藥物體外肝代謝研究方法

李 蘭 張丹參

河北科技大學(xué)，石家莊，050018，中國

藥物代謝是指機(jī)體對藥物在體內(nèi)的處置過程，其中包括吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和排泄（excretion）4 個階段［1］。其中藥物代謝及轉(zhuǎn)化的主要器官為肝臟，是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要場所，是富含參與藥物代謝的一個龐大的依賴細(xì)胞色素P450 的混合功能的氧化酶系統(tǒng)，藥物的Ⅰ相反應(yīng)（官能團(tuán)反應(yīng)）和Ⅱ相反應(yīng)（結(jié)合反應(yīng)）都是在肝藥酶系統(tǒng)的參與下發(fā)生的。體外藥物肝代謝與體內(nèi)代謝相比，有許多的優(yōu)點：①可排除體內(nèi)諸多的干擾因素，直接觀察代謝酶對底物的選擇性代謝；②體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化率低且檢測手段不靈敏；③體外代謝研究具有簡便快速的特點，適合大量化合物的藥動學(xué)篩查；④不需消耗較多的樣品和實驗動物，研究費(fèi)用相對較少［2］。通過追蹤藥物化學(xué)成分在體內(nèi)代謝的過程，結(jié)合藥理活性的研究，有助于闡明藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制，藥物的體外代謝研究在提高藥物療效、安全合理用藥、新藥研發(fā)等方面的意義不可忽視。實驗研究中心常用的體外肝代謝方法主要有肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝灌流技術(shù)、肝組織切片技術(shù)、基因重組P450 酶系等［3-4］，并廣泛的應(yīng)用于藥物毒理學(xué)、藥動學(xué)及藥效學(xué)的研究中，根據(jù)不同的要求和目的加以選擇和利用，可達(dá)到理想效果?，F(xiàn)對常用的體外肝代謝研究方法進(jìn)行綜述，以期為藥物體外肝代謝研究方法在新藥研發(fā)中的應(yīng)用提供參考價值。

1 肝微粒體體外溫孵法

肝微粒體體外溫孵實驗是一種利用差速離心技術(shù)從動物肝臟中提取肝微粒體，并加入還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）或尿苷二磷酸葡糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid，UDPGA），在體外模擬生理環(huán)境下進(jìn)行代謝反應(yīng)。肝微粒體體外溫孵法與其他體外肝代謝方法相比具有酶制備技術(shù)簡便、代謝過程迅速、實驗結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)良等特點，此方法可用于藥物酶的抑制及體外代謝清除等實驗研究中，但是肝微粒體體外溫孵法的不足之處是對于體內(nèi)代謝情況的一致性存在質(zhì)疑。

Jing Su 等［5］運(yùn)用體外肝微粒體孵育法鑒定迷迭香酸（rosmarinic acid）的代謝物，在NADPH 或UDPGA的存在下進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，通過高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進(jìn)行分析共檢測到14 種代謝物，其中葡萄糖醛酸作用是主要的代謝途徑。

Juan Yang 等［6］采用電化學(xué)與在線四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（EC/Q-TOF/MS）聯(lián)用技術(shù)，研究丹參樣品中5 種酚酸（迷迭香酸、丹酚酸C、石香酸、丹酚酸香B、原兒茶醛）的氧化轉(zhuǎn)化和代謝途徑。

李玥等［7］探討了丹參酮成分對膽汁酸對小鼠肝微粒體羥基化的抑制作用，研究結(jié)果表明，丹參酮對膽汁酸在小鼠肝微粒體中的羥基化代謝有抑制，其中二氫丹參酮Ⅰ起主要作用，臨床使用含有二氫丹參酮Ⅰ制劑時應(yīng)關(guān)注其引起膽汁淤積癥的風(fēng)險。

Takashi Isobea 等［8］研究了人、猴、大鼠和小鼠的肝和腸微粒體中柚皮苷的葡萄糖醛酸苷化作用，研究結(jié)果表明人肝和腸微粒體中7 糖苷酸的動力學(xué)遵循Michaelis-Menten 模型。小鼠肝臟和腸微粒體的動力學(xué)也遵循Michaelis-Menten 模型，而猴和大鼠肝臟的動力學(xué)微粒體符合雙相模型。猴子和大鼠腸道微粒體的動力學(xué)分別符合Michaelis-Menten 模型和底物抑制模型。CLint 值為小鼠＞猴子＞大鼠＞人肝微粒體，小鼠＞大鼠＞猴子＞人腸微粒體。在4’-葡萄糖醛酸化中，人肝微粒體以及猴肝和腸微粒體的活性可忽略不計或非常低。大鼠和小鼠肝微粒體的動力學(xué)分別遵循雙相模型和Michaelis-Menten 模型。對于肝微粒體，CLint值為大鼠＞小鼠，對于腸道微粒體，大鼠＞小鼠＞人。在靈長類動物和嚙齒動物中，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）對肝和腸中柚皮苷的代謝能力和區(qū)域選擇性通常有所不同。

