三氟乙酸增強(qiáng)的解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像用于脂質(zhì)空間分布研究

王曉群，黃光明

（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,合肥230026）

脂質(zhì)在能量存儲(chǔ)、細(xì)胞膜形成和細(xì)胞信號(hào)通路等方面發(fā)揮著重要的作用［1，2］.研究表明，諸多癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫疾病均涉及大量脂質(zhì)的異常代謝［3～5］.因此，研究生物組織中脂質(zhì)的相對(duì)含量和空間分布，將有助于發(fā)現(xiàn)人類(lèi)疾病的生物標(biāo)記物.脂質(zhì)種類(lèi)眾多且相互作用復(fù)雜，因此同時(shí)對(duì)多種脂質(zhì)進(jìn)行成像分析具有重要的研究?jī)r(jià)值.

解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（DESI-MSI）作為一種常壓下的質(zhì)譜成像技術(shù)，具有無(wú)需樣品預(yù)處理、碎片離子少等優(yōu)點(diǎn)［6，7］，已被廣泛用于研究如腦、肝及腎臟等多種生物組織中脂質(zhì)的空間分布［8～10］.但是有些脂質(zhì)在組織中的豐度較低或者在電噴霧過(guò)程中的離子化效率低，難以被DESI-MSI檢測(cè)到；且采用DESI-MSI方法檢測(cè)脂質(zhì)時(shí)，會(huì)形成大量鈉、鉀等加合離子，造成質(zhì)譜峰分裂，不利于譜圖解析及后續(xù)的定量分析［11，12］.因此，需要進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度、簡(jiǎn)化譜圖，以便更好地利用DESI-MSI技術(shù)研究脂質(zhì)的空間分布及疾病的發(fā)病機(jī)制.

前文［13］針對(duì)小分子代謝物建立了一種三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI方法，顯著提高了小鼠腦組織中氨基酸、多胺和嘌呤類(lèi)等物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度.同時(shí)，該方法利用三氟乙酸在解吸電噴霧過(guò)程中為小分子代謝物提供更多質(zhì)子，可以抑制小分子代謝物的金屬加合物的形成，從而簡(jiǎn)化譜圖解析.本文繼續(xù)采用該方法來(lái)提高DESI-MSI對(duì)脂質(zhì)的檢測(cè)能力，將0.01 mmol/L三氟乙酸添加到甲醇中作為DESI-MSI的噴霧溶劑，使小鼠腦組織中可成像的脂質(zhì)種類(lèi)從59種提高到71種.此外，還研究了多種脂質(zhì)間的空間相關(guān)性，為揭示多種脂質(zhì)之間潛在的代謝規(guī)律提供了新的研究手段.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇（色譜純，美國(guó)霍尼韋爾公司）；三氟乙酸（色譜純，上海阿拉丁生化試劑有限公司）；超純水由Milli-Q純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備.所用試劑未經(jīng)進(jìn)一步純化處理，直接使用.

Exactive Plus型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；JY 92-ⅡDN型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波市寧波新芝生物科技股份有限公司）；1860型低溫切片機(jī)（德國(guó)徠卡生物系統(tǒng)）.

1.2 腦組織樣本的制備

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn).將8周齡C57BL/6J小鼠麻醉后，立即取出腦組織置于液氮中冷凍.小鼠腦組織勻漿的制備：將冷凍的小鼠腦組織添加一定超純水（每50 mg組織加1 mL水），用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行組織勻漿，并于-80℃儲(chǔ)存待DESI-MS分析.將冷凍勻漿在質(zhì)譜分析前置于室溫下解凍30 min.小鼠腦組織切片的制備：使用冷凍包埋劑（OCT）將小鼠腦組織固定，在-20℃下解凍1 h后，用低溫切片機(jī)切為厚度為16μm的薄片，并置于ITO載玻片上.將切片置于-80℃冰箱中保存，使用前須真空干燥30 min.

