烏拉特肋脈野豌豆無菌扦插擴繁技術研究

伊風艷，楊 鼎，展春芳，閆曉紅，王慧敏，邱 曉，孫海蓮

(1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，呼和浩特 010031；2.中國科學院內蒙古草業(yè)研究中心，呼和浩特 010031)

烏拉特肋脈野豌豆(ViciacostataLedeb. cv. Wulate)是豆科野豌豆屬多年生草本植物，是從內蒙古烏拉特中旗地區(qū)采集，經過引種馴化，選育而成的牧草新品種[1]。其葉量豐富，營養(yǎng)價值高，抗逆性強，在年降雨量為100～250 mm的北方荒漠草原帶能夠生長，是荒漠草原區(qū)旱作人工草地建立、改良荒漠草原天然草場和草原植被恢復的優(yōu)良種質資源[2,3]。烏拉特肋脈野豌豆屬野生種，雖保留了珍貴的野生種質特性，但自身也有一些缺點，如：落粒性強導致種子收獲產量低、種源缺乏，種子硬實導致發(fā)芽率過低等，限制了肋脈野豌豆在生產中的推廣應用[4]。因此，提高肋脈野豌豆種子產量及繁殖系數有著重要的理論價值及現實意義。

無菌扦插擴繁技術是指以帶葉芽的無菌莖段為外植體，利用植物組織細胞的分生能力，進行完整植株誘導的一種技術。通過扦插快繁途徑，不僅保持了母系的優(yōu)良性狀，而且在短時間內可獲得擴繁植株，達到快速增殖的目的[5]。這個過程不經過愈傷組織階段，培養(yǎng)過程簡單，成苗快，遺傳性狀穩(wěn)定，適用范圍大，對促進良種選育及種苗繁殖推廣具有重要意義。因此，本研究以烏拉特肋脈野豌豆無菌苗莖段外植體，對成苗擴繁、生根及移栽技術等方面開展研究，旨在建立肋脈野豌豆無菌扦插擴繁技術，為肋脈野豌豆大批量育苗生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于內蒙古農牧業(yè)科學院綜合試驗示范中心原種圃，成熟期采集整理后貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基

采用固體培養(yǎng)基，基本成分為MS，包含瓊脂，蔗糖，激素，pH值為5.90。

1.2.2無菌苗培養(yǎng)

選取飽滿有光澤的肋脈野豌豆種子，刀片切割之后，在流水條件下沖洗50 min，濾紙吸干種子表面水分，在超凈工作臺上用70%酒精處理1 min，無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液進行滅菌，滅菌時間設6、8、10、12、14 min共5個處理。在處理過程中不斷攪動溶液，使種子表面與滅菌劑充分接觸。處理完之后用無菌水沖洗4次后，無菌濾紙吸干種子表面水分，接種到MS和1/2 MS固體培養(yǎng)上，每瓶接種4～6粒，觀察無菌苗生長情況。

表1 不同激素配比對肋脈野豌豆扦插莖段生長的影響

1.2.3無菌苗初代培養(yǎng)

肋脈野豌豆長至10 cm后，在超凈工作臺上剪取長1～2 cm帶葉腋芽的莖段，扦插到已配置好的含不同質量濃度的6-芐氨基腺嘌呤(0～1 mg·L-1)和吲哚丁酸(0～1.5 mg·L-1)的誘導分化培養(yǎng)基上。接種時基段的生物學上端朝上，生物學下端插入培養(yǎng)基中。每瓶培養(yǎng)基接種4～6個基段，每個處理接種20瓶。接種完畢后將材料放置于(25±1)℃下，光照條件為光/暗(12 h/12 h)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4無菌苗繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)的目的是擴繁植株，進而獲得大量適合生根的無菌苗。初始外植體經過一段時間培養(yǎng)，待長成大于5 cm的健壯小植株后，進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)中幼苗分化最佳培養(yǎng)基。

1.2.5完整植株的誘導

在超凈工作臺上，當分化產生的不定苗至3 cm以上后，接種于配置好的培養(yǎng)基上，進行完整植株的誘導試驗。誘導根系培養(yǎng)基包括0～1.4 mg·L-1NAA、質量分數0.7%的瓊脂和質量分數3%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基。每瓶培養(yǎng)基接種4個幼苗，每個處理接種40瓶。接種完畢后將材料放置于(25±1)℃下，光照條件設置為光/暗(12 h/12 h)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6煉苗及移栽

