棗胚敗育因素分析及提高幼胚發(fā)生的措施

閆旭宇，李 娟，李 玲，田雅珊，栗現(xiàn)芳

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科棗屬植物，是原產(chǎn)我國的特有果樹[1]，在我國分布很廣。棗果具有很高的營養(yǎng)價(jià)值、食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，種植棗樹林生態(tài)效益好[2]。種植優(yōu)良品種是棗果優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、棗樹高效栽培和棗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和基礎(chǔ)[3]。因此，培育綜合性狀優(yōu)良的棗樹品種并廣泛應(yīng)用于棗樹生產(chǎn)上迫在眉睫[3]。然而，目前生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的棗樹品種大部分是通過自然選優(yōu)選育，自然選優(yōu)變異頻率低，選出優(yōu)良品種的幾率小，且品種創(chuàng)新程度低，難以大幅度改良品種，滿足不了生產(chǎn)上對(duì)優(yōu)良品種的需要[4]。相比于自然選優(yōu)，雜交育種可以有選擇性地將不同品種的優(yōu)良特性整合在一起，較大幅度改良品種，是棗樹等果樹不得不重視和加以應(yīng)用的育種途徑[4]。然而到目前為止，棗樹雜交育種還未真正開展起來[3]，誘變、轉(zhuǎn)基因等方法培育的品種也幾乎沒有。這主要是由于大多數(shù)栽培棗無種胚或種胚發(fā)育不完全[5]，其種性難以從遺傳學(xué)角度得以保持，這種棗胚退化或敗育特性嚴(yán)重阻礙了棗樹雜交育種的進(jìn)程[5,6]。因此，探索棗胚退化或敗育原因及提高棗胚發(fā)生的措施，對(duì)棗類等果樹雜交選育新品種具有重要意義[7]。

1 棗胚敗育類型及特征

棗合子胚和體細(xì)胞胚發(fā)育主要經(jīng)歷了原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等5個(gè)時(shí)期[8]，大多數(shù)棗品種的胚從球形胚期或心形胚期即開始敗育，只有極少數(shù)品種可發(fā)育到成熟胚。棗胚敗育現(xiàn)象普遍存在且極其嚴(yán)重，經(jīng)研究其敗育類型主要有3類[9]： 1) 完全敗育型； 2) 中、小果敗育型； 3) 小果敗育型。第1類型果實(shí)坐果期早，且果實(shí)前期生長速度快；果實(shí)大小不同敗育情況不同，小果敗育可高達(dá)100%；第1類型品種果形較圓，第2類型品種果形較長，第3類型品種果形最長。

棗胚敗育的解剖學(xué)特征發(fā)現(xiàn)[10]，在花后2 d左右小果胚囊萎縮、變小，胚囊內(nèi)有卵細(xì)胞、助細(xì)胞解體痕跡，外珠被有殘留且皺縮；在魚雷胚期外珠被第4層細(xì)胞先出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)變深，并逐漸擴(kuò)大，最后整個(gè)胚細(xì)胞質(zhì)變深，細(xì)胞模糊不清，最終解體。棗胚敗育的形態(tài)學(xué)特征發(fā)現(xiàn)[11]：部分?jǐn)∮推贩N大果的含仁率明顯高于小果，敗育程度較高的棗品種在生長過程中橫徑增長速度大于縱徑增長速度、果形較圓，敗育程度較低的棗品種縱徑增長速度較大、果形較長。

2 棗胚退化或敗育原因分析

胚敗育主要表現(xiàn)為受精前的不親和與受精后的不育，如花粉不萌發(fā)；花粉管不能進(jìn)入柱頭；花粉管即使能進(jìn)入柱頭卻不能到達(dá)子房；花粉管雖然能進(jìn)入子房并順利到達(dá)胚囊，但卻不能完成受精；即使完成受精但胚發(fā)育不完全；以及胚發(fā)育后中途停止等任一階段都有可能導(dǎo)致胚敗育[12]。引起棗胚敗育的原因非常復(fù)雜，可能與內(nèi)源激素表達(dá)水平、胚乳和珠被的發(fā)育、基因突變及蛋白質(zhì)表達(dá)等有關(guān)，目前棗胚敗育的遺傳調(diào)控機(jī)理仍缺乏系統(tǒng)完善的研究。

