網(wǎng)購(gòu)流通過(guò)程中大眼金槍魚鮮度指標(biāo)和生物胺的變化研究

李少麗，李來(lái)好，楊賢慶，鄧建朝*，陳勝軍，李春生，胡曉，戚勃

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

大眼金槍魚(Thunnusobesus) 又名肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋和太平洋等海域[1-3]。金槍魚肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有大量的DHA和EPA等不飽和脂肪酸[4]，食用和商用價(jià)值極高。據(jù)最新國(guó)際漁業(yè)動(dòng)態(tài)報(bào)道[5],金槍魚類市場(chǎng)不僅魚價(jià)指數(shù)近年來(lái)持續(xù)增長(zhǎng)，捕撈水平也在持續(xù)升高。

金槍魚的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量極高[4]，因此金槍魚在存放過(guò)程中極易出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。目前對(duì)金槍魚新鮮度的判斷，主要集中在pH值、TVB-N、菌落總數(shù)以及K值等鮮度指標(biāo)。但在金槍魚腐敗過(guò)程中，生物胺也對(duì)魚肉品質(zhì)產(chǎn)生了極大影響，甚至還會(huì)引起食物中毒，一些國(guó)家已經(jīng)制定了生物胺限定標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)金槍魚新鮮度的判斷，應(yīng)將其考慮在內(nèi)。

近年來(lái)，電商的迅速發(fā)展使線上購(gòu)買金槍魚成為可能，但在流通過(guò)程中，金槍魚的貯藏溫度往往得不到有效控制，有時(shí)甚至接近室溫，其品質(zhì)保障存在一定隱患。為研究大眼金槍魚在網(wǎng)購(gòu)流通過(guò)程中的品質(zhì)變化，研究選取了0、4、15和25 ℃作為流通條件來(lái)測(cè)定大眼金槍魚在運(yùn)輸過(guò)程中的鮮度指標(biāo)和8種生物胺在不同溫度下的變化規(guī)律，最后將鮮度指標(biāo)和生物胺之間的相關(guān)性進(jìn)行了系統(tǒng)分析和回歸方程分析，得出各溫度下的最優(yōu)貨架期，以期為網(wǎng)購(gòu)流通過(guò)程中大眼金槍魚的保鮮和品質(zhì)保障提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚，購(gòu)自廣州金槍魚專賣店。所購(gòu)金槍魚由廣州市沛洋食品有限公司于2019年6月捕撈于太平洋近海，船上屠宰冷凍后直接抽真空凍藏于-60 ℃條件下，通過(guò)背景生物胺的檢測(cè)，初始狀態(tài)組胺濃度為“未檢出”。將買回的大眼金槍魚在無(wú)菌環(huán)境下等質(zhì)量切割，分裝在自封袋中(該過(guò)程在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，提前將工具進(jìn)行30 min紫外滅菌)。

色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺及丹磺酰氯(純度≥98 %)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。高氯酸、鹽酸、丙酮、甲基紅及碳酸氫鈉等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣州市普博儀器有限公司。乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100液相色譜儀(美國(guó) Agilent 公司)；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；MILLI-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；超高能量研磨儀(上海萬(wàn)柏生物科技有限公司)；PB-10精密pH測(cè)試儀(德國(guó)Sartorius公司)；全自動(dòng)凱氏定氮儀(丹麥FOSS公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；0.22 μm針頭微孔濾膜一次性過(guò)濾器(天津市精拓儀器科技有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械有限公司)；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；明鑒SPX型智能生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將分割好的大眼金槍魚魚塊裝入自封袋，為模擬網(wǎng)購(gòu)流通過(guò)程中的貯藏溫度，選取0、4、15和25 ℃條件下貯藏魚肉，分別間隔2d、1d、12h、8h取樣5 g，檢測(cè)大眼金槍魚pH值、TVB-N、菌落總數(shù)、K值以及生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺)的含量。