將已形成完整植株的部分三角瓶封口膜去掉，用鑷子輕輕的將瓶底培養(yǎng)基打碎，切記勿傷到根系，向三角瓶中加入無菌水，開口狀態(tài)下在室內放置2 d后，從瓶中取出幼苗，洗凈根部培養(yǎng)基；將開口放置2 d的幼苗和未開口放置的完整無菌苗移栽到沙土∶營養(yǎng)土=2∶1的混合土中，覆上遮陰網，保濕保溫9～12 d，待幼苗緩苗后，去掉遮陰網，保持適當濕度，2周后分別統(tǒng)計幼苗移栽成活率。

1.3 統(tǒng)計分析

無菌苗培養(yǎng)20 d后進行根系誘導培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計生根率。統(tǒng)計結果采用Excel、SAS軟件進行數據整理與分析，生根率和移栽成活率按以下公式計算：

生根率(%)=(生根苗數/處理總苗數)×100%；

移栽成活率(%)=(成活的分化苗數/總分化苗數)×100%。

2 結果與分析

2.1 無菌苗培養(yǎng)條件分析

無菌苗的培養(yǎng)是試驗順利開展的關鍵。肋脈野豌豆種子滅菌試驗的結果表明，當HgCl2氯化汞濃度為0.1%，消毒時間設置為6 min，接種培養(yǎng)基后，種子在培養(yǎng)一段時間后開始滋生細菌，消毒8 min后，種子在萌發(fā)過程中未出現細菌，效果較好，但消毒時間達10 min以上，雖然無細菌滋生，但對種子產生一定的毒害作用，部分種子不能萌發(fā)。研究中發(fā)現，基本培養(yǎng)基的含量對種子的萌發(fā)和幼苗生長沒有明顯的影響。

2.2 不同激素濃度對肋脈野豌豆無菌扦插擴繁成苗誘導效果分析

肋脈野豌豆帶葉腋芽的莖段扦插在含不同生長調節(jié)物質濃度組合的培養(yǎng)基一定時間后，均能形成幼苗，但幼苗生長狀況差異顯著。觀察中發(fā)現，低濃度的6-BA配合比其濃度高的IBA，莖段形成的幼苗生長快，且幼苗較健壯，葉片無玻璃化現象，隨著6-BA濃度的增加，幼苗長勢減弱，尤其是在高濃度的6-BA和低濃度的IBA激素配比下的培養(yǎng)基中，幼苗長勢差，葉片發(fā)黃且產生玻璃化現象。綜合以上結果，選擇0.5 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA作為肋脈野豌豆無菌苗擴繁培養(yǎng)基的激素配比。

表2 肋脈野豌豆完整植株誘導效果

注：a為肋脈野豌豆無菌苗；b為莖段扦插；c為分化苗；d為生根苗；e為花盆移栽苗；f為大田移栽苗。圖1 肋脈野豌豆無菌擴繁成苗過程

2.3 肋脈野豌豆無菌扦插擴繁根系誘導效果分析

將繼代增殖后長度大于3 cm的幼苗置于含不同NAA激素濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d后部分幼苗逐漸長出少量的根系，培養(yǎng)約40 d后，大部分幼苗已形成完整植株(圖1 d)。NAA濃度對肋脈野豌豆無菌苗生根的影響見表2。觀察中發(fā)現，低濃度的NAA對根系誘導效果不顯著，且無菌苗長勢較差或一般，部分未生根幼苗出現萎蔫甚至死亡。隨著NAA濃度的增加，根系誘導率顯著提高，幼苗長勢良好。當NAA質量濃度達到0.8 mg·L-1時，無菌苗生根率可達68%，且幼苗生長健壯，未出現黃化現象，但濃度繼續(xù)升高，幼苗生長狀況則變差，生根率降低，生根受到抑制，說明低濃度和高濃度的NAA均不利于肋脈野豌豆無菌苗根系的誘導。因此，肋脈野豌豆無菌苗最適根系誘導培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂。