2.1 內(nèi)源激素

胚胎發(fā)育是植物最重要的發(fā)育過程之一。植物胚胎發(fā)育是在種子內(nèi)進(jìn)行的，不易受外界環(huán)境的影響，但是種子內(nèi)環(huán)境在一定程度上會(huì)影響胚胎發(fā)育。一般情況下，植物同化產(chǎn)物優(yōu)先運(yùn)輸和分配到種子，但其最終分配結(jié)果與激素等因素有關(guān)[13]。在棗果實(shí)發(fā)育過程中，種子和果肉之間存在激烈的營養(yǎng)競爭，種子較高的激素水平可確保其獲得足夠的營養(yǎng)并正常發(fā)育，尤其是在胚胎發(fā)育早期需具有較高的生長促進(jìn)類激素Z、IAA和GA3[13]，反之則可能引起胚退化或敗育。研究發(fā)現(xiàn)，生長促進(jìn)類激素Z、GA3、IAA在棗胚高度敗育品種果肉中的含量明顯高于輕度敗育品種，且果肉吸收養(yǎng)分能力強(qiáng)于幼胚，導(dǎo)致種子可吸收的營養(yǎng)減少，引起棗早期種子敗育[13]。輕度敗育的冬棗種子激素Z含量在坐果后20 d達(dá)到最高值，IAA含量在坐果后40 d達(dá)到最高峰，二者含量遠(yuǎn)高于果肉，而激素GA3含量一直保持很低水平[14]。可見，幼胚中高水平的生長類激素利于胚的早期正常發(fā)育，而果肉中生長類激素水平較高則不利于胚的正常發(fā)育。同時(shí)，棗胚發(fā)育后期種子空癟可能與激素IAA、GA3和ABA虧缺、激素Z的異常累積、尤其是Z/GA3異常增大有關(guān)[13]。這可能是由于IAA、GA3等生長促進(jìn)類激素的不足影響了DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的合成，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的輸入，造成生理代謝紊亂及物質(zhì)能量的虧損，進(jìn)而影響了胚胎的細(xì)胞分裂，使胚不能繼續(xù)發(fā)育而導(dǎo)致早期敗育[15,16]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，胚胎敗育品種的抑制類激素ABA在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期始終高于正常發(fā)育品種[15]?？梢?，相對(duì)較高的內(nèi)源激素IAA含量是誘導(dǎo)胚性細(xì)胞發(fā)生及胚發(fā)育的共同基礎(chǔ)[17-19]。胚是內(nèi)源激素的生產(chǎn)中心，胚的不正常發(fā)育會(huì)引起生長促進(jìn)類激素水平急劇降低，激素的減少或不平衡則進(jìn)一步促使胚發(fā)生退化[20]。

2.2 基因表達(dá)

胚胎發(fā)育是受多基因支配的。目前已知有6類基因與高等植物胚胎發(fā)育相關(guān)[15]： 1) 與頂-基極性格局形成有關(guān)的基因； 2) 控制細(xì)胞類型分化有關(guān)的基因； 3) 控制與胚柄形成的有關(guān)基因； 4) 控制有關(guān)分生組織分化及其特性的基因； 5) 控制成熟編程的有關(guān)基因； 6) 有關(guān)幼苗致死的基因。在這個(gè)由多基因控制的棗胚發(fā)育系統(tǒng)中，如果基因未發(fā)生突變則胚胎發(fā)育正常；如果其中一個(gè)或幾個(gè)基因發(fā)生突變時(shí)，在胚胎發(fā)育某個(gè)階段可能引起其生化過程發(fā)生紊亂或代謝途徑受到阻抑，導(dǎo)致胚胎中途發(fā)生敗育[15,16,21,23]。不同物種之間及同一物種不同品種間存在基因型差異，不同的基因調(diào)控著不同的代謝過程，胚胎敗育時(shí)期、敗育方式和敗育程度也不盡相同[24]。目前，已有與植物胚胎發(fā)育相關(guān)基因被分離并克隆出來，如研究發(fā)現(xiàn)GNOM基因與植物胚胎早期形態(tài)發(fā)生相關(guān)、HOBBIT基因調(diào)控胚根尖分生組織發(fā)育、BIMI基因與胚胎形狀結(jié)構(gòu)相關(guān)、ABI3基因與胚形成數(shù)有關(guān)等[25]，如果這些基因發(fā)生突變或缺失，直接導(dǎo)致胚敗育，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DME母源等位基因突變會(huì)導(dǎo)致胚乳的增大和胚敗育[24]。另外，種胚的內(nèi)源激素表達(dá)及其多種生理作用與胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控關(guān)系密切。但是，關(guān)于棗類胚胎發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控研究較少，僅停留在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生階段，尚無分離出不同發(fā)育階段表達(dá)的基因[16]。