1.3.2 pH值的測(cè)定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[6]對(duì)大眼金槍魚魚肉進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 TVB-N的測(cè)定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[7]，采用自動(dòng)凱氏定氮儀法進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定。

1.3.4 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[8]測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.5 K值的測(cè)定

參考SC/T 3048—2014《魚類鮮度指標(biāo)K值的測(cè)定 高效液相色譜法》進(jìn)行K值測(cè)定[9]，K值計(jì)算公式如下：

式(1)

式中：ATP(adenosine triphosphate)為腺苷三磷酸、ADP(adenosine diphosphate)為腺苷二磷酸、AMP(adenosine monophosphate)為腺苷酸、IMP(inosinic acid)為肌苷酸、HxR(inosine)為次黃嘌呤核苷、Hx(hypoxanthine)為次黃嘌呤。各數(shù)據(jù)單位為μmol/g。

1.3.6 生物胺的測(cè)定

參考GB 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》[10]方法測(cè)定，前處理采用經(jīng)優(yōu)化過(guò)后的超聲萃取的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖，采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性和Duncan’s相關(guān)性分析，分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下大眼金槍魚pH的變化

pH在一定程度上可以用來(lái)評(píng)價(jià)肉類的新鮮程度[11]，大眼金槍魚肉在0、4、15和25 ℃貯藏期間pH變化如圖1所示。4個(gè)溫度條件下貯藏魚肉的pH值變化趨勢(shì)相似，呈先下降后上升的趨勢(shì)，0 ℃時(shí)先下降到5.71，最終上升到6.56；4 ℃時(shí)下降到5.99，最終上升到6.36，15 ℃時(shí)下降到6.19，最終上升到6.64；25 ℃時(shí)下降到6.12，最終上升到6.71。原因在于貯藏初期，魚體內(nèi)的糖原和ATP會(huì)分解產(chǎn)生乳酸和磷酸，使魚肉組織的pH下降，酸性增強(qiáng)[12]。而后pH的上升是由于魚體經(jīng)過(guò)僵直階段之后，體內(nèi)水解酶(特別是蛋白酶)和細(xì)菌的相關(guān)酶[13]會(huì)將含氮物質(zhì)分解為氨基酸和低分子量有機(jī)堿[14]，同時(shí)魚肉的品質(zhì)也在持續(xù)下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Ezati等[15]的研究相似。但僅根據(jù)pH來(lái)判斷網(wǎng)購(gòu)大眼金槍魚可否生食還存在不確定性，需要結(jié)合多個(gè)指標(biāo)來(lái)綜合分析判斷。

圖1 不同貯藏溫度下大眼金槍魚pH隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of pH during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.2 不同貯藏溫度下大眼金槍魚TVB-N的變化

貯藏過(guò)程中，魚肉中的蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下被降解為氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)，再與有機(jī)酸結(jié)合生成揮發(fā)性的鹽基態(tài)氮，TVB-N可作為魚類貯藏初期的鮮度指標(biāo)[16]。由圖2可知TVB-N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且溫度越高，增長(zhǎng)速度越快，這與微生物的數(shù)量和貯藏的溫度密切相關(guān)[17]。0 ℃貯藏條件下TVB-N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)最為緩慢，貯藏初期的魚肉中微生物含量低，品質(zhì)損失主要是由于自身蛋白酶的作用[18]，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物大量繁殖，胞外蛋白酶的數(shù)量增多，在酶的作用下，蛋白質(zhì)被大量分解，TVB-N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之快速增加，第8天超過(guò)了生食金槍魚標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的250 mg/kg[19]，達(dá)到了258.67 mg/kg。隨著溫度的升高，4 ℃條件下在第6天就達(dá)到了281.80 mg/kg，15 ℃時(shí)在第48 h達(dá)到了295.36 mg/kg，25 ℃條件下微生物和酶的活性最高，TVB-N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)最為迅速，32 h就已超出金槍魚生食標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到了264.70 mg/kg。由此可知，網(wǎng)購(gòu)大眼金槍魚在運(yùn)輸過(guò)程中須保證低溫，且盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，從而減少TVB-N的產(chǎn)生，保障魚肉品質(zhì)。

