DNA-Cu(II)復(fù)合物應(yīng)用于糧食中銅的檢測

王素利，費(fèi)華熙，周燦，葉宸志，蔣文蘋

(重慶食品工業(yè)研究所，重慶，400042)

銅是人體必需的微量元素，對維持人體正常的生理功能具有重要作用[1]。銅在機(jī)體內(nèi)多以含銅蛋白的形式存在，參與免疫反應(yīng)、神經(jīng)功能、骨骼代謝、造血系統(tǒng)、抗氧化功能等一系列活動[2]。當(dāng)銅攝入量過低時，可能會引起冠心病或骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生；但過量攝入則可能造成腸道紊亂，以及大腦、肝臟、腎臟的損傷，甚至引發(fā)阿爾茨海默病、帕金森癥等[3],因此檢測食品中的銅含量十分必要。

目前食品中銅含量的測定方法主要有石墨爐原子吸收光譜法(graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS)[4-5]、火焰原子吸收光譜法(flame atomic absorption spectrophotometry，F(xiàn)AAS)[6-8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)[9-10]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES)[11-13]等。這些方法雖然檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可信度高，但需要昂貴的大型精密儀器，對分析實(shí)驗(yàn)室和操作人員的要求較高，難以滿足小規(guī)模企業(yè)日常生產(chǎn)監(jiān)測的需要。因此開發(fā)出一種簡單易行、操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確的銅檢測方法具有十分重要的意義。比色檢測法因其操作簡單方便、檢測成本低、檢測結(jié)果可用肉眼判斷等優(yōu)點(diǎn)，而備受研究人員的關(guān)注[14-15]。

GHODAKE等[16]發(fā)現(xiàn)，Cu2+與酪蛋白肽功能化的Ag納米顆粒發(fā)生配位反應(yīng)，可使得Ag納米顆粒產(chǎn)生集聚，導(dǎo)致溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色，由此開發(fā)了一種Cu2+的比色檢測方法。吳亮亮等[17]通過對Ag/Pt納米簇的表面修飾調(diào)控其催化活性，建立了一種高靈敏的比色法檢測Cu2+。梅曉宏等[18]建立了一種基于雙重脫氧核酶的生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)Cu2+的裸眼可視化檢測。LI等[19]利用Cu2+與特殊序列的DNA的配位作用構(gòu)建了具有類過氧化物酶活性的DNA-Cu(II)復(fù)合物，以此催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)-H2O2發(fā)生顯色反應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)Cu2+的可視化檢測。

目前，文獻(xiàn)中建立的Cu2+比色檢測方法多數(shù)用于水樣品中Cu2+的檢測[16-19]，應(yīng)用范圍有限或者僅處于研究開發(fā)階段。因此，考察新開發(fā)的檢測方法能否適用于復(fù)雜基體中Cu的檢測，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有重要的實(shí)際意義。本文在已有文獻(xiàn)研究[19]的基礎(chǔ)上，采用干法灰化法對糧食樣品進(jìn)行預(yù)處理，考察DNA-Cu(II)復(fù)合物應(yīng)用于糧食中Cu的檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

ELX-800酶標(biāo)儀，BioTek；TAS-990原子吸收分光光度計，北京普析通用公司；UPTA-20超純水機(jī)，邦西儀器科技有限公司；SHH-250L恒溫培養(yǎng)箱，重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠；高速臺式離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器儀表公司；JA3003A電子分析天平，上海精天電子儀器有限公司；DL-1電爐，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；SX2-12-10Z箱式電阻爐，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

本實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿、坩堝等均用體積分?jǐn)?shù)20% HNO3溶液浸泡過夜，自來水反復(fù)沖洗后，用一級水沖洗干凈。

1.2 主要材料與試劑

GBW(E)100195小麥粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)100196玉米粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)100194大米粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW10055大豆粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國計量科學(xué)研究院；10種糧食樣品購自重慶某超市。

一級水(符合GB/T 6682—2008一級水要求)，自制；鹽酸(優(yōu)級純)、H2O2(30%，分析純)，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；KH2PO4(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；Cu、Cr、Ni、Zn、Pb、Ca、Mn標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)，Inorganic Ventures；Ma、Cd,標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)、Al標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L),K、Fe、Mg標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)，中國計量科學(xué)研究院國家有色金屬及電子材料分析測試中心；TMB(純度≥99.0%)DNA核酸序列RET1：A(G4C)3G5C、RET2：GC5(GC4)3T(ULTRAPAGE純化)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

DNA溶液的配制：將DNA凍干粉用一級水漩渦振蕩溶解，取等量的RET1溶液和RET2溶液混合，經(jīng)退火后，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(RET1-RET2)，雙鏈DNA配制濃度為50 μmol/L；緩沖溶液為100 g/L KH2PO4溶液；TMB溶液為5 mmol/L乙醇溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Cu2+的檢測

向微孔板中依次加入100 μL緩沖溶液、20 μL DNA溶液、20 μL不同質(zhì)量濃度的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕振蕩混勻；再加入20 μL TMB溶液，混勻后加入20 μL H2O2，振蕩混勻后，25 ℃避光環(huán)境反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行630 nm/450 nm雙波長檢測，測定各孔吸光度。

1.3.2 選擇性和干擾性實(shí)驗(yàn)

選擇性實(shí)驗(yàn)：用10倍濃度的其他常見金屬離子Na+、K+、Cr3+、Cd2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+(4.0 μg/mL)代替上述Cu2+檢測方法加入的0.4 μg/mL Cu2+，其他步驟同1.3.1，考察該方法的選擇性。