2.3 蛋白質(zhì)調(diào)控

蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者。在植物胚胎發(fā)育的不同階段，特定基因的開啟和關(guān)閉直接導(dǎo)致特異蛋白質(zhì)的出現(xiàn)和消失[26]。植物胚胎發(fā)育過程中特異蛋白的表達(dá)已有不少報(bào)道。在荔枝胚胎發(fā)育的魚雷胚期前后共出現(xiàn)4個(gè)特異蛋白，其中ET1在魚雷胚后期即消失，該蛋白的表達(dá)可能與魚雷胚的分化相關(guān)；ET2、ET3、ET4一直存在至子葉胚，其功能與胚胎發(fā)育的整個(gè)過程有關(guān)，且發(fā)育正常胚珠中蛋白質(zhì)含量均明顯高于敗育胚珠[15]。這可能是由于種胚細(xì)胞分裂受阻，致使RNA、DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子合成及代謝受阻，最終導(dǎo)致胚敗育[25]。研究發(fā)現(xiàn)，胚敗育龍眼在4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期共鑒定出12個(gè)差異相關(guān)蛋白，胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和磷酸甘油酸變位酶3個(gè)蛋白的下調(diào)表達(dá)，影響了種子正常呼吸的物質(zhì)代謝和能量代謝，致使龍眼胚胎敗育[27]。葡萄硫氧還蛋白VvTrx基因在花后40 d表達(dá)量達(dá)到整個(gè)胚珠發(fā)育期的最高水平，且品種無核白的表達(dá)量約為有核黑比諾的5倍，并表達(dá)獲得30 kD的可溶性融合蛋白，表明VvTrx基因及其表達(dá)產(chǎn)物與無核葡萄的胚敗育存在一定關(guān)系[28]。根據(jù)這些研究結(jié)果，推測棗類胚胎敗育與蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控關(guān)系較密切，但目前關(guān)于棗不同發(fā)育階段蛋白質(zhì)表達(dá)的未見報(bào)道。

3 提高棗幼胚發(fā)生的有效措施

3.1 誘導(dǎo)幼胚合成內(nèi)源激素

植物胚在受精后開始發(fā)育，胚囊中的胚乳可以供給胚發(fā)育所需的氨基酸、維生素和激素等特殊營養(yǎng)物質(zhì)[29]。內(nèi)源激素是植物體內(nèi)微量的生理活性物質(zhì)，對(duì)植物胚胎生長發(fā)育起重要的信號(hào)刺激和調(diào)節(jié)作用。內(nèi)源激素含量以及不同激素之間的相互平衡關(guān)系均影響植物胚胎的生長發(fā)育[24]。棗樹種子發(fā)育早期內(nèi)源激素Z、GA3和IAA含量高于果肉，有利于種子早期發(fā)育，尤其是高含量的Z有利于早期胚胎獲得充足營養(yǎng)，以保證原胚發(fā)育；在硬核前后，激素GA3和IAA含量在種子和果肉中均明顯升高，在種子中含量高于果肉，種子得以迅速生長[13]。但是，冬棗種子中高含量的IAA和Z及低水平的GA3更有利于其種胚發(fā)育[14]。在胚發(fā)育過程中，適當(dāng)添加外源植物生長調(diào)節(jié)劑可能會(huì)誘導(dǎo)胚內(nèi)源激素發(fā)生變化。在棗樹盛花初期間隔7 d噴施2次20μl·L-15-ALA，有助于果實(shí)內(nèi)部激素相對(duì)平衡，減少紅棗生理落果[30]。同時(shí)，光照、溫度、水分和養(yǎng)分等環(huán)境因子均可影響內(nèi)源激素的合成[31]，壺瓶棗樹葉片中GA3、ZT含量在雨天>陰天>晴天，且呈上升趨勢，但I(xiàn)AA含量變化不明顯；棗果中GA3含量無明顯變化，ZT含量雨天>陰天>晴天，IAA含量雨天最高，且遠(yuǎn)高于晴天；葉片中IAA含量在晴天與陰天時(shí)均高于果實(shí)，但在雨天時(shí)則低于果實(shí)，棗果中的IAA含量受氣候影響變化顯著[31]。由此可見，可以通過調(diào)節(jié)外部環(huán)境條件誘導(dǎo)棗樹內(nèi)源激素的合成，并誘導(dǎo)內(nèi)源激素在果實(shí)和種胚之間的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，可以在一定程度上減輕棗胚敗育發(fā)生。

3.2 棗胚挽救技術(shù)

