MassARRAY質(zhì)譜分析腦膠質(zhì)瘤6個(gè)基因11個(gè)突變位點(diǎn)的方法建立與應(yīng)用

趙煥英 隋雷鳴 王俐勇 付文卓 趙君朋

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室基因組學(xué)研究平臺(tái)，北京 100069)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超越14000例。近幾年，腦瘤分子標(biāo)記物檢測(cè)逐漸得到重視和開展，并為疾病診斷、預(yù)后的估判、及治療方法選取提供有力信息支持，極大推進(jìn)了原有的單純組織病理學(xué)分類方法。其中膠質(zhì)瘤相關(guān)基因中異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)、異檸檬酸脫氫酶2(Isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)基因突變易發(fā)生在年輕膠質(zhì)瘤患者、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤及混合性膠質(zhì)瘤，IDH1/2突變的患者預(yù)后相對(duì)較好[1-3]。組蛋白h3.3和h3.1基因(H3F3A和HIST1H3B)的點(diǎn)突變?cè)谛簭浡灾芯€膠質(zhì)瘤中發(fā)生率高達(dá)80%，其中在小兒彌漫性高級(jí)星形細(xì)胞瘤中，組蛋白H3.3基因H3F3A K27M 突變率高于 G34R/V，H3K27M 突變治療反應(yīng)差，生存率低，因此K27M分子可作為鑒別診斷的標(biāo)準(zhǔn)分子之一[4-6]。BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子區(qū)域突變常分別在低分級(jí)和高分級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)生[7]，BRAFV600E突變?cè)谏掀幽z質(zhì)母細(xì)胞瘤中占比達(dá)50%，而在其他類型神經(jīng)母細(xì)胞中極少有BRAF的突變，BRAF突變腫瘤侵襲性強(qiáng)，同時(shí)也可望成為治療的靶點(diǎn)[8]。TERT啟動(dòng)子突變是最常見的單基因成人彌漫性膠質(zhì)瘤的突變類型，TERT啟動(dòng)子區(qū)-124和-146位點(diǎn)常發(fā)生C228T和C250T突變類型，對(duì)膠質(zhì)瘤亞型分類有高度特異性，是彌漫性膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)[9]。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，針對(duì)以上突變位點(diǎn)的檢測(cè)，通常采用免疫組化、一代測(cè)序及焦磷酸測(cè)序的方法，時(shí)間長(zhǎng)，成本貴。本實(shí)驗(yàn)旨在建立MassARRAY 質(zhì)譜分析方法同時(shí)檢測(cè)這些位點(diǎn)，為疾病的診斷和治療提供可行性信息。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料：

40例人腦膠質(zhì)瘤石蠟組織包埋標(biāo)本，正常人外周血液樣本為陰性對(duì)照，生理鹽水空白對(duì)照。

(2)主要試劑與儀器：

蛋白酶K(Merk)，核酸提取試劑盒、Lab-Aid 824核酸提取自動(dòng)提取儀(廈門至善生物科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)(IMPLEN)；QIAxcel Advanced 毛細(xì)管電泳儀(Qiagen)；一代測(cè)序儀3730(ThermoFisher)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒、MassARRAY清潔樹脂、iPLEX Pro Reagent Kit、MassARRAY Analyzer 4 System 384cpm質(zhì)譜分析儀(Agena)；振蕩混懸儀(Eppendorf)；Allegra 25R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beckman)；LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 石蠟樣本DNA提取

石蠟樣本經(jīng)二甲苯脫蠟處理后行蛋白酶K 消化至液體狀，于Lab-Aid 824儀器上進(jìn)行核酸自動(dòng)提取，方法參見文獻(xiàn)[10]。

