽等特性。而且菌株LY79能較快在煙草根際定殖并維持穩(wěn)定的數(shù)量，對煙草的促生作用明顯。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)證明，菌株LY79對煙草根黑腐病菌的防治效果也較好。結(jié)果為菌株LY79在大田應(yīng)用和煙草根黑腐的綠色防控提供了優(yōu)質(zhì)資源。

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