產(chǎn)阿魏酸酯酶絲狀真菌篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

李松，徐朝旭，林陳瑩，魏勝華，李艷賓

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

阿魏酸酯酶又稱肉桂酸酯酶，屬于羧酸水解酶的一個(gè)亞類[1]，主要應(yīng)用于作為膳食纖維補(bǔ)充劑阿魏酸的分離制備及酚酸化合物的合成[2-4]，在造紙工業(yè)中可與漆酶、纖維素酶等通過(guò)協(xié)同作用去除木質(zhì)素并提高纖維素降解效率[5]，亦可應(yīng)用于飼料的預(yù)處理以提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的吸收[6]。此外，阿魏酸酯酶可以加速木質(zhì)纖維素的降解，在生物質(zhì)利用和燃料乙醇的生產(chǎn)中亦具有重要的應(yīng)用前景。

阿魏酸酯酶首次于1987年在藍(lán)色鏈霉菌屬(Streptomycesolivochromogenes)中發(fā)現(xiàn)[7]，F(xiàn)AULDS等[8]在1991年第一次從該菌中將阿魏酸酯酶分離純化，之后諸多阿魏酸酯酶在不同的微生物中被發(fā)現(xiàn)。目前,已從微生物中發(fā)現(xiàn)了40多種阿魏酸酯酶，其中曲霉屬約占產(chǎn)阿魏酸酯酶微生物的1/3[9-12]。真菌中主要有黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、黃柄曲霉、繩狀青霉、泡盛曲霉、塔賓曲霉和里氏木霉等[13]，細(xì)菌中主要有溶纖維丁酸弧菌、纖維弧菌、熱纖維梭菌、嗜酸乳酸桿菌和光假單胞菌等[14]。雖然阿魏酸酯酶存在范圍較廣，且真菌、細(xì)菌和植物中的阿魏酸酯酶均分別得到了深入研究[15-19]，但是目前已報(bào)道的微生物發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶水平普遍不高，尚不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此通過(guò)自然選育獲得阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株依然是目前解決阿魏酸酯酶工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)酶水平過(guò)低的重要方法之一[9,20-21]。本研究以篩選阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株為目的，從多種自然樣本中篩選得到8株產(chǎn)阿魏酸酯酶絲狀真菌，并對(duì)其中1株產(chǎn)阿魏酸酯酶能力最高的菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為阿魏酸酯酶產(chǎn)生菌種的選育和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、可溶性淀粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲醇，SIGMA公司；麩皮、豆渣、黃豆餅粉、玉米粉，市場(chǎng)；稻草秸稈，農(nóng)村；阿魏酸、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯，上海源葉生物科技有限公司；T-載體、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；5.8S ITS-rDNA PCR擴(kuò)增通用引物(ITS1和ITS4)，上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 自然樣本

自然土壤樣本分別采自安徽天堂寨風(fēng)景區(qū)和安徽蕪湖神山公園。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15，自然pH。115 ℃滅菌20 min，在冷卻至55 ℃左右時(shí)添加卡那霉素至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，搖勻后倒平板。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15，Triton X-100 0.2，自然pH。115 ℃滅菌20 min，在冷卻至55 ℃時(shí)按每100 mL培養(yǎng)基加入1.5 mL體積分?jǐn)?shù)為 10%阿魏酸乙酯(二甲基亞砜)溶液，并添加卡那霉素至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，搖勻后倒平板。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白10，K2HPO41，pH 6.0，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：FeSO4·7H2O 0.01，NaNO32，NH4Cl 3，豆餅粉5，蔗糖10，玉米漿干粉5，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，麥麩20，pH 6.0，于115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀(TC312)，美國(guó)TECH公司；組合式恒溫?fù)u床(HYL-C)，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫金屬浴(HB-100)，杭州博日科技有限公司；pH計(jì)(FE20)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；離心機(jī)(1-14)，德國(guó)SIGMA公司；高效液相色譜儀(P230)，大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種篩選與鑒定