2.2 6個(gè)基因11位點(diǎn)的檢測(cè)引物準(zhǔn)備

通過(guò)檢索Pubmed 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，統(tǒng)計(jì)膠質(zhì)瘤相關(guān)基因突變位點(diǎn)，確定6個(gè)候選基因11個(gè)位點(diǎn)如下：IDH1-132(rs121913500)、IDH2-172(rs121913503)、IDH2-140(rs121913502)、TERT(-245,rs2853669)、TERT(-124)、TERT(-146)、H3.1-27、H3.3-27(rs1057519902)、H3.3-34(rs1057519903)、H3.3-33、BRAF-600。gene數(shù)據(jù)庫(kù)中下載6個(gè)基因組序列，標(biāo)注目的突變位點(diǎn)，選取突變位點(diǎn)前后約200bp堿基序列，編輯引物設(shè)計(jì)文檔。利用Agena BioScience軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物8對(duì)，位點(diǎn)延伸引物11條，延伸引物設(shè)計(jì)位于突變位點(diǎn)前一個(gè)堿基，與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，見表1。根據(jù)延伸引物及后續(xù)單堿基分子量不同，把11個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)分成2組見表2，每組分別配置每條引物濃度為0.5 μmol·L-1多重PCR反應(yīng)的混合引物。

2.3 MassARRY反應(yīng)體系

a)多重PCR反應(yīng)：每個(gè)樣品配置反應(yīng)體系5 μL，其中濃度為10×PCR緩沖液0.5μL、MgCl2(25 mmol·L-1)0.4 μL、dNTPs(25 mmol·L-1)0.1 μL、PCR 熱啟動(dòng)酶(5 U·μL-1)0.2 μL、擴(kuò)增引物混合液1μL、基因組DNA(10 ng·μL-1)1μL，超純水補(bǔ)足至5μL。在兼容384孔板的PCR儀上，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃20 s，56℃30 s，72℃ 60 s，共45個(gè)循環(huán)：72℃再延伸3 min。

b)PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶(SAP)處理：PCR反應(yīng)結(jié)束，向384 孔反應(yīng)孔中加入2μl SAP 反應(yīng)混合液，密封反應(yīng)孔，于PCR儀上運(yùn)行程序：37℃ 40 min，85℃ 10min。

c)單堿基延伸反應(yīng)：在384 孔中加入2μL 單堿基延伸混合液及引物，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 10min；94℃30 s，56℃30s，72℃1 min，72℃3 min；4℃保存。

2.4 質(zhì)譜檢測(cè)及分析

在384 孔中加入16μL 去離子水與6mg樹脂，按操作說(shuō)明書進(jìn)行脫鹽處理；后利用MassARRAY Nanodispenser RS 1000點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至384孔芯片上，自然干燥后上機(jī)，運(yùn)行MALDI-TOF質(zhì)譜程序，采用MassARRAY TYPER4.1軟件(Agena)進(jìn)行基因型判讀。

3 結(jié)果與討論

3.1 多重PCR引物的篩選

MassARRAY原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)。主要特點(diǎn)是：PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點(diǎn)上，延伸 1個(gè)堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，后置入質(zhì)譜儀的真空管，于瞬時(shí)納秒(10-9s)強(qiáng)激光激發(fā)，基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量，使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)電荷離子，離子在加速電場(chǎng)中獲動(dòng)能，按照其質(zhì)荷比率加以分離，離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比。通過(guò)檢測(cè)離子在真空管飛行到檢測(cè)器的時(shí)間精確物質(zhì)分子量，從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息，基于飛行管長(zhǎng)度限制，MassARRAY SNP 檢測(cè)的分子量范圍為5000～8500 Dalton。檢測(cè)基于多重PCR方法，一管反應(yīng)體系中引物數(shù)量多，這要求引物間避免互補(bǔ)，尤其需絕對(duì)避免延伸引物3’端與其他引物有超過(guò)3個(gè)堿基的互補(bǔ)。否則易造成非特異延伸，出現(xiàn)錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果。為了保證PCR擴(kuò)增效率，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度一般不超200bp，還需遵循其他PCR引物設(shè)計(jì)原則(避免形成二聚體/錯(cuò)配等)[11]。利用Agena BioScience軟件篩選出的8對(duì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在71bp～121bp之間，如表1。引物前端添加與人類基因無(wú)關(guān)的標(biāo)簽序列ACGTTGGATG，目的增加引物分子量使其大于8500Da，超過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)限，避免對(duì)延伸引物及產(chǎn)物產(chǎn)生干擾。