1.3 質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)使用的自制DESI離子源由2層同軸的熔融石英毛細(xì)管組成：外毛細(xì)管內(nèi)徑為250μm，外徑為370μm，作為霧化氣氣路導(dǎo)管；內(nèi)部毛細(xì)管內(nèi)徑為50μm，外徑為150μm，作為電噴液路導(dǎo)管.霧化氣體氮?dú)鈴膬?nèi)外毛細(xì)管之間的空隙通過(guò).DESI離子源幾何參數(shù)：離子源與樣品表面的距離為1.5 mm，離子源與質(zhì)譜儀入口的距離為6 mm，離子源噴射沖擊角度為55°，收集角度小于10°.電噴霧參數(shù)：噴霧溶劑分別為添加0.01 mmol/L和未添加三氟乙酸的甲醇；噴霧溶劑流速為2μL/min；噴霧電壓為4 kV；正離子采集模式.使用二維電動(dòng)移動(dòng)平臺(tái)控制樣品的運(yùn)動(dòng)速度和方向，每行的掃描速度為250μm/s，兩行間距為250μm.

1.4 Nissl染色

染色步驟：（1）將4%的多聚甲醛溶液滴加到小鼠腦組織切片上覆蓋腦片，固定1 h；（2）將玻片浸泡在PBS緩沖液中洗去多聚甲醛，5 min后更換PBS緩沖液，再浸泡5 min；（3）取出玻片，將滅菌超純水滴至玻片表面，覆蓋腦片，約5 min后去除液體；（4）將0.25%尼氏（Nissl）染液滴至玻片表面，覆蓋腦片，染色約15 min；（5）梯度脫色：將玻片依次放入70%，80%，95%和100%乙醇溶液中；（6）在100%乙醇溶液中脫色后，立即滴加樹(shù)脂覆蓋住腦片，蓋上蓋玻片即可.最后，滴加樹(shù)脂并用玻璃蓋玻片蓋住組織切片以完成Nissl染色.

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard的MSConvert軟件（http：//proteowizard.sourceforge.net/）將.RAW格式的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為.mzXML格式，再利用自編MATLAB程序?qū)?mzXML格式文件轉(zhuǎn)化為.mat文件，最終利用開(kāi)源成像軟件MSiReader（免費(fèi)軟件，www.MSiReader.com）獲得脂質(zhì)的空間分布.

1.6 脂質(zhì)的鑒定

查詢(xún)?nèi)祟?lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB，https：//hmdb.ca/），要求m/z的測(cè)量值與理論值誤差＜5×10-6；且其穩(wěn)定同位素分布符合理論預(yù)測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 三氟乙酸提高DESI-MS對(duì)脂質(zhì)的檢測(cè)能力

在噴霧溶劑甲醇中加入0.01 mmol/L三氟乙酸，考察了小鼠腦勻漿的脂質(zhì)變化，結(jié)果如圖1所示.與其它質(zhì)譜方法得到的結(jié)果［14，15］類(lèi)似，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到腦組織中主要的脂質(zhì)有磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）及鞘磷脂（SM），大多數(shù)脂質(zhì)的分子量集中在700～900之間［圖1（A）］.而未添加三氟乙酸時(shí)用DESI-MS檢測(cè)到59種脂質(zhì)，含有26種PC，26種PE，3種PS，3種SM及1種磷脂酸（PA）［圖1（B）］.使用三氟乙酸后，檢測(cè)到的脂質(zhì)數(shù)量增加到71種，新增的12種脂質(zhì)中包括4種PC，2種PE，5種PS及1種磷脂酰肌醇（PI）.表S1和S2（見(jiàn)本文支持信息）分別列出了利用三氟乙酸檢測(cè)的71種脂質(zhì)的分子信息及其對(duì)DESI-MS能檢測(cè)到的59種脂質(zhì)的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的影響.以上結(jié)果表明，三氟乙酸的加入提高了脂質(zhì)在解吸電噴霧過(guò)程中的離子化效率，這可能與三氟乙酸的強(qiáng)給質(zhì)子能力有關(guān)（酸離解常數(shù)為0.23）.類(lèi)似的增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)的方式也被用于基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜成像分析中，利用添加在基質(zhì)溶液中的三氟乙酸作為質(zhì)子供體提高電離效率［16，17］.