2.4 肋脈野豌豆煉苗移栽效果

試驗表明，肋脈野豌豆無菌生根苗直接進行移栽，幼苗成活率較低，多數幼苗慢慢會出現枯萎現象，根系極易發(fā)霉腐爛。而出瓶前在室內開瓶馴化2 d后移栽，其移栽成活率較高，達80%以上，這可能是開口馴化減少了幼苗接觸外界污染的面積，在馴化過程中對外界污染形成了一定的抵抗力，而直接移栽幼苗直接接觸外界污染，對污染的抵抗力較低，故影響了移栽成活率。因此，開口馴化2 d，移栽到基質為沙土∶營養(yǎng)土=2∶1的塑料盆中，有效控制溫度、光照及空氣濕度，保濕保溫9～12 d，幼苗成活率較好。

3 討 論

無菌外植體的獲得是組織培養(yǎng)成功的第一步，外植體的接種成功與否，主要取決于消毒方式[6]。目前，NaClO或HgCl2等藥劑在對植物體消毒處理上利用的比較廣泛[7-9]。但不同的植物及外植體因生長狀態(tài)及生存環(huán)境不同，對藥劑處理的敏感性不同，因此藥劑處理時間和處理濃度的控制尤為重要。本研究中，肋脈野豌豆種子經70%的酒精進行前處理后，在0.1%的HgCl2溶液中消毒8～10 min，種子萌發(fā)效果較好，且無細菌滋生，處理6 min，培養(yǎng)一定時間后部分種子表面開始滋生細菌，進而整個培養(yǎng)基被全部感染，而培養(yǎng)時間過長，發(fā)現種子萌發(fā)率明顯降低，推測可能是處理時間過長對種子內部組織造成嚴重損傷，進而導致種子喪失活力，不能萌發(fā)。

生長調節(jié)劑是植物離體培養(yǎng)中器官發(fā)生和增殖的主要影響因素，雖用量甚微，但在植物組織培養(yǎng)中起著重要的調節(jié)作用[10,11]。本試驗選用6-BA和IBA組合對肋脈野豌豆莖段進行芽增殖誘導，各處理均能使莖段芽增殖，但芽生長勢卻明顯不同。高濃度6-BA下，莖段雖然能夠分化出幼苗，但幼苗長勢差，尤其是配合低濃度的IBA，幼苗易形成玻璃化，而低濃度的6-BA配合較高濃度的IBA莖段芽的增殖快且植株表現良好，無玻璃化現象。說明低濃度的6-BA能減少玻璃化現象的發(fā)生。這與韓淑蘭等[12]的結論相符。

組培苗的生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，是快速繁殖組培的有力保證。目前，關于組培苗生根國內外學者也做了大量的研究[13-15]。組培中根系的發(fā)育過程需要外源激素和培養(yǎng)條件等環(huán)境因素的共同作用[16]，且不同的培養(yǎng)基，組培苗的生根存在一定的差異[17]。外源激素中生長素是促進組培苗生根的主要激素，能調節(jié)細胞分裂周期實現細胞的有序分裂,與根原基的發(fā)端密切相關[18,19]。研究表明，外源激素的配比及濃度對無菌苗生根起到關鍵作用[20,21]。本研究中，選擇大部分的生根實驗中采用1/2 MS培養(yǎng)基[6,22]，添加不同濃度的NAA誘導根系形成。結果表明，低濃度的NAA對生根均具有一定的促進作用，但促進作用不明顯，隨著NAA濃度的升高，根系誘導率明顯增加，當NAA濃度達到0.8%時，根系誘導率達68%，且根系較健壯，幼苗長勢良好，隨著NAA濃度的繼續(xù)增加，根系誘導率呈下降趨勢，由此說明NAA濃度過高或過低均不利于肋脈野豌豆無菌苗根系的誘導形成。

組培苗成功移栽是組培的最后一個環(huán)節(jié)，也是關系成敗的重要環(huán)節(jié)之一，移栽不當組培苗容易染菌，直接影響組培苗的成活率。本研究發(fā)現,煉苗對肋脈野豌豆組培苗移栽成活率的影響較大，未經過煉苗的肋脈野豌豆移栽成活率僅為24.57%，而經過2 d煉苗，成活率可達80%以上，且移栽后的幼苗生命力旺盛，長勢良好。