表1 6個(gè)基因的11個(gè)待檢位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列信息

3.2 延伸引物及分子量范圍

根據(jù)延伸引物及延伸一個(gè)堿基后分子量不同，基質(zhì)輔助激光解吸后電離飛行到檢測(cè)器的時(shí)間不同，分子質(zhì)量小的先到達(dá)，質(zhì)譜峰先出現(xiàn)。11個(gè)位點(diǎn)的延伸引物信息如表2，第1組5個(gè)位點(diǎn)組合，分子量范圍為4844.2Da～7923Da；第2組6個(gè)位點(diǎn)組合，分子量范圍為4833.1Da～8367.3Da。

表2 11個(gè)待檢位點(diǎn)的延伸引物及產(chǎn)物序列信息

3.3 兩組突變位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)

每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)兩組多重PCR擴(kuò)增及延伸反應(yīng)后，分別在芯片上進(jìn)行點(diǎn)樣，激光解吸后電離。圖1是第1組前5個(gè)位點(diǎn)的質(zhì)譜分離圖，可以看出延伸后的分子量從5115.4Da～7923Da 之間；圖2是第2組后6個(gè)位點(diǎn)質(zhì)譜分離圖，分子量在5080.3Da～8367.3Da區(qū)域。在質(zhì)譜圖上，每種顏色區(qū)域是一個(gè)基因位點(diǎn)的檢測(cè)區(qū)域，根據(jù)出現(xiàn)的野生型和突變型的峰面積數(shù)據(jù)，能夠定量判讀突變比率。

