基于微流控驅(qū)動和控制技術(shù)的臨床生化分析系統(tǒng)研究進(jìn)展

袁穎欣,樊 晨,潘建章,方 群

(浙江大學(xué)化學(xué)系微分析系統(tǒng)研究所,浙江 杭州 310058)

臨床生化分析是基于分光光度法對血液、尿液等體液中血糖血脂、肝功、腎功、心肌酶譜等幾十項生化指標(biāo)進(jìn)行檢驗的方法。它是臨床體外診斷最為常用的方法之一,占據(jù)了體外診斷將近30%的市場。目前臨床生化分析的工作基本上在醫(yī)院中心檢驗實驗室利用自動生化分析儀開展。這些儀器需要自動實現(xiàn)樣品預(yù)處理、量取、混合反應(yīng)、檢測、清洗等一系列復(fù)雜的分析操作步驟。常規(guī)的臨床生化分析儀不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積龐大，造價高昂,而且需要專業(yè)的醫(yī)學(xué)檢驗人員操作,所以一般應(yīng)用于大中型醫(yī)院,無法覆蓋偏遠(yuǎn)地區(qū)或基層醫(yī)療機構(gòu)?；鶎俞t(yī)療對臨床生化分析儀體型精巧、低成本、易操作的要求得不到滿足,是目前醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域亟待解決的難題。

微流控技術(shù)(microfluidics)起源于1990年Manz提出的“微全分析系統(tǒng)”(miniaturized total chemical analysis systems,μTAS)概念[1],其特點是通過操控pL至μL體積的微量流體,實現(xiàn)化學(xué)或生物分析中的各項操作[2]。微流控技術(shù)的出現(xiàn)為臨床生化分析的基層普及提供了一個具有良好前景的解決方案。分析樣本和試劑消耗微量化,可有效降低分析成本,且大幅提高反應(yīng)的傳質(zhì)、傳熱能力,有助于實現(xiàn)高效反應(yīng),縮短分析時間;此外,微流控分析系統(tǒng)相較于傳統(tǒng)臨床分析儀器更易于實現(xiàn)系統(tǒng)的集成化和微型化,使其使用場合不再受限于大中型醫(yī)院,具有巨大的市場發(fā)展前景。目前,基層醫(yī)療機構(gòu)能開展的生化分析工作仍然采用試紙條技術(shù)[3-5],它利用紙纖維的毛細(xì)作用驅(qū)動樣品的流動,使樣品與預(yù)先干化的試劑反應(yīng)顯色以獲得檢測結(jié)果,具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)點。由于試紙條技術(shù)受制于簡單的流體操控能力和有限的定量檢測能力,故其應(yīng)用只限于血糖、膽固醇、蛋白質(zhì)等指標(biāo)的檢測,無法滿足臨床生化分析的多指標(biāo)和高精度需求。

圖1 (a)離心芯片單一分析單元的通道結(jié)構(gòu)、(b)分析單元在離心芯片上的布局和(c)離心芯片實物照片[26]Fig.1 (a)Channel structure of single analysis unit on the centrifugal chip,(b)layout of analysis unit in the centrifugal chip,and (c)photograph of the centrifugal chip[26] R1:reservoir for loading enzyme solution;R2:reservoir for loading inhibitor solution;R3:reservoir for loading substrate solution;C1:channel for mixing of enzyme and inhibitor solutions;C2:channel for introducing substrate solution;C3:channel for mixing of enzyme,inhibitor,and substrate solutions;V1 and V2:capillary burst valve 1 and 2.

單項指標(biāo)的臨床生化分析一般需要實現(xiàn)樣品預(yù)處理、量取、混合反應(yīng)、檢測、清洗等一系列精準(zhǔn)復(fù)雜的操作步驟,更具挑戰(zhàn)的是多數(shù)疾病的臨床診斷需要同時檢測不同指標(biāo),因此,同時實現(xiàn)多步串行流體操控和多指標(biāo)并行分析是臨床生化分析自動化的難點所在。微流控體系中所需操控的流體體積往往是nL級,甚至pL級水平,不同于一般宏觀流體,這些微流體帶有明顯的尺度效應(yīng)[6]。隨著流體體積的減小,在宏觀狀態(tài)下占主導(dǎo)地位的重力和阻力可以忽略不計,但是微流體陡增的比表面積大大增強了表面張力等表面效應(yīng)。同時,微流體存在的層流效應(yīng)也加大了流體的混合難度。液體操控方式是決定一個微流控分析系統(tǒng)整體設(shè)計的關(guān)鍵,貫穿于從樣品前處理到最終結(jié)果檢測整個分析過程的始終。因此本文根據(jù)不同微流體的驅(qū)動方式對當(dāng)前微流控生化分析系統(tǒng)進(jìn)行了分類介紹。