Fig.1 Detection of lipids from mouse brain homogenate improved by trifluoroacetic acid

我們還希望利用三氟乙酸的強(qiáng)給質(zhì)子能力形成更多的質(zhì)子加合峰，用于抑制金屬離子加合峰，從而有助于簡(jiǎn)化譜圖解析及定量分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用未添加三氟乙酸的DESI-MSI時(shí)，PC（32：0）的鉀和鈉加合物信號(hào)強(qiáng)度分別占總信號(hào)強(qiáng)度（質(zhì)子化峰、鈉加合物以及鉀加合物三者信號(hào)強(qiáng)度之和）的72%和19%，而質(zhì)子化信號(hào)強(qiáng)度僅占9%［圖2（A）］.添加三氟乙酸后質(zhì)子化信號(hào)強(qiáng)度比例上升到85%.部分脂質(zhì)幾乎全部以質(zhì)子化形式出現(xiàn).另外，通過(guò)比較DESI成像中檢測(cè)到的59種脂質(zhì)的信號(hào)發(fā)現(xiàn)，加酸后這59種脂質(zhì)的質(zhì)子加合物的信號(hào)強(qiáng)度總和提高約5倍，而其鈉、鉀加合物的信號(hào)強(qiáng)度總和分別降低了52%和75%［圖2（B）］.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，使用三氟乙酸后新增的12個(gè)脂質(zhì)全部以質(zhì)子化形式出現(xiàn).以上結(jié)果表明，加酸有助于抑制脂質(zhì)金屬離子加合物的形成，提高質(zhì)子化效率，從而有助于簡(jiǎn)化譜圖及后續(xù)的定量分析.

Fig.2 Formation of protonated lipids promoted by trifluoroacetic acid and formation of sodium and potassium adducts of lipids inhibited by trifluoroacetic acid

2.2 三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI同時(shí)獲得多種脂質(zhì)的空間分布

利用三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI對(duì)小鼠腦組織的矢狀面切片進(jìn)行了成像分析，圖3（A）示出了71種脂質(zhì)在矢狀面切片上的空間分布.通過(guò)與相鄰切片的染色結(jié)果比對(duì)并結(jié)合腦組織的主要解剖特征，確定矢狀面切片上16個(gè)主要腦區(qū)包括：視覺(jué)皮層（Visual cortex）、軀體感覺(jué)皮層（Somatosensory cortex）、運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)（Motor cortex）、島狀皮質(zhì)（Insular cortex）、梨狀皮質(zhì)（Piriform cortex）、胼胝體（Corpus callosum）、海馬（Hippocampus）、紋狀體（Striatum）、丘腦（Thalamus）、大腦腳（Cerebral peduncle）、視前區(qū)（Preoptic area）、下丘腦（Hypothalamus）、上丘（Superior colliculus）、中腦（Midbrain）、腦干（Brainstem）和小腦（Cerebellum）［圖3（B）］.

Fig.3 Spatial distributions of lipids revealed by trifluoroacetic acid-enhanced DESI-MSI

由圖3可見(jiàn)，71種脂質(zhì)在小鼠腦組織切片上體現(xiàn)了不同的分布規(guī)律.在腦區(qū)白質(zhì)區(qū)域（由神經(jīng)元的軸突或長(zhǎng)樹(shù)突集聚而成，不含胞體只有神經(jīng)纖維的腦區(qū)，如胼胝體、丘腦、大腦腳、中腦、腦干和小腦內(nèi)圍等）有21種脂質(zhì)的含量較高，其中包含11種PC［如PC（40：1）］，6種PE［如PE（P-34：1）］，3種PS［如PS（36：1）］以及1種PA（40：2）.而在剩下的灰質(zhì)區(qū)域（神經(jīng)元胞體及其樹(shù)突聚集的腦區(qū)）中，15種脂質(zhì)的含量相對(duì)較高，其中包括PC（32：0），PE（P-38：6），PS（40：6）及SM（d36：1）等.另外，少數(shù)脂質(zhì)主要分布在某些特定腦區(qū)，如PC（40：6），PS（36：2）和SM（d38：1）主要分布在小腦外周的灰質(zhì)區(qū)域，而PE（P-36：4）主要分布在紋狀體.以上結(jié)果表明，利用三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI方法可實(shí)現(xiàn)小鼠腦組織中多種脂質(zhì)的同時(shí)成像分析.