胚挽救技術(shù)在阻止棗胚早期退化或敗育、提高種胚萌發(fā)率等方面具有重要作用，已報(bào)道的胚挽救技術(shù)主要有胚的活體轉(zhuǎn)移、活體培養(yǎng)和離體培養(yǎng)[32]。棗胚敗育一般發(fā)生在球形胚、心形胚階段，雖然可以利用胚培養(yǎng)等挽救技術(shù)克服棗胚敗育，但是提高棗幼胚挽救效率目前依舊比較困難，這主要是由于發(fā)生敗育前的幼胚發(fā)育不完全，所需離體培養(yǎng)條件復(fù)雜，幼胚形成幼苗過程較難且較長，導(dǎo)致成苗率低[33]。提高棗幼胚成活率和成苗率的途徑主要有以下幾個(gè)方面。

3.2.1選擇合適的幼胚胚齡

胚齡是從子房授粉開始到胚剝離培養(yǎng)的時(shí)間，胚齡大小直接影響胚培養(yǎng)的結(jié)果[29]。有研究證實(shí)，胚齡越大成苗效果越好，球形期以前的胚其胚齡小，對(duì)其進(jìn)行胚培養(yǎng)幾乎不能存活，心形期、魚雷形、子葉形成期的胚，成苗率則依次提高[29]。對(duì)6月鮮棗花后15 d的幼果接種培養(yǎng)，僅有4.7%的成活率且未能成苗；花后32 d接種的幼胚也未獲得成苗；采用胚乳看護(hù)培養(yǎng)花后52 d的幼胚，其成胚率可達(dá)71.5%，獲得12.4%成苗率；胚齡大于60 d后，其萌發(fā)率和成苗率均顯著提高[34]。棗坐果后30 d內(nèi)的幼胚可繼續(xù)膨大增長成苗；坐果后30～40 d的幼胚多數(shù)先形成愈傷組織后成苗；40 d以后的胚形成愈傷組織幾率降低，但可以直接萌發(fā)成苗；盛花后45 d和55 d的幼胚不易直接成苗[29]，可利用胚挽救技術(shù)助其成苗。可見，胚齡是影響棗幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，一般棗坐果后40～55 d(硬核期)是胚挽救的適宜時(shí)期。

3.2.2配置合適的培養(yǎng)基

棗幼胚培養(yǎng)能否成功另一關(guān)鍵因素在于是否提供給胚合適的營養(yǎng)需要。幼胚對(duì)培養(yǎng)基要求較高，需要復(fù)雜的培養(yǎng)基。常用的基本培養(yǎng)基有MS、B 5、Nitsch培養(yǎng)基。研究發(fā)現(xiàn)，不同棗品種、同一品種胚的不同發(fā)育時(shí)期以及在不同的培養(yǎng)階段，適宜的培養(yǎng)基類型及其配方都不同。梨棗坐果后3～5 d的胚珠在B 5培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，冬棗坐果后10～15 d的胚珠MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果較好[10]；6月鮮棗花后30 d幼胚最適宜的培養(yǎng)基為Nitsch[35]，冬棗坐果后30 d以內(nèi)的幼胚接種在MS培養(yǎng)基上，可以采取增加滲透壓、添加蛋白等途徑促使胚繼續(xù)膨大增長[36]。張存智對(duì)棗幼胚培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)[29]，幼胚萌動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)胚狀體培養(yǎng)、愈傷組織轉(zhuǎn)接培養(yǎng)、生根培養(yǎng)均采用MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織、誘導(dǎo)棗胚直接萌發(fā)成苗采用Nitsch培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的IAA、BA、IBA等生長激素、以及蔗糖、瓊脂等物質(zhì)，幼胚培養(yǎng)效果較好。由此可見，在棗胚培養(yǎng)的不同階段，采用的基本培養(yǎng)基不同，并且在基本培養(yǎng)基上適當(dāng)添加蔗糖、瓊脂和部分激素，這些物質(zhì)不僅可以提供胚發(fā)育需要的營養(yǎng)，更重要的是滿足其適宜的滲透壓環(huán)境，促使胚分生增長。因此，在棗幼胚發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，滿足其營養(yǎng)條件和生長條件，可以在一定程度上挽救胚敗育發(fā)生。