目前已報道的應(yīng)用于微流控生化分析系統(tǒng)的常見驅(qū)動方式包括離心驅(qū)動、電驅(qū)動、壓力驅(qū)動、毛細(xì)作用驅(qū)動,除此之外還包括磁驅(qū)動[7-9]、熱毛細(xì)遷移[10]、聲波驅(qū)動[11,12]等多種形式的驅(qū)動方式?；谇?種常見的驅(qū)動和控制方式,本文對各種基于微流控技術(shù)的臨床生化分析系統(tǒng)進(jìn)行分類介紹,同時也對市面上幾種已成功商品化的微流控生化分析儀器作詳細(xì)介紹。

1 微流控生化分析系統(tǒng)的驅(qū)動方式

1.1 離心驅(qū)動技術(shù)

離心驅(qū)動技術(shù)是通過芯片做圓周運動產(chǎn)生離心作用以驅(qū)動流體的技術(shù)。離心驅(qū)動微流控分析系統(tǒng)通常包含圓盤形離心芯片、電機和檢測裝置。試劑和樣品需預(yù)先存儲于芯片上,通過在液體通道特定位置加工憎水區(qū)域或魚骨狀通道微結(jié)構(gòu)的方法，實現(xiàn)被動突破閥的功能。分析過程中隨著芯片的加速旋轉(zhuǎn),距離芯片圓心最遠(yuǎn)的溶液首先通過突破閥進(jìn)入分析腔室,因此通過控制電機轉(zhuǎn)速可操控不同試劑依次進(jìn)入分析腔室,實現(xiàn)混合、反應(yīng)及檢測。離心驅(qū)動分析系統(tǒng)解決了微泵系統(tǒng)難以加工和集成的問題,系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單,且可在芯片上設(shè)計多個并行分析單元來提高分析通量,由單個電機驅(qū)動集成了并行分析單元的離心芯片就可實現(xiàn)微流控分析系統(tǒng)的高通量化。目前,離心芯片已廣泛應(yīng)用于核酸分析[13-15]、蛋白質(zhì)分析[16-18]、小分子分析[19-22]、細(xì)胞分析[23-25]等多種不同的分析應(yīng)用中。

1999年,Duffy等[26]首次在復(fù)合材料(聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS))制成的離心芯片(結(jié)構(gòu)見圖1)上實現(xiàn)了48種酶抑制劑的分析。R1、R2、R3是分析前預(yù)先封裝了酶、抑制劑和底物的3個腔室。首先R1中的酶與R2中的抑制劑在離心力的作用下通過毛細(xì)管突破閥V1在通道C1內(nèi)進(jìn)行混合,同時腔室R3中的底物也在離心力的作用下進(jìn)入通道C2。然后提高芯片轉(zhuǎn)速,C1中的酶-抑制劑混合物與C2中的底物通過毛細(xì)管突破閥V2在通道C3混合,最后混合物被吸收光度檢測器檢測。該分析系統(tǒng)的優(yōu)點在于結(jié)構(gòu)簡單,能實現(xiàn)多單元并行分析,不足之處在于沒有樣品分離功能,只能通過外部儀器來進(jìn)行樣品的過濾或離心操作,無法實現(xiàn)完全的系統(tǒng)一體化和集成化。

圖2 用于血漿提取和光學(xué)檢測的離心芯片結(jié)構(gòu)示意圖[27]Fig.2 Schematic of centrifugal chip for plasma extraction and optical detection[27]

Steigert等[27]報道了一種用于全血中酒精濃度檢測的離心芯片。芯片結(jié)構(gòu)如圖2所示,芯片集成了一個用于全血量取和血漿分離的腔室,該腔室連接了血液入口、溢流口和血清出口。血液樣品從入口經(jīng)離心進(jìn)入分離室后多余血液經(jīng)溢流口排出,可實現(xiàn)樣品的定量量取。提高離心轉(zhuǎn)速,可使保留的血液在離心作用下實現(xiàn)血細(xì)胞和血漿的分離,分離得到的血漿經(jīng)血清出口虹吸流出,最終經(jīng)離心進(jìn)入檢測池與同時到達(dá)的試劑發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物在芯片平面內(nèi)由吸收光度檢測器檢測。該系統(tǒng)成功應(yīng)用于全血中酒精濃度的檢測,整個分析流程在150 s內(nèi)自動完成。

Nwankire等[28]報道了一種基于PMMA材料的肝功能篩查離心芯片,可以同時檢測白蛋白、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素和直接膽紅素等5種指標(biāo)。芯片結(jié)構(gòu)如圖3所示,首先將待測血液加入到中間儲液池中,以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5 min將血液分離,然后將轉(zhuǎn)速降至1 000 r/min,將待測樣品分配至各裝有試劑的儲液池中,再以2 500 r/min和1 000 r/min的轉(zhuǎn)速反向交替旋轉(zhuǎn)15 min,將血清和各試劑混勻并反應(yīng)。最終反應(yīng)產(chǎn)物由垂直方向的吸收光度檢測器檢測。該離心平臺目前已用于南非的疾病現(xiàn)場檢測,為資源貧乏地區(qū)提供了即時有效的檢測手段。