此外，對(duì)于DESI-MSI中可能存在的高速?lài)婌F液滴對(duì)鄰近樣品點(diǎn)的影響，參考文獻(xiàn)［18～20］方法，通過(guò)對(duì)噴霧溶劑的流速和種類(lèi)、毛細(xì)管與樣品的距離和角度等進(jìn)行調(diào)控，使帶電噴霧液滴撞擊樣品表面后獲得面積更小、更接近圓形分布的撞擊面，從而進(jìn)一步提高成像的空間分辨率.

2.3 空間分布相關(guān)性分析

研究表明，生物組織中2種物質(zhì)之間若存在較強(qiáng)的空間相關(guān)性，則兩者間可能存在潛在的代謝關(guān)聯(lián)［21］.三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI增加了檢測(cè)到的脂質(zhì)種類(lèi)，因此可以用其對(duì)更多種類(lèi)的脂質(zhì)展開(kāi)空間分布相關(guān)性的研究.本文采用皮爾森相關(guān)系數(shù)（rij）來(lái)評(píng)估2種脂質(zhì)空間分布的相關(guān)性［13，21～23］.

2.3.1 全腦層面空間分布相關(guān)性分析小鼠腦組織中的脂質(zhì)主要有PC，PE以及PS 3種，分別研究了它們?cè)谌X層面空間分布的相關(guān)性（空間分布如圖3所示）.PC是大腦細(xì)胞膜的主要成分之一，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理過(guò)程.圖4示出了全腦層面30種PC之間的654個(gè)rij值，其中有94個(gè)rij≥0.7，表明這些脂質(zhì)間具較強(qiáng)的空間正相關(guān)性.如，PC（42：1）與PC（42：2）之間的rij值為0.91，PC（P-38：1）與PC（P-34：1）之間的rij值為0.81，均主要分布在胼胝體、丘腦等白質(zhì)區(qū)域.由于未添加三氟乙酸的DESIMSI無(wú)法檢測(cè)到PC（42：2）和PC（P-34：1），故無(wú)法評(píng)估它們與其它脂質(zhì)的空間相關(guān)性.另外，一些PC的空間分布也表現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，如，PC（42：2）與PC（32：0）之間的rij值為-0.62.由圖3還可看出，PC（42：2）主要分布在腦組織的白質(zhì)區(qū)域，而PC（32：0）主要分布在皮層、紋狀體等灰質(zhì)區(qū)域.以上結(jié)果表明，利用三氟乙酸增強(qiáng)的方法對(duì)更多的PC空間相關(guān)性進(jìn)行研究，可能為研究PC間潛在代謝提供新的研究手段.

Fig.4 Pearson correlation coefficients(rij)calculated among the spatial distributions of 30 PCs in the whole brain tissue section

Fig.5 Pearson correlation coefficients(rij)calculated among the spatial distributions of 28 PEs(A)and 8 PSs(B)in the whole brain tissue section