(1)菌種初篩：將不同土樣使用無(wú)菌水進(jìn)行10倍稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后，挑取生長(zhǎng)出來(lái)的真菌菌絲接種至初篩培養(yǎng)基，繼續(xù)于30 ℃培養(yǎng)4 d后觀察其是否產(chǎn)生透明圈，選擇產(chǎn)生透明圈的真菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并測(cè)定阿魏酸酯酶酶活力。

(2)菌種復(fù)篩：將初篩菌株在PDA平板中培養(yǎng)4 d后，使用10 mL無(wú)菌水洗下孢子后，接種1 mL孢子懸液至種子培養(yǎng)基30 mL/250 mL，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后按體積分?jǐn)?shù)為10%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL/250 mL，并于30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵6 d后測(cè)定阿魏酸酯酶酶活力。選取發(fā)酵酶活力高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(3)篩選菌株分子生物學(xué)鑒定：真菌染色體DNA提取、質(zhì)粒DNA小量制備及DNA連接、轉(zhuǎn)化等分子操作參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。以染色體DNA為模板，分別以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為上下游引物，在54 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接T-載體，提取重組質(zhì)粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。所得ITS-rDNA序列的比對(duì)及菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定

阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定：參考ZHANG等[24]方法進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)中釋放的阿魏酸含量采用高效液相色譜法測(cè)定[25]。色譜條件為色譜柱：ODS-C18；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：V(體積分?jǐn)?shù)1%乙酸)∶V(甲醇)=72∶28；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。酶活力定義：在該反應(yīng)條件下，1 min降解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.3 單因素優(yōu)化

(1)單因素實(shí)驗(yàn)：采用1.3.1小節(jié)所述菌種復(fù)篩發(fā)酵條件，分別將培養(yǎng)溫度設(shè)置為24～34 ℃以研究不同溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；分別將發(fā)酵液初始pH調(diào)節(jié)至4～8，以研究pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；分別將碳源(10 g/L)調(diào)整為葡萄糖、糊精、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和木糖，以研究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；分別將氮源調(diào)整為NaNO3、(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl、豆餅粉、玉米漿干粉和豆渣至最終含氮量為2 g/L，以研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；分別將誘導(dǎo)物(10 g/L)調(diào)整為啤酒糟、秸稈、玉米粉、玉米漿和麩皮，以研究不同物質(zhì)對(duì)菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶的影響。

(2)單因素爬坡實(shí)驗(yàn)：將最適碳源的質(zhì)量濃度調(diào)至10～40 g/L，最適氮源的質(zhì)量濃度調(diào)至20～120 g/L，最適誘導(dǎo)物的質(zhì)量濃度調(diào)至10～40 g/L，以研究碳源、氮源和誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.3.4 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)蔗糖、豆渣和啤酒糟3個(gè)因素進(jìn)行Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，響應(yīng)值為阿魏酸酯酶酶活力(U/L)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 單位：g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

2.1.1 菌種篩選

從不同土壤樣本中共篩得到43株絲狀真菌，其中有8株可在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)后產(chǎn)生透明圈，如圖1所示。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果表明，菌株W2發(fā)酵活力相對(duì)較高，如圖2所示，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用W2作為出發(fā)菌株進(jìn)行研究。

圖1 平板初篩結(jié)果Fig.1 Primary screening results

圖2 篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活力比較Fig.2 Activity of feruloyl esterase produced by isolated strains

2.1.2 菌種鑒定

以菌株W2染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得5.8S ITS-rDNA序列經(jīng)測(cè)序、同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，菌株W2與曲霉屬(Aspergillussp.)同源性較高，如圖3所示。在鑒定到種的菌株中與1株土曲霉菌株(AspergillusterreusX3)同源性最高(GenBank登錄號(hào)：KU573776.1；同源性：100%)，因此，基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析和同源性比對(duì)分析結(jié)果，將W2鑒定為土曲霉。