圖3 肝功能篩查離心芯片結(jié)構(gòu)及其流體操作過程[28]Fig.3 Structure of centrifugal chip for liver function screening and its fluidic operation process[28]

Kuo等[29]發(fā)展了一種用于血液肌酐檢測的離心芯片。該芯片通過控制旋轉(zhuǎn)的速度,可精確分離出生化檢測所需的血清。芯片示意圖如圖4所示,工作時首先依靠離心力驅(qū)動全血通過長度為8 mm的直通道,接著進(jìn)入后部半徑為10 mm的圓弧形通道,血細(xì)胞靠向圓弧通道外側(cè),最終進(jìn)入血細(xì)胞液池,而血漿則繼續(xù)靠圓弧通道內(nèi)側(cè)進(jìn)入下一液池,由此完成血漿與全血分離。然后進(jìn)一步通過離心作用將血漿分成兩個等體積的部分,流入檢測室進(jìn)行肌酸酐的比色檢測。該芯片對于血細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)為6%的血液樣品,可在6 s內(nèi)獲得96%的分離效率。通過適當(dāng)控制盤旋轉(zhuǎn)速,可以精確地控制流入檢測室中樣品的體積,具有定量液體量取的能力。該芯片制作成本低,工藝簡單,且樣品消耗低。

圖4 用于全血中肌酐分析的離心芯片[29]Fig.4 Centrifugal chip for the creatinine analysis in whole blood[29]

1.2 電潤濕驅(qū)動技術(shù)

電潤濕(electro-wetting-on-dielectric,EWOD)驅(qū)動的原理是在芯片表面加工電極陣列,電極上涂覆絕緣層,將樣品溶液滴加在絕緣層表面,通過在電極兩端施加電壓從而改變固液之間的表面張力,進(jìn)而改變液體在固體表面的潤濕性。當(dāng)電極上所施加的電壓對液滴造成的不平衡力超過液滴慣性或所受阻力時,液滴會按照電壓施加的順序在各電極表面移動,從而達(dá)到對液滴操控的目的,最終通過對液滴移動的不同組合,實現(xiàn)液滴的生成、分裂、合并、移動,從而實現(xiàn)宏觀操作上的稀釋、量取、混合、分析等步驟。該技術(shù)基于液滴的形式實現(xiàn)了液體的離散化、數(shù)字化操作,由此出現(xiàn)數(shù)字微流控的概念[30-32]。

Pollack等[33]利用EWOD技術(shù)實現(xiàn)了無泵條件下納升級液滴的分散、混合、分裂和轉(zhuǎn)移操作。該芯片由兩層材料組成,上層為氧化銦錫(indium tin oxide,ITO)涂層玻璃,下層為集成了電極的芯片。上層芯片下表面和下層電極上表面都經(jīng)過疏水處理,其工作原理見圖5。當(dāng)只有左側(cè)電極通電時,液滴停留在左邊(見圖5a)。然后中間的電極通電,液滴逐漸從左邊移動到中間電極上(見圖5b)。隨后右邊的電極通電,待液滴持續(xù)移動至右邊電極后,中間的電極斷電,液滴被分裂成兩個液滴,分別停留在通電的左右兩個電極上(見圖5c和圖5d)。最后對中間的電極通電,同時對右邊的電極斷電,右邊的液滴從右邊的電極轉(zhuǎn)移至中間的電極上,最終與左邊的電極融合在一起,合并成同一個液滴(見圖5e和圖5f)。液滴的平均轉(zhuǎn)移速度是10 cm/s。該方法具有高度集成性,同時操作簡單靈活,已成為微流控分析中最靈活的流體操控方式之一。在后續(xù)的研究中,該研究組成功將此技術(shù)應(yīng)用于人胰島素免疫分析中[34]。

圖5 電潤濕滴液的合并分裂過程[33]Fig.5 Process of electro-wetting-on-dielectric (EWOD)droplet merging and splitting[33] a.droplet formation by energizing the left electrode;b.droplet deformation by energizing the left and middle electrodes;c and d.droplets splitting by switching the voltage from the middle electrode to the right one;e and f.droplets reassembling by switching the voltage from the right electrode back to the middle one.

Srinivasan等[35]報道了一種可以檢測血清中葡萄糖的電潤濕液滴分析平臺。如圖6所示,該電潤濕系統(tǒng)包括加工了電極陣列的透明ITO玻璃和發(fā)光二極管(light emitting diode,LED)光源及光電二極管檢測器。ITO玻璃表面由特氟龍(teflon)薄層覆蓋做疏水化和絕緣處理。樣品與試劑提前存放在芯片的儲液區(qū)域中,通過不同電極順序施加電壓而改變電極表面的浸潤狀態(tài),從而驅(qū)動液滴從疏水電極表面向親水電極表面移動,樣品與試劑以液滴的形式自動從儲液區(qū)域量取出來,完成試劑的分配、混合、反應(yīng)等操作,最終將反應(yīng)后的混合液滴移動到檢測區(qū)域進(jìn)行吸光度檢測。該工作成功利用電潤濕技術(shù)在芯片上實現(xiàn)了全血、血清、尿液等不同類型樣品中葡萄糖的檢測。