圖2 不同貯藏溫度下大眼金槍魚TVB-N隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.2 Changes of TVB-N during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.3 不同貯藏溫度下大眼金槍魚菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)作為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的重要指標(biāo)，在研究水產(chǎn)品鮮度變化時(shí)是必不可少的。大眼金槍魚在0、4、15以及25 ℃貯藏條件下貯藏期間菌落總數(shù)的變化如圖3所示。相同溫度下，菌落總數(shù)含量的增長(zhǎng)趨勢(shì)較為穩(wěn)定，隨著溫度的升高，在相對(duì)適宜的環(huán)境中，細(xì)菌繁殖速度加快。0 ℃條件下，金槍魚的菌落總數(shù)在第4天超過(guò)了生食金槍魚行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的4.0 lg(CFU/g)，達(dá)到了4.91 lg(CFU/g)。4 ℃條件下第2天超標(biāo)，達(dá)到了4.40 lg(CFU/g)。15 ℃和25 ℃條件下，分別在12 h和8 h達(dá)到了4.29 lg(CFU/g)和4.30 lg(CFU/g)。

圖3 不同貯藏溫度下大眼金槍魚菌落總數(shù)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.3 Changes of aerobic plate count during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.4 不同貯藏溫度下大眼金槍魚K值的變化

早在1959年Saito等[20]就認(rèn)為K值可作為水產(chǎn)品加工原料的鮮度指標(biāo)，魚類死后，ATP會(huì)依次降解為ADP、AMP、IMP、HxR及Hx。大眼金槍魚在不同貯藏溫度和不同時(shí)間K值變化趨勢(shì)如圖4所示。在0、4、15和25 ℃貯藏條件下，大眼金槍魚K值呈上升趨勢(shì)。0 ℃貯藏過(guò)程中K值增長(zhǎng)速度最為緩慢(3.53%/d，r2=0.99)，在第2天K值超過(guò)20%，不能用于制作生魚片[21]。在4 ℃貯藏條件下K值增長(zhǎng)速度增高(7.33%/d，r2=0.97)，魚肉可生食期為1天，K值為19.86%。15 ℃條件下K值增長(zhǎng)速率明顯加快(20.25%/d，r2=0.99)，可生食期僅為12 h。25 ℃條件下K值增長(zhǎng)速率最快(35.48%/d，r2=0.99)，可生食期僅為8 h，K值就超過(guò)了20%。該結(jié)果與汪蘭等[21]對(duì)鱸(Lateolabraxjaponicus)的研究結(jié)果一致。不同溫度下K值的增長(zhǎng)差異說(shuō)明了溫度影響酶活，進(jìn)而影響了ATP的降解，因此網(wǎng)購(gòu)生食金槍魚需要加強(qiáng)其在流通過(guò)程中對(duì)溫度的控制。

圖4 不同貯藏溫度下大眼金槍魚K值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.4 Changes of K value during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.5 不同貯藏溫度下大眼金槍魚生物胺的變化