3.2.3適宜的激素配比

體外培養(yǎng)幼胚，經(jīng)常需要添加植物生長激素來促進(jìn)細(xì)胞分化、脫分化和再分化，不同激素及其不同配比，對(duì)胚生長的誘導(dǎo)效果不同[37]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的棗胚在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上可正常萌發(fā)成苗，而未成熟胚的萌發(fā)成苗率為零，棗幼胚培養(yǎng)需要添加低濃度的生長素及細(xì)胞分裂素來促進(jìn)其分裂增殖[29]。因此，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑是幼胚培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[33]。6月鮮棗花后30 d幼胚在含有1.0 mg·L-1ZT、0.6 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，ZT或IAA濃度的增加和減少都使幼胚萌發(fā)率下降，不利于幼胚的生長發(fā)育[35]。采用MS培養(yǎng)基對(duì)棗樹增殖培養(yǎng)，其最佳啟動(dòng)、增殖、生根培養(yǎng)基中附加的激素種類和配比分別為BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.01～0.1 mg·L-1、BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA 0.5 mg·L-1、BA 0.01 mg·L-1+IBA 2.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1[38]，激素類型和配比均有別。在NAA 0.015 mg·L-1+ZT 1.75 mg·L-1+KT 4.0 mg·L-1配比條件下，棗樹愈傷組織不定芽分化再生頻率較高[39]。在Nitsch基本培養(yǎng)基上，附加BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1誘導(dǎo)棗幼胚愈傷組織效果較好?？梢?，植物生長激素種類、含量、生長素與細(xì)胞分裂素的比值等是影響棗樹幼胚發(fā)育、誘導(dǎo)愈傷組織形成和不定根分化的重要因素[39]。在適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加一定濃度和配比的植物生長激素，對(duì)于提高棗幼胚的挽救效率是至關(guān)重要的[33]。

3.2.4培養(yǎng)環(huán)境條件

離體棗胚培養(yǎng)需要提供類似于胚乳的可供幼胚發(fā)育及萌發(fā)的適宜條件。不僅要具備培養(yǎng)基、激素等營養(yǎng)條件，還需要適宜的外界環(huán)境條件。培養(yǎng)溫度對(duì)棗胚培養(yǎng)的影響最大。研究發(fā)現(xiàn)，棗胚培養(yǎng)的最佳溫度為18～21 ℃，在此條件下培養(yǎng)胚珠膨大率達(dá)93.3%、胚萌發(fā)率為71.4%、正常胚比率為60%，褐化現(xiàn)象較輕；在2～4 ℃低溫處理?xiàng)椗?0 d有利于其直接萌發(fā)成苗[29]。植物離體培養(yǎng)中外植體很容易褐化死亡，這可能是由于外植體含有的酚類物質(zhì)易被氧化產(chǎn)生棕褐色的醌類物質(zhì)，使組織呈現(xiàn)褐色，進(jìn)而抑制外植體生長，并導(dǎo)致其死亡[10]?？梢姡乐雇庵搀w褐變死亡是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入適量活性炭可以減輕褐化現(xiàn)象。低濃度(1～3 g·L-1)的活性炭不僅可以有效防止外植體發(fā)生褐變，而且可以促進(jìn)胚萌發(fā)、正常胚形成以及成苗，而高濃度(4 g·L-1)的活性炭則不利于正常胚萌發(fā)和成苗[10]。此外，還可添加一些對(duì)幼胚生長有益的天然復(fù)和物，如椰乳、黃瓜汁、西瓜汁等復(fù)合物，如在冬棗幼胚培養(yǎng)中附加0.8 mg·L-1的水解乳蛋白，可顯著提高胚培養(yǎng)中正常胚的比率及成苗率[10]?？梢?，利用離體培養(yǎng)技術(shù)挽救棗胚不僅需要適宜的營養(yǎng)條件促進(jìn)棗胚培養(yǎng)發(fā)育，還需要合適的環(huán)境條件防止棗胚褐變死亡，促進(jìn)胚發(fā)育成苗。

4 小結(jié)與展望

棗胚敗育極其嚴(yán)重，對(duì)優(yōu)良雜交品種選育影響較大。目前，關(guān)于棗胚發(fā)育及敗育的研究日益重視，尤其是在棗胚敗育的特征、影響因素等方面研究得較為清晰，但是關(guān)于棗胚敗育的生理與分子機(jī)制方面有待于進(jìn)一步研究。因此，今后關(guān)于棗胚敗育的研究應(yīng)在生理生態(tài)研究基礎(chǔ)上，加大胚胎敗育相關(guān)基因表達(dá)研究，以及激素等蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控研究，進(jìn)一步探索棗胚敗育的內(nèi)在機(jī)制。同時(shí)，棗胚敗育機(jī)理研究還要生產(chǎn)實(shí)踐緊密結(jié)合，在關(guān)鍵生育階段及時(shí)采取措施調(diào)控棗胚內(nèi)源激素表達(dá)，以及利用胚挽救技術(shù)等手段提高棗胚存活率，為利用雜交育種方法培育棗新品種提高一定的理論依據(jù)。