圖6 集成了吸光度檢測裝置的電潤濕芯片示意圖[35]Fig.6 Schematic of EWODchip with optical absorbance detection[35]

Sista等[36]報道了一種能應(yīng)用于磁珠免疫分析和實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)分析的數(shù)字微流控系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一個通用試劑盒和一個控制系統(tǒng),芯片結(jié)構(gòu)見圖7。磁珠免疫分析原理如下:磁珠懸液先與一抗溶液混合形成混合物液滴,然后再依次與全血樣品、二抗溶液混合反應(yīng),反應(yīng)后液滴被驅(qū)動到磁鐵區(qū)域,磁珠通過磁場從混合物液滴中被分離出來,混合物液滴除磁珠外的溶液被驅(qū)動到廢液池,接著清洗液被驅(qū)動到磁鐵區(qū)域,對固定的磁珠進(jìn)行清洗后被驅(qū)動至廢液池,最后將化學(xué)發(fā)光底物驅(qū)動至磁珠位置反應(yīng)2 min,然后驅(qū)動到檢測區(qū),其化學(xué)發(fā)光信號由光電倍增管檢測。實時熒光PCR分析原理如下:DNA樣品和反應(yīng)試劑預(yù)先裝載于儲液池中,分析過程中樣品和試劑被量取并以液滴形式混合,混合物液滴在60 ℃和95 ℃兩個溫區(qū)間往復(fù)運動進(jìn)行PCR擴增,在每次循環(huán)后,在60 ℃溫區(qū)用熒光檢測器實時檢測。該系統(tǒng)的優(yōu)點是通用性強,儀器小巧,是進(jìn)行床旁檢測(point-of-care testing,POCT)的理想選擇。

圖7 數(shù)字微流控多孔板試劑盒及其控制裝置[36]Fig.7 Digital microfluidic multiwell plate cartridge and control instrument[36]

Mousa等[37]報道了一種基于微流控電潤濕技術(shù)的自動血液雌激素提取系統(tǒng),系統(tǒng)原理見圖8。實驗中,樣品和試劑以液滴的形式儲存在芯片中,首先以液滴形式驅(qū)動細(xì)胞裂解液和血樣混合,完成細(xì)胞的破碎,裂解后的混合物和極性萃取劑甲醇液滴混合,然后驅(qū)動該液滴和非極性萃取劑異辛烷混合實現(xiàn)換相,最后驅(qū)動異辛烷萃取液至樣品收集池中完成雌激素雌二醇(雌激素最具生物活性形式)的提取。

圖8 數(shù)字微流控雌激素提取芯片原理示意圖[37]Fig.8 Schematic of digital microfluidic chip for estrogen extraction[37]

Mei等[38]報道了一種利用電潤濕技術(shù)捕獲人體血漿蛋白的方法,原理見圖9。該系統(tǒng)通過簡單的液滴混合和磁珠分離在電潤濕芯片上完成了自動化蛋白質(zhì)的提取。首先系統(tǒng)將蛋白質(zhì)樣品加入到包含有偶聯(lián)了抗人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、鏈球菌G蛋白和金黃色葡萄球菌A蛋白的磁珠中并進(jìn)行混合,隨后混合溶液通過底部固定了條形三棱柱磁鐵的電極區(qū)域,將液滴中的磁珠捕獲在電極表面,溶液則通過電潤濕技術(shù)進(jìn)一步移動到廢液區(qū),最后驅(qū)動清洗液實現(xiàn)對捕獲蛋白質(zhì)的洗脫。由于采用了條形磁鐵和并行分析的策略,該系統(tǒng)在10 min內(nèi)可同時處理4個樣品,且對免疫球蛋白(immunoglobulin,IgG)和HSA的提取效率可達(dá)95%以上。

圖9 用于血漿蛋白分離的電潤濕裝置原理圖[38]Fig.9 Schematic of EWOD device for human plasma protein separation[38]

1.3 壓力驅(qū)動技術(shù)

壓力驅(qū)動是通過在通道出入口間施加壓力差來驅(qū)動和控制流體的方法,是微流控分析中應(yīng)用最為廣泛的流體驅(qū)動方式,其壓力源可以是常規(guī)的注射泵、真空泵,也可以是壓電晶體泵、氣動微泵、電解泵、化學(xué)分解泵等集成式微泵。集成式微泵流速穩(wěn)定性和流量準(zhǔn)確性較低,難以精確量取液體體積,所以通常需要在芯片生產(chǎn)階段預(yù)先將液體試劑定量儲存于芯片上,在分析過程中只需驅(qū)動其進(jìn)入特定腔室實現(xiàn)反應(yīng)即可。