圖1 前5個(gè)基因突變位點(diǎn)的質(zhì)譜圖型

圖2 后6個(gè)基因突變位點(diǎn)質(zhì)譜圖型

3.4 與一代測(cè)序結(jié)果比較

一代測(cè)序技術(shù)是熒光標(biāo)記測(cè)序法，儀器通過(guò)檢測(cè)ddNTP上的熒光來(lái)讀取所測(cè)序列，熒光染料會(huì)干擾測(cè)序引物相鄰的幾十個(gè)堿基信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法讀出序列，加之引物本身不含熒光，都是沒信號(hào)的部分，這也要求設(shè)計(jì)引物時(shí)引物序列需距檢測(cè)的目標(biāo)位點(diǎn)最少60bp以上；且測(cè)序前需純化回收PCR片段，為了保證回收效率，擴(kuò)增的PCR片段長(zhǎng)度不易低于200bp。與MassArray技術(shù)不同，引物前無(wú)需加標(biāo)簽序列，其他仍需遵循引物設(shè)計(jì)原則。兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表3，突變位點(diǎn)檢測(cè)一致率為96.4%，有2例樣本1號(hào)和2號(hào)分別在H3.3和IDH1兩個(gè)指標(biāo)檢測(cè)中結(jié)果不一致。如圖3、圖4是1號(hào)樣本兩種方法檢測(cè)結(jié)果，從質(zhì)譜圖上可見H3.3(27)這個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了A/T突變，分子量在5171.3處的T峰面積約為13，分子量5114.4處的A峰面積約為125；而圖4一代測(cè)序所示無(wú)突變。同樣圖5、圖6是2號(hào)樣本檢測(cè)結(jié)果，圖5 質(zhì)譜圖上顯示IDH1(132)位發(fā)生A/G堿基突變，A峰面積約84，G峰面積324，根據(jù)峰面積可計(jì)算突變比率；圖6箭頭所示背景峰高，無(wú)法判斷是否發(fā)生突變。表4示40例樣本在IDH1和H3.3兩個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果比較，可知MassARRAY靈敏度能達(dá)100%，與一代測(cè)序檢測(cè)的真陰性數(shù)據(jù)相比62/64，特異度約97%。造成這種差異的原因與一代測(cè)序技術(shù)靈敏度低，大于20%以上的突變才能被檢測(cè)到有關(guān)[12]。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)弱除與模板量有關(guān)，還與同一位置不同堿基信號(hào)強(qiáng)度不同有關(guān)；這會(huì)導(dǎo)致即使突變的模板所占的比例較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在。另外，測(cè)序儀軟件對(duì)掃描結(jié)果處理時(shí)，一般會(huì)將信號(hào)弱的峰做為背景信號(hào)處理，進(jìn)一步壓低弱的峰，提高主峰，因此對(duì)低含量的突變不易檢測(cè)，高含量突變檢測(cè)到也不能定量判讀。且高GC、重復(fù)序列，復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA片段對(duì)一代測(cè)序是個(gè)巨大挑戰(zhàn)，普通PCR條件很難擴(kuò)增出單一目的條帶，需利用高效熱啟動(dòng)酶，梯度PCR程序及多對(duì)引物優(yōu)化才能擴(kuò)增出目的條帶[13，14]，測(cè)序時(shí)需添加變性劑優(yōu)化測(cè)序信號(hào)。質(zhì)譜方法中因擴(kuò)增的PCR片段短，可避開一些復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；延伸引物只需延伸一個(gè)堿基后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定其分子量。另外 MassARRAY 系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯(cuò)配干擾，無(wú)需各種標(biāo)記。與芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，使得它具備高度特異性、靈敏度和高精確度[15]。能夠以快速精確的進(jìn)行基因型識(shí)別，直接測(cè)出帶有SNP 或其他突變的目標(biāo)DNA[16]。

圖3 MassARRAY檢測(cè)1號(hào)樣本H3.3-27位點(diǎn)A/T 突變

圖4 一代測(cè)序檢測(cè)1號(hào)樣本H3.3-27位點(diǎn)的結(jié)果

圖5 MassARRAY 檢測(cè)到的2號(hào)樣本IDH1-132位點(diǎn)A/G突變

圖6 一代測(cè)序檢測(cè)2號(hào)樣本IDH1-132結(jié)果

表3 MassARRAY 和一代測(cè)序?qū)?0例樣本檢測(cè)結(jié)果

表4 40例樣本IDH1和H3.3 兩種測(cè)方法比較

4 結(jié)論

目前腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)和分型，常采用的是免疫組化或一代測(cè)序方法進(jìn)行突變檢測(cè)；在臨床基因檢測(cè)方面，因多個(gè)單基因分次檢測(cè)的復(fù)雜性和穿刺等來(lái)源標(biāo)本總量不足，成為多基因同時(shí)檢測(cè)的限制因素?；诙鷾y(cè)序平臺(tái)的高通量檢測(cè)也因建庫(kù)、測(cè)序及分析等專業(yè)化及價(jià)格貴還不能普及應(yīng)用于臨床檢測(cè)。MassARRY技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增延伸反映與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，只需10ng DNA 樣本可理論上就可實(shí)現(xiàn)多達(dá)40個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)，無(wú)需熒光標(biāo)記；而一代測(cè)序需要每個(gè)基因單獨(dú)擴(kuò)增，極大增加了檢測(cè)樣本量和成本。MassARRY在定量分析基因突變檢測(cè)中檢測(cè)基因數(shù)量，除受基因分子量影響，也受PCR擴(kuò)增引物及引物增加的多個(gè)堿基前綴影響，尚需多次嘗試多對(duì)引物組合，建立合適的基因配伍檢測(cè)集合。