圖3 W2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of W2 strain

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵溫度和pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4-a可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為26 ℃時(shí)土曲霉W2發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活力最高，且隨著溫度上升，發(fā)酵酶活力急劇下降。由圖4-b可知，土曲霉W2的最適產(chǎn)酶pH為5.0，且隨著pH升高，酶活力逐漸降低。

圖4 溫度和pH對(duì)土曲霉W2發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the activity of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.2.2 碳源、氮源和誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響

如圖5-a所示，不同碳源對(duì)土曲霉W2產(chǎn)酶的影響不同，添加蔗糖時(shí)產(chǎn)酶效果最好，其次為木糖，而使用乳糖時(shí)產(chǎn)酶效果最差。如圖5-b所示，天然的復(fù)合氮源產(chǎn)酶效果較好，如豆渣和玉米漿干粉，而銨鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶效果最差，如NH4Cl和(NH4)2SO4。阿魏酸酯酶是一種誘導(dǎo)酶，因此在發(fā)酵過(guò)程中通常需要添加誘導(dǎo)物以提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，如圖5-c所示，使用啤酒糟時(shí)所得阿魏酸酯酶活力最高，其次為麩皮和秸稈，而采用玉米粉時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果較差。

a-碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；b-氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；c-誘導(dǎo)物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖5 碳源、氮源及誘導(dǎo)物對(duì)土曲霉W2產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響Fig.5 Effect of carbon source， nitrogen source and inducer on the activity feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.3 爬坡實(shí)驗(yàn)

分別選擇單因素實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)酶效果最好的碳源、氮源和誘導(dǎo)物進(jìn)行爬坡實(shí)驗(yàn)，如圖6所示，蔗糖、豆渣和啤酒糟的質(zhì)量濃度分別采用30、80和25 g/L時(shí)所獲得的發(fā)酵酶活力最高。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

圖6 蔗糖、豆渣及啤酒糟對(duì)土曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響Fig.6 Effect of sucrose, bean dregs and brewer’s grains on the activity level of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of response surface experiment results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

圖7 不同變量交互作用對(duì)產(chǎn)酶的影響曲面圖Fig.7 Surface plot for the effect of different variables interaction on the activity of feruloyl esterase produced by A. terreus W2

3 結(jié)論與討論

目前研究報(bào)道的阿魏酸酯酶產(chǎn)酶水平較高的絲狀真菌多為曲霉屬，本研究從大量絲狀真菌中篩選得到1株阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)鑒定為土曲霉，同屬于曲霉屬。對(duì)篩選菌株土曲霉W2進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，結(jié)果表明使用啤酒糟作為誘導(dǎo)物時(shí)產(chǎn)酶效果最好，碳、氮源分別使用蔗糖和豆渣時(shí)產(chǎn)酶效果最好，最適產(chǎn)酶溫度和pH分別為26 ℃和5.0。最終優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成(g/L)：葡糖糖30，啤酒糟24.5，豆渣81，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，pH 5.0。使用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵6 d后阿魏酸酯酶酶活力達(dá)到205 U/L，約為優(yōu)化前產(chǎn)酶水平的3倍。目前阿魏酸酯酶表達(dá)量較高的多為異源表達(dá)，如李兵等[26]將密碼子優(yōu)化后的黑曲霉阿魏酸酯酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，獲得最大表達(dá)量為(39.9±0.1)U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究利用原始菌株所得表達(dá)水平，表明本研究所得結(jié)果距離工業(yè)化應(yīng)用尚有很大差距。綜上所述，本研究為阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株的選育和基因工程菌的構(gòu)建提供了1株良好出發(fā)菌株，發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果為該菌株的后續(xù)放大發(fā)酵和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，菌種誘變選育和阿魏酸酯酶基因的異源表達(dá)將是本研究后期的主要方向。