Quake研究組[39]首次報道了基于軟光刻技術(shù)的多層氣動微泵閥芯片,其結(jié)構(gòu)見圖10。微泵由上下垂直交叉的兩層微通道疊加而成,兩層微通道間由PDMS彈性薄膜間隔。上層3個通道為“控制通道”,氣體經(jīng)此通過并對下方通道形成氣壓,下方為“流體通道”,被控流體經(jīng)此通過。當(dāng)足夠的氣壓被施加到控制通道時,上下通道之間的薄膜會向下形變,直至阻斷下層流體前進(jìn)的方向。通過外部程序控制3個氣體通道的氣壓可以實現(xiàn)對流體流向的操控,實現(xiàn)泵送流體的功能。該系統(tǒng)可以完成對流體的復(fù)雜操控,是構(gòu)建微流控集成式微泵微閥的典型技術(shù)。該研究組將其應(yīng)用于C反應(yīng)蛋白、前列腺特異性抗原、鐵蛋白、血管內(nèi)皮生長因子等多種生化指標(biāo)的同步分析中[40],但是該技術(shù)需要外圍氣源和復(fù)雜的控制設(shè)備[41],且系統(tǒng)的氣密性對可靠性的影響至關(guān)重要,加上芯片生產(chǎn)成本較高,因此在對可靠性要求高且對價格敏感的臨床生化分析領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。

圖10 氣動微泵的結(jié)構(gòu)示意圖[39]Fig.10 Schematic diagram of a pneumatic micropump[39]

Munyan等[42]報道了一種利用電解溶液產(chǎn)生的氣體形成壓力而驅(qū)動液體的電解泵,其結(jié)構(gòu)見圖11。首先打開密封蓋(SC),在電解室(EC)內(nèi)加入150 μL的0.1 mol/L硝酸鉀溶液,然后蓋上密封蓋。電解室通過上方連接管(CT)與通道(C)內(nèi)的流體(F)相通。當(dāng)程序啟動時,電壓被施加在電解室使溶液電解,電解產(chǎn)生的氣體驅(qū)動F進(jìn)入C最終達(dá)到出口。在10 V電壓的條件下,水被驅(qū)動通過通道的流速是8 μL/min,電解室的最大壓強可達(dá)到約300 kPa。該微泵不僅成本低廉,易集成,而且可重復(fù)利用,但缺點是對流速的控制不能穩(wěn)定精確。上述基于電化學(xué)原理的微泵已被成功應(yīng)用于酶分析實驗中[43]。

圖11 連接通道的微泵示意圖[42]Fig.11 Schematic drawing of a micropump attached to a channel[42] a.side view of the device;b.top view of the device;c.photograph of an assembled micropump and microchannel. EL:electrodes;EC:electrolyte chamber;F:fluid to be pumped;C:channel;SC:snugly fitting cap on the electrolyte chamber;P:pump;CH:channel substrate;CT:connection tube.

Do等[44]提出了一種熱氣動驅(qū)動的芯片,芯片結(jié)構(gòu)見圖12。整個芯片分為5層,第一層和第四層構(gòu)成微流體通道,第二層芯片為生物傳感器,并與第三層和第五層形成儲液池。試劑先封裝在儲液池中,加熱偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile,AIBN)，分解產(chǎn)生N2,通過提供不同的加熱程序,例如通過控制電流強度和加熱時間,可以控制N2的釋放,最終實現(xiàn)精確操縱微流體的功能。生物傳感器陣列是整個芯片的關(guān)鍵組成部分,所有電化學(xué)反應(yīng)都發(fā)生在傳感器表面,并進(jìn)行測量,由檢測電路收集和處理數(shù)據(jù)。該方法需精確控制氣體生成的速率來實現(xiàn)對氣動微閥的控制,同時需要與液體反應(yīng)速度一致,否則容易產(chǎn)生溶液殘留的現(xiàn)象。

圖12 基于氣體驅(qū)動的微流控芯片示意圖[44]Fig.12 Schematic diagram of a microfluidic chip based on pressure driven[44]