生物胺是具有生物活性的低分子量有機(jī)堿，在新鮮魚體中主要是由自身的氨基酸脫羧酶對(duì)自身前體氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生[24]，增長(zhǎng)緩慢，隨著魚體死亡，魚肉中的微生物大量生長(zhǎng)[25]，生物胺的含量增長(zhǎng)迅速。由圖5可知，不同貯藏溫度下，生物胺的變化也有所不同。組胺在不同貯藏溫度下均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)且增長(zhǎng)速率要遠(yuǎn)高于其他生物胺，原因是組氨酸在金槍魚中的含量較高[26]，從而導(dǎo)致組胺生成量較多，0、4、15和25 ℃貯藏過(guò)程中，分別在第8天，第4天，第12 h和第8 h超過(guò)了SC/T 3117—2006所規(guī)定的90 mg/kg，達(dá)到了94.78 mg/kg、136.24 mg/kg、91.98 mg/kg和92.54 mg/kg，不可生食。但根據(jù)Guizani等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，黃鰭金槍魚(Thunnusalbacores)在0 ℃貯藏條件下魚肉中的組胺含量有降低的趨勢(shì)，可能是由于魚的種類以及魚肉中存在組胺降解菌的原因[27]，具體因素還需要進(jìn)一步探究。尸胺、腐胺和酪胺含量的變化與組胺相似，新鮮魚肉中未檢測(cè)出尸胺、腐胺和酪胺，隨著大眼金槍魚魚肉腐敗程度的加深, 分別在第4天，第2天，第12 h和第8 h含量迅速增加。色胺的含量在貯藏期間呈下降趨勢(shì)，苯乙胺，亞精胺和精胺在貯藏期間含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但這些生物胺的含量變化都不夠明顯，因此判斷組胺、尸胺、腐胺和酪胺為大眼金槍魚中的主要生物胺。

圖5 0 ℃(a)、4 ℃(b)、15 ℃(c)及25 ℃(d)貯藏條件下生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.5 Changes of the biogenic amine mass fraction under 0 ℃(a), 4℃(b), 15℃(c), and 25℃(d) storage conditions

2.6 相關(guān)性分析

為分析大眼金槍魚貯藏過(guò)程中鮮度指標(biāo)和生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系，根據(jù)以上分析結(jié)果，對(duì)pH值、TVB-N、菌落總數(shù)、K值、生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)、生物胺指數(shù)(biogenic amine index，BAI)以及質(zhì)量指數(shù)(quality index，QI)進(jìn)行皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)分析，其分析結(jié)果如表1所示。

從表1可知，生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)與pH值之間的相關(guān)性不顯著。在不同貯藏溫度下，色胺和TVB-N、菌落總數(shù)以及K值呈負(fù)相關(guān)，但在25 ℃時(shí)的相關(guān)性不顯著。苯乙胺、亞精胺及精胺和鮮度指標(biāo)的相關(guān)性不顯著，腐胺、尸胺、組胺和酪胺與鮮度指標(biāo)的相關(guān)性極顯著(P<0.01)。BAI為組胺、腐胺、尸胺和酪胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和，其與鮮度指標(biāo)為極顯著相關(guān)(P<0.01)。經(jīng)研究可知，BAI適用于金槍魚新鮮度的評(píng)價(jià)，以BAI≤50 mg/kg的金槍魚定為魚肉感官品質(zhì)可接受的范圍[28]。QI=(組胺+腐胺+尸胺)/(1+亞精胺+精胺)，最初是用來(lái)研究金槍魚罐頭原料的新鮮度，可采用QI作為評(píng)價(jià)金槍魚新鮮度的指標(biāo)，但評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)同時(shí)以其他指標(biāo)作為參考[29]，總體以小于10為可接受范圍。從相關(guān)性分析可知，BAI和QI結(jié)果相似，與TVB-N、菌落總數(shù)以及K值都有極顯著相關(guān)性(P<0.01)。將BAI以及QI規(guī)定指標(biāo)與生食金槍魚的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[19]作對(duì)比可知，優(yōu)質(zhì)魚與可食用生鮮魚的標(biāo)準(zhǔn)存在較大的差異，因此，對(duì)于金槍魚的生食標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該綜合考慮各方面的影響因素。

表1 大眼金槍魚中生物胺與pH值、TVB-N、菌落總數(shù)和K值的相關(guān)性Tab.1 Correlations of biogenic amines with pH Value, TVB-N, aerobic plate count and K Value in bigeye tuna(Thunnus obesus)