PE是細(xì)胞膜的另一個(gè)重要組成部分，主要位于大腦神經(jīng)系統(tǒng).據(jù)報(bào)道，在細(xì)胞凋亡的早期，PE從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，與PS共同為細(xì)胞提供早期凋亡信號(hào)［24～26］.由圖5（A）可見(jiàn)，PE（38：2）與PE（P-38：1）和PE（P-38：2）之間均具有較強(qiáng)的空間正相關(guān)性，其對(duì)應(yīng)的rij值分別為0.92和0.93，從成像圖上看三者均主要分布在胼胝體、丘腦等白質(zhì)區(qū)域.而PE（38：4）與PE（P-38：1）和PE（P-38：2）之間的空間分布呈負(fù)相關(guān)，對(duì)應(yīng)的rij值分別為-0.46和-0.47，其中，PE（38：4）主要分布在白質(zhì)區(qū)域，而PE（P-38：1）和PE（P-38：2）主要分布在皮層、紋狀體等灰質(zhì)腦區(qū).PS作為細(xì)胞膜的第三大磷脂成分，具有增強(qiáng)大腦記憶的功能.PS具有很強(qiáng)的親脂性，從人體吸收后可以迅速通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，起到舒緩血管、增強(qiáng)腦部供血的作用［27，28］.利用未添加三氟乙酸的DESI-MSI只檢測(cè)到3種PS［PS（40：0），PS（40：9）和PS（42：9）］，而添加三氟乙酸后則再檢測(cè)到5種PS［即PS（36：1），PS（36：2），PS（38：4），PS（40：4）和PS（40：6）］.圖5（B）示出了8種PS在全腦層面的rij值.PS（40：0）與PS（36：1），PS（38：4）在白質(zhì)區(qū)域分布呈現(xiàn)強(qiáng)烈的正相關(guān)性，相應(yīng)的rij分別為0.93［PS（40：0）和PS（36：1）］，0.71［PS（40：0）和PS（38：4）］和0.76［PS（36：1）和PS（38：4）］.另外，PS（40：6），PS（40：9）以及PS（42：9）在灰質(zhì)區(qū)域的含量相對(duì)較高，三者間也具有較強(qiáng)的空間正相關(guān)性.以上結(jié)果表明，利用三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI可以研究更多種類(lèi)的PS空間分布的相關(guān)性.

2.3.2 腦區(qū)層面空間分布相關(guān)性分析大腦按照生物功能及解剖特征可分為若干腦區(qū).除了從全腦層面探索各脂質(zhì)間的相關(guān)性，還有必要深入探索脂質(zhì)在具有重要生物功能腦區(qū)的相關(guān)性.例如，小腦負(fù)責(zé)調(diào)整肌緊張、維持身體平衡、控制肌肉張力和協(xié)調(diào)等［29］.分析表明，部分PS間在小腦表現(xiàn)獨(dú)特的空間分布相關(guān)性.PS（36：2）與PS（36：1）在全腦層面無(wú)顯著相關(guān)性［rij=0.15，圖6（A）］，但兩者在小腦區(qū)域表現(xiàn)出較強(qiáng)的空間負(fù)相關(guān)性［rij=-0.48，圖6（B）］，其中PS（36：1）主要分布在小腦內(nèi)圍的白質(zhì)區(qū)域，而PS（36：2）主要分布在小腦外圍的灰質(zhì)區(qū)域.PS（36：2）與PS（40：6）在全腦層面也無(wú)顯著相關(guān)性［rij=-0.11，圖6（C）］，但兩者在小腦外圍的灰質(zhì)部分體現(xiàn)出了很強(qiáng)的正相關(guān)性［rij=0.86，圖6（D）］.綜上所述，從腦區(qū)層面開(kāi)展更詳細(xì)的脂質(zhì)空間分布相關(guān)性探索，可為揭示潛在的脂質(zhì)代謝途徑提供新的研究思路.

Fig.6 Correlations between the spatial distributions of PSs in the cerebellum

3 結(jié) 論

利用三氟乙酸增強(qiáng)的DESI-MSI實(shí)現(xiàn)了小鼠腦組織切片中更多脂質(zhì)的同時(shí)成像分析，將可成像的脂質(zhì)種類(lèi)從59種提高到71種.利用該方法可以研究更多種類(lèi)的脂質(zhì)在小鼠腦組織上的空間分布相關(guān)性.另外，通過(guò)腦區(qū)層面分布相關(guān)性研究，可以發(fā)現(xiàn)部分脂質(zhì)之間在某些特定功能腦區(qū)會(huì)表現(xiàn)獨(dú)特的空間相關(guān)性，有利于后續(xù)深入研究全腦以及特定腦區(qū)的脂質(zhì)代謝異常及可能的代謝調(diào)控.用三氟乙酸增強(qiáng)的方法對(duì)腦組織脂質(zhì)進(jìn)行原位分析，有望為探索大腦相關(guān)疾?。ㄈ绨柶澓ＤY、動(dòng)脈粥樣硬化和帕金森病等）的發(fā)病機(jī)制以及研發(fā)基于代謝調(diào)控的治療方法提供新的研究手段.

支持信息見(jiàn)http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200448.