作者研究組于2013年發(fā)展了一種全自動序控液滴陣列(sequential operation droplet array,SODA)系統(tǒng)[45]。SODA系統(tǒng)通過三維平移臺的移動來控制開放式平面芯片,配合注射泵驅(qū)動毛細(xì)管探針進(jìn)行液體吸打操作,從而實現(xiàn)對pL至nL級液滴的組裝、生成、轉(zhuǎn)移、分裂、融合等復(fù)雜液體操控。目前,該系統(tǒng)已被成功應(yīng)用于高通量篩選和細(xì)胞分析,具有結(jié)構(gòu)簡單、操作靈活、通用性強等特點。作者基于SODA系統(tǒng),結(jié)合在線吸光度檢測技術(shù),研制了自動生化分析系統(tǒng)[46],其核心結(jié)構(gòu)見圖13。該系統(tǒng)由注射泵、毛細(xì)管探針、吸光度檢測器、三維平移臺、液滴陣列芯片、恒溫加熱器等部分構(gòu)成。試劑和樣品預(yù)先裝載于微型離心管內(nèi)，裝載離心管的樣品架和液滴陣列芯片固定于三維平移臺上。三維平移臺帶動樣品架與芯片實現(xiàn)移動定位，同時配合注射泵驅(qū)動的毛細(xì)管探針定量吸取任意位置的樣品及試劑，然后將混合溶液在液滴陣列芯片上的指定位置泵出,從而形成反應(yīng)液滴,通過不斷重復(fù)此過程，最終在芯片上生成包含多指標(biāo)生化反應(yīng)的二維液滴陣列,生化反應(yīng)的溫度由芯片底部的恒溫加熱器控制,芯片表面預(yù)先覆蓋油層以防止液滴蒸發(fā)。最終反應(yīng)產(chǎn)物由毛細(xì)管探針吸回到毛細(xì)管,由集成在毛細(xì)管上的吸收光度檢測器進(jìn)行實時檢測。該系統(tǒng)已被成功應(yīng)用于血清中包括血糖、血脂、肝功能、心功能相關(guān)的15項生化指標(biāo)的檢測。

圖13 基于序控液滴陣列系統(tǒng)的自動生化分析系統(tǒng)[46]Fig.13 Automatic biochemical analysis system based on sequential operation droplet array (SODA)system[46]

1.4 毛細(xì)作用驅(qū)動技術(shù)

毛細(xì)現(xiàn)象在自然界中普遍存在,是指浸潤液體在毛細(xì)管內(nèi)升高的現(xiàn)象。紙張具有中空親水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可以引導(dǎo)液體流動,是基于毛細(xì)作用驅(qū)動的微流控芯片最常用的材料。基于側(cè)向?qū)游龇治?lateral flow assays,LFAs)的試紙條技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的紙基POCT分析技術(shù),常規(guī)的試紙條技術(shù)通常是基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化以實現(xiàn)分析的目的。試紙條技術(shù)最早可追溯至17世紀(jì)出現(xiàn)的酸堿試紙——石蕊試紙。1949年,Müller和Clegg[47]用石蠟浸漬紙片形成通道,制成了基于紙基的薄層色譜,此后以紙為載體的分析設(shè)備層出不窮,其中最具代表性的當(dāng)屬驗孕棒和糖尿分析試紙。此類試紙因其操作簡單、價格低廉、分析過程快速便捷而廣受認(rèn)可。但是,靈敏度低、難以定量、不適用于多步驟分析的缺點限制了其進(jìn)一步發(fā)展[48]。

基于毛細(xì)原理,在微流控領(lǐng)域中發(fā)展出了紙芯片技術(shù)(microfluidic paper-based analytical devices,μPADs),通過在紙基材料上處理、加工形成具有微通道和反應(yīng)室的紙芯片可實現(xiàn)類似于微通道芯片的功能。紙芯片基材來源豐富，可降解,可以代替硅、玻璃、有機聚合物等材料,具有成本低廉、使用方便、易于集成、無需外設(shè)等優(yōu)點。紙芯片的產(chǎn)生在某種程度上彌補了試紙條技術(shù)的不足,使低成本、低耗樣、便捷化定量分析成為可能[49-52]。2007年,Whitesides研究組[53]用光刻法制作紙芯片通道。2008年,Martinez等[54]將芯片與手機等移動設(shè)備結(jié)合,實現(xiàn)了遠(yuǎn)程實時診斷,并通過將多層平面紙芯片疊加后固定,制作成3D紙芯片,用于多指標(biāo)并行檢測。Henry等[55]提出將電化學(xué)檢測法應(yīng)用到紙芯片中,相對于之前常用的比色法,提高了檢測靈敏度。隨后,Lu等[56]和Whitesides研究組[57]相繼報道使用石蠟制作紙芯片通道,目前石蠟打印法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究中。

Cardoso等[58]報道了一種用于葡萄糖和蛋白質(zhì)檢測的紙芯片。芯片原理如圖14所示,芯片尺寸為45 mm×45 mm,外圍8個放射狀分支連接到共同的中心區(qū)域,外圍區(qū)域預(yù)先干化固定了不同的檢測試劑,在中心區(qū)域滴加樣品后,由于紙表面的親水性,樣品可以通過石蠟屏障形成的親水通道向外流動到不同檢測區(qū),和預(yù)先干化的試劑反應(yīng)而實現(xiàn)顯色檢測。該紙芯片可在7.5 min內(nèi)實現(xiàn)20個不同樣品的快速檢測。

圖14 用于多指標(biāo)檢測的紙芯片[58]Fig.14 Paper-based chip for multi-target detection[58]

圖15 電化學(xué)傳感紙芯片示意圖[59]Fig.15 Schematic diagram of electrochemical sensing paper-based chip[59] ITO:indium tin oxide;PB:prussian blue;PW:prussian white;GOx:glucose oxidase;HRP:horseradish peroxidase.