2.7 回歸方程分析

為進(jìn)一步明確鮮度指標(biāo)和各生物胺之間的關(guān)系，將經(jīng)相關(guān)性分析后得出的顯著相關(guān)指標(biāo)TVB-N、菌落總數(shù)和K值作為自變量，BAI和QI作為因變量進(jìn)行回歸分析，建立了不同溫度下各個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性回歸模型(圖6～圖8)。由圖3、圖4和圖5可知，不同溫度下TVB-N、菌落總數(shù)和K值與生物胺指標(biāo)的的擬合度良好，除15 ℃條件下K值與QI的回歸模型差異顯著(P<0.05)外，其他回歸模型均具有極顯著差異(P<0.01)。從與BAI的回歸系數(shù)看，在該回歸模型下TVB-N與K值之間的回歸性最好，其中TVB-N的∑R2=3.76，菌落總數(shù)的∑R2=3.33，K值的∑R2=3.76。從QI的回歸系數(shù)看，TVB-N的回歸性最好，在該回歸模型下TVB-N的∑R2=3.54，菌落總數(shù)的∑R2=3.39，K值的∑R2=3.45。從BAI與QI的回歸系數(shù)看，不同溫度下BAI要優(yōu)于QI的回歸性，與TVB-N、菌落總數(shù)和K值的關(guān)系更加密切，更適用于對(duì)金槍魚的鮮度判斷。

圖6 TVB-N與生物胺指標(biāo)的回歸模型Fig.6 Regression models between TVB-N and biogenic amines indicator

圖7 微生物數(shù)量與生物胺指標(biāo)的回歸模型Fig.7 Regression models between microbilogical count and biogenic amines indicator

圖8 K值與生物胺指標(biāo)的回歸模型Fig.8 Regression models between K value and biogenic amines indicator

3 討論

本研究對(duì)模擬網(wǎng)購(gòu)生食大眼金槍魚不同溫度條件下的pH、TVB-N、菌落總數(shù)、K值和生物胺進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，綜合考慮相關(guān)因素，不同溫度下(0、4、15和25 ℃)的生食大眼金槍魚貨架期分別為48、24、12和8 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)pH無(wú)法準(zhǔn)確判斷大眼金槍魚的新鮮度，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)被相關(guān)酶大量分解[30]，TVB-N、菌落總數(shù)、K值和生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)迅速，因此溫度和時(shí)間是控制魚肉品質(zhì)的關(guān)鍵，保證低溫和降低運(yùn)輸時(shí)間可有效延長(zhǎng)生食大眼金槍魚的貨架期。通過(guò)相關(guān)性分析，pH與生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)并無(wú)顯著相關(guān)性，TVB-N、菌落總數(shù)和K值與生物胺具有顯著相關(guān)性。大眼金槍魚的主要生物胺為腐胺、尸胺、組胺和酪胺，BAI以及QI可用來(lái)判斷生物胺是否超標(biāo)，綜合回歸模型結(jié)果可知，BAI比QI更適合作為生食大眼金槍魚的鮮度判斷標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，TVB-N變化敏感度較低，而K值、菌落總數(shù)和生物胺指數(shù)的變化基本一致，因此K值、菌落總數(shù)和生物胺指數(shù)可綜合考慮作為流通過(guò)程中生食大眼金槍魚的鮮度判定指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于生食金槍魚各有標(biāo)準(zhǔn)，存在一定差異，因此，對(duì)于金槍魚的生食標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該綜合考慮影響因素，才能確保消費(fèi)者食用安全。其次，網(wǎng)購(gòu)金槍魚在運(yùn)輸過(guò)程中溫度控制不當(dāng)，往往在0 ℃以上，甚至接近室溫溫度，且運(yùn)輸時(shí)間在1～3 d不等，這些都將成為消費(fèi)者生食大眼金槍魚的安全隱患。如何在網(wǎng)購(gòu)流通過(guò)程中有效控制溫度，保障魚肉品質(zhì)，還需要進(jìn)一步深入研究。本研究可為網(wǎng)購(gòu)生食大眼金槍魚的貯藏運(yùn)輸以及消費(fèi)者安全生食提供理論依據(jù)。