干擾性實(shí)驗(yàn)：將一定量的其他常見金屬離子Na+、K+、Cr3+、Cd2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，配制成Cu2+質(zhì)量濃度為0.4 μg/mL，其他金屬離子質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL的混合離子溶液。將混合離子溶液代替上述Cu2+檢測方法加入的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟同1.3.1，考察在有其他離子存在下該方法的抗干擾能力。

1.3.3 實(shí)際糧食樣品分析

稱取粉碎后試樣0.5～5 g(精確至0.001 g)于坩堝中，將坩堝置于電爐上以小火加熱使試樣充分炭化至無煙，然后置于高溫爐中，在(550±25)℃灼燒4 h。冷卻取出，對于灰化不徹底的試樣，加數(shù)滴HNO3，小火蒸干后，再轉(zhuǎn)入高溫爐中繼續(xù)灼燒，至試樣呈白灰狀，冷卻后取出，用1 mL體積分?jǐn)?shù)50% HCl溶液溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，用一級水定容至25 mL刻度線,同時做試劑空白試驗(yàn)。

在與1.3.1相同的實(shí)驗(yàn)條件下，將Cu2+標(biāo)準(zhǔn)品溶液替換為空白溶液和試樣溶液，測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中Cu的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程計算出樣品中Cu的濃度。檢測過程中Cu2+濃度需在標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍內(nèi)，如超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最大濃度，需稀釋后重新測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在實(shí)驗(yàn)條件下，測定不同Cu2+質(zhì)量濃度下反應(yīng)體系的吸光度值，Cu2+質(zhì)量濃度在0～1.0 μg/mL范圍內(nèi)與反應(yīng)體系所測吸光度值符合二次函數(shù)關(guān)系，曲線回歸方程為：y=-0.173 5x2+0.431 6x+0.004 1，R2=0.998。

2.2 檢出限的確定

平行測定20次空白值，計算出吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，將3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相對應(yīng)的濃度，即為檢出限。由此計算出本方法的檢出限為0.01 μg/mL，當(dāng)稱樣量為1.0 g，定容體積為25 mL時，方法的檢出限為0.25 mg/kg，與GB 5009.13—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測定》[20]第二法火焰原子吸收光譜法中的檢出限相當(dāng)。

2.3 選擇性和干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

如圖1-a所示，在反應(yīng)條件下，高濃度的其他金屬離子的吸光度值遠(yuǎn)小于Cu2+，這說明該反應(yīng)體系對于Cu2+具有特定的識別能力。干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-b所示，在10倍濃度其他離子存在的情況下，反應(yīng)后的吸光度值相對單獨(dú)的Cu2+并未發(fā)生顯著性變化，說明該反應(yīng)體系具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

a-金屬離子(質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL)反應(yīng)后吸光度值b-混合離子(含0.4 μg/mL Cu2+和4.0 μg/mL其他金屬離子)反應(yīng)后吸光度值圖1 選擇性和干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of selectivity and interference

2.4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取10種常見糧食樣本(大米、小米、小麥、玉米、紅豆、燕麥、花生、大豆、芝麻、土豆)，各樣本分別加入適當(dāng)不同質(zhì)量濃度的Cu標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作為低、中、高值的陽性樣本。前處理過程相同，采用本實(shí)驗(yàn)方法與GB 5009.13—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測定》[20]中第二法火焰原子吸收光譜法進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。同一樣品平行測定3次，取其平均值作為檢測結(jié)果，檢測結(jié)果見表1。

采用配對t檢驗(yàn)法比較2種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異[21]。在95%的置信度下，計算得到tD= 0.226，查t分布表可知，t0.05,29=2.045，tD

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用本實(shí)驗(yàn)方法分別對小麥粉、玉米粉、大米粉、大豆粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行6次重復(fù)測定，考察本方法的精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 本方法與火焰原子吸收法測定結(jié)果比較Table 1 Comparison between the results of this method and FAAS

表2 精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 The test results of precision

根據(jù)GB/T 27404—2008[22]附錄F：檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求規(guī)定，被測組分含量在0.1～1 mg/kg時，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)≤ 11%；被測組分含量在1～10 mg/kg時，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)≤ 7.5%，被測組分含量在10～100 mg/kg時，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)≤5.3%。真值含量在0.01～10 mg/kg時，測定含量平均值與真值的偏差指導(dǎo)范圍為-20%～+10%。本實(shí)驗(yàn)方法測量結(jié)果能夠滿足上述要求。

另外，NY 861—2004[23]規(guī)定谷物及制品中Cu的限量≤10 mg/kg，豆類及制品中、薯類制品中Cu的限量≤20 mg/kg，鮮薯類中Cu的限量≤6 mg/kg。當(dāng)稱樣量為1.0 g，定容體積為25 mL時，上述最大限量對應(yīng)的Cu2+的質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、0.24 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)方法測量范圍能夠滿足上述要求。

若無酶標(biāo)儀設(shè)備，也可采用目測法進(jìn)行半定量判定，即將反應(yīng)后的樣品比色杯與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比對，得到樣品溶液的近似濃度，進(jìn)而計算出樣品中Cu的大致含量，可用于對大批量樣品進(jìn)行快速篩查。

3 結(jié)論

基于DNA-Cu(II)復(fù)合物的類過氧化物酶活性，本文采用干法灰化法對糧食樣品進(jìn)行預(yù)處理，建立了糧食中Cu的比色檢測方法。通過對標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、準(zhǔn)確性、精密度等的考察，證實(shí)了該比色檢測方法應(yīng)用于糧食中Cu含量檢測的可行性。但此方法能否適用于基質(zhì)更加復(fù)雜的樣品尚未可知，今后工作擬考察該方法應(yīng)用于果蔬樣品、動物性食品等各類樣品中Cu含量檢測的可行性，以期進(jìn)一步擴(kuò)大其適用范圍。