2 商品化微型生化分析儀

世界上第一臺商品化自動生化分析儀是1957年由美國泰爾康(technicon instruments)公司制造的連續(xù)流動式單通道分析儀,所有的化學(xué)反應(yīng)和測定均在管道的液流中完成。早期的分析儀只能檢測尿素氮和血液中的葡萄糖兩個指標(biāo)。之后,泰爾康公司研制出多通道、可同時檢測多個指標(biāo)的生化分析儀。在20世紀(jì)70年代中后期,泰爾康公司研制出了連續(xù)流動式生化分析儀,結(jié)合計算機控制技術(shù)每小時可檢測多達(dá)150個樣本,單個樣本可檢測20個指標(biāo)。發(fā)展至今,大型全自動生化分析儀已經(jīng)代替了手動檢測和半自動檢測。目前,生化分析儀國外知名廠商主要有貝克曼、日立、東芝、羅氏等公司,國產(chǎn)廠商代表主要有迪瑞、邁瑞、科華等。這些大中型的自動生化分析儀結(jié)構(gòu)復(fù)雜,造價高昂。在日門診量很高的大中型醫(yī)院,往往通過提升大批量樣本的分析速度來降低單個生化分析的成本,因此不適用于社區(qū)醫(yī)院和診所等每日患者人數(shù)較少的基層醫(yī)療機構(gòu)。

Alere Afinion AS100生化分析儀是美艾利爾(Alere)公司推出的面向POCT應(yīng)用的微型生化分析儀,可用于全血、血漿或尿液等樣本中糖化血紅蛋白等多個指標(biāo)的快速定量分析,儀器和配套檢測卡盒見圖16。該儀器配套的檢測卡盒不僅集成了樣本采集裝置,而且預(yù)封裝了完成單次分析所需的全部試劑[60]。首先通過檢測卡盒中的毛細(xì)管探針吸取血液樣品并加入試劑盒后,將卡盒插入分析儀。樣品與預(yù)先存放在卡盒內(nèi)的試劑發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)完成后,LED光線通過檢測區(qū)域進(jìn)行吸光度檢測,最后檢測結(jié)果可直接顯示在分析儀屏幕上。目前,該測試平臺可以在4 min內(nèi)完成多個不同項目的測試。除了糖化血紅蛋白,還可以進(jìn)行尿白蛋白/肌酐比值的檢測,以篩查早期的腎臟疾病;也可以通過對C反應(yīng)蛋白的檢測,區(qū)分細(xì)菌性與病毒性感染,并確定是否應(yīng)進(jìn)行抗生素治療;還可以進(jìn)行血脂檢測,用于心血管疾病風(fēng)險的評估監(jiān)測[61,62]。該分析儀試劑盒內(nèi)每個分析單元體積較大,無法應(yīng)用于多個指標(biāo)的同時分析,檢測指標(biāo)較為單一,面向的是只需獲得單一檢測指標(biāo)即具有臨床診斷意義的分析場合,因此不能涵蓋全面的生化分析需求。

圖16 Alere-Afinion生化分析儀和檢測卡盒[60]Fig.16 Alere-Afinion biochemical analyzer and test kits[60]

美國Abaxis公司研制推出了基于離心驅(qū)動原理的Piccolo Xpress生化分析儀(http://www.abaxis.com)。整套生化分析系統(tǒng)由一次性離心芯片和分析儀兩部分構(gòu)成,離心芯片中從上游到下游依次集成了全血中血漿分離、血漿定量稀釋、血漿分配、血漿和試劑反應(yīng)及檢測室等流體操作單元。分析儀集成了反應(yīng)溫度控制模塊、吸收光度檢測模塊、離心驅(qū)動模塊和電子控制模塊等。分析流程及各步操作后的液體狀態(tài)如圖17所示:在離心芯片中心入口加入血液樣品,待血液流入血漿分離室后以3 000 r/min的速度旋轉(zhuǎn)40 s分離出血漿(見圖17a);提高離心轉(zhuǎn)速,將血漿驅(qū)動到稀釋液池,交替正反轉(zhuǎn)離心使得血漿和預(yù)先儲存在液池內(nèi)的稀釋液混合均勻(見圖17b);進(jìn)一步提高離心轉(zhuǎn)速,將稀釋后的血漿驅(qū)動到芯片外圍裝有凍干粉試劑的各反應(yīng)室中進(jìn)行反應(yīng),多余的血漿在裝滿各反應(yīng)腔后自動溢出到尾部溢流通道(見圖17c)。反應(yīng)完畢后通過檢測反應(yīng)腔內(nèi)溶液的吸光度來確定樣品中各對應(yīng)指標(biāo)的含量(見圖17d)。Piccolo生化分析儀質(zhì)量為5 kg,有16種離心芯片,檢測所需血液樣品體積為0.1 mL,檢測時長為12 min。目前,該儀器可檢測血糖血脂、肝功、腎功、心肌酶等30種生化指標(biāo)。我國天津微納芯科技有限公司也推出了基于離心工作原理的生化分析儀Pointcare(http://www.mnchip.com),儀器配套的一次性使用芯片集成了10余項檢測指標(biāo),所需血液樣品體積僅為0.1 mL,檢測時長為10 min。目前,Pointcare可用于包括肝腎及胰腺功能指標(biāo)、血脂、血糖及電解質(zhì)指標(biāo)等在內(nèi)的32個項目的檢測。

圖17 Piccolo生化分析儀及離心芯片F(xiàn)ig.17 Piccolo biochemical analyzer and centrifugal chips a.blood entering the plasma metering chamber;b.the mixing of the plasma and the diluent;c.the distribution of diluted plasma to the cuvettes containing reagents;d.the optical detection of the cuvettes.

得益于離心芯片并行多指標(biāo)分析的特點,該類生化分析儀的多指標(biāo)檢測能力可與大型生化分析儀相媲美。但單個樣本的檢測成本受芯片成本的限制仍舊比較高,目前離心生化分析儀的主要優(yōu)勢是儀器體積小巧且試劑盒芯片完全集成在一次性的芯片內(nèi),對操作者的要求較低,目前主要應(yīng)用于寵物醫(yī)療市場。

圖18 利德曼用于床旁檢測的Innovastar生化分析儀Fig.18 Leadman Innovastar biochemical analyzer for point-of-care testing

北京利德曼生化股份有限公司推出了微型Innovastar POCT生化分析儀(http://www.leadmanbio.com)。儀器和試劑盒如圖18所示,儀器體積僅為20 cm×15 cm×17 cm,重量為4 kg。該儀器屬于半自動生化分析儀,需要手動量取和加入樣品。使用毛細(xì)管手動吸取10 μL血液樣品放入離心管稀釋,與檢測試劑一同放入儀器內(nèi),儀器通過類似于液體工作站的吸液和移液操作實現(xiàn)生化分析過程中的流體操控過程,反應(yīng)溫度控制在37 ℃,最后進(jìn)行吸光度檢測,檢測結(jié)果直接顯示在液晶屏上,也可直接打印。目前單個10 μL樣品可同時檢測4個項目:糖化血紅蛋白A1c、血糖、血紅蛋白和C反應(yīng)蛋白。該試劑盒設(shè)計均基于孔板的形式,易于實現(xiàn)后續(xù)檢測項目菜單的擴展。但單個孔板并行分析能力受限于孔板上的孔位數(shù),故難以用于超過孔板孔位數(shù)的多指標(biāo)臨床生化分析。

3 結(jié)論

微流控技術(shù)中多種流體的操控和檢測技術(shù)為低成本、自動化的并行分析提供了多種可行的方案。離心驅(qū)動操作簡便,芯片上能實現(xiàn)多指標(biāo)試劑的預(yù)封裝。是目前唯一商品化能實現(xiàn)多指標(biāo)生化分析的平臺,但目前在應(yīng)用中一次性使用的離心芯片成本仍然過高,限制了其在基層醫(yī)療機構(gòu)的推廣應(yīng)用。電潤濕操縱靈活,但難以實現(xiàn)試劑預(yù)封裝,多指標(biāo)試劑在分析時需要手工裝載是限制其發(fā)展的重要原因,且目前芯片成本也較高,有待進(jìn)一步降低。集成式壓力驅(qū)動系統(tǒng)成本較高,配合電化學(xué)傳感器可應(yīng)用于血液中電解質(zhì)的測定，尚難以實現(xiàn)多指標(biāo)常規(guī)生化分析的集成。商品化基于注射泵的微型生化分析儀的檢測指標(biāo)只有幾項,基于多聯(lián)管的試劑預(yù)封裝形式和較大的樣品及試劑消耗量決定了其難以真正實現(xiàn)多指標(biāo)檢測。紙芯片技術(shù)可被動實現(xiàn)多通道的并行分析且成本低廉,但受限于其紙基材料的異質(zhì)性,檢測難以實現(xiàn)真正定量。上述技術(shù)從不同角度為低成本臨床生化分析提供了可行的思路,具有巨大研究前景和市場價值。從應(yīng)用方面來看,微流控技術(shù)在免疫和核酸分析中已獲得比較成功的應(yīng)用,但商品化的儀器并不多，原因在于相較于小分子分析,免疫和核酸分析反應(yīng)步驟繁瑣,芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜,大幅提升了分析成本;同時應(yīng)用于核酸分析的芯片還需具備加熱部件,進(jìn)一步加大了實現(xiàn)系統(tǒng)微型化和集成化的難度。雖然目前一些微流控生化分析儀已經(jīng)面世,但不論從儀器價格上還是一次性芯片測試成本上均和基層醫(yī)療目標(biāo)市場存在較大差距,因此難以實現(xiàn)推廣,故適用于社區(qū)醫(yī)院、農(nóng)村診所的成本生化分析儀具有很大的發(fā)展?jié)摿推惹械膽?yīng)用需求,相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步,微流控低成本生化分析儀必將迎來其廣闊的市場。