2 肝勻漿體外溫孵法

為了使操作過程更加簡便，直接采用肝臟勻漿的方法，將藥物加入到肝勻漿溶液中，考察其在肝勻漿的代謝情況來說明藥物在肝臟中的代謝情況。

解立科等［9］建立了HPLC-Q-TOF/MS 法來研究黃芩苷和黃芩素在體外肝勻漿和腸道菌中的代謝情況，并發(fā)現(xiàn)黃芩素和黃芩苷及其18 個代謝物，其中黃芩苷和黃芩素共有的代謝物有12 個（黃芩素、黃芩苷、黃芩素羥基化產(chǎn)物、黃芩素糖基化產(chǎn)物、黃芩素脫羥基產(chǎn)物、黃芩素糖基化甲基化產(chǎn)物、黃芩素的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物、黃芩素糖基化產(chǎn)物、黃芩素羥基化甲基化產(chǎn)物、黃芩素同分異構(gòu)體、黃芩素羥基化甲基化產(chǎn)物、黃芩素甲基結(jié)合物），黃芩苷肝勻漿孵育液中只存在黃芩素甲基化葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、黃芩苷脫羥基反應(yīng)產(chǎn)物、黃芩苷同分異構(gòu)體、黃芩素的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物，代謝物黃芩素脫水反應(yīng)產(chǎn)物只存在于黃芩素肝勻漿孵育液中。結(jié)果表明黃芩苷和黃芩素的肝臟代謝過程中既有相似性，又有差異性。

孫會仙等［10］應(yīng)用反相高效液相色譜法研究胸腺素α1（thymosin α1，Tα1）不同位點修飾PEG 聚合物的體外肝勻漿酶的穩(wěn)定性，研究表明Cys 替換的TC 系列結(jié)構(gòu)修飾物的半衰期均＜Tα1，表明TC 系列更易被肝勻漿代謝；但同一位點PEG 聚合物修飾的PT 系列結(jié)構(gòu)修飾物的半衰期均遠(yuǎn)＞TC 系列，表明Cys 位點PEG 化后修飾物更加穩(wěn)定。

3 肝細(xì)胞體外溫孵法

肝細(xì)胞體外溫孵法同肝微粒體體外溫孵法相似，利用制備的肝細(xì)胞輔以氧化還原型輔酶，模擬人體生理溫度及生理環(huán)境進(jìn)行的代謝方法，該方法適合研究蛋白及mRNA 水平藥物代謝酶誘導(dǎo)及酶活性，被廣泛用于評估藥物代謝過程中藥物間的相互作用。

Vacek J 等［11］利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞懸液溫孵法研究了槲皮素、蘆丁、異槲皮素和花旗松素的體外代謝，運(yùn)用高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜法分析鑒定了其代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示，這4 種黃酮類化合物體外肝代謝的主要產(chǎn)物為甲基黃酮醇和葡萄糖苷酸化產(chǎn)物。在孵育的24 h 過程中花旗松素的平均生物轉(zhuǎn)化率最高，為52.45%，主要被轉(zhuǎn)化為硫酸結(jié)合物；槲皮素和花旗松素比蘆丁和異槲皮苷在原代肝細(xì)胞懸液中更容易發(fā)生代謝。

顧融融等［12］考察高/低糖培養(yǎng)濃度下，白藜蘆醇對人肝腫瘤HepG2 細(xì)胞株和人正常肝L-O2 細(xì)胞株的代謝組學(xué)的研究，運(yùn)用氣相-質(zhì)譜法分析鑒定了2 種細(xì)胞株中代謝組分。結(jié)果顯示，基礎(chǔ)水平下，HepG2 中內(nèi)源性小分子的水平顯著高于L-O2，包括乳酸、氨基酸、膽固醇和脂肪酸等。HepG2 中變化最顯著的是十二烷酸、十六碳烯酸、十七碳烯酸和油酸等中長鏈脂肪酸。L-O2 中高糖培養(yǎng)環(huán)境下小分子改變更顯著，尤其是氨基酸的水平更高，尿素、肌酸酐、嘌呤和嘧啶等核酸類物質(zhì)以及泛酸和磷酸等小分子也增加。L-O2 中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物2-羥基戊二酸、蘋果酸的含量上升，以及戊糖磷酸通路中的果糖-6-磷酸、甘油酸水平的上升。

4 肝灌流法

肝灌流法是先從機(jī)體分離得到完整的肝臟，再通過人工灌注來維持肝細(xì)胞活性和生化功能，并能排除其他組織器官的干擾，此方法被廣泛應(yīng)用于藥物毒物代謝、代謝動力學(xué)、藥物毒理學(xué)、藥物相互作用等多個領(lǐng)域。肝灌流技術(shù)可以分為三類：離體肝灌流、在體肝灌流和在體腸肝灌流技術(shù)。在體灌流技術(shù)對藥物代謝研究范圍雖局限于肝臟，但仍無法避免受肝門靜脈和動脈血流、神經(jīng)和激素等內(nèi)源性物質(zhì)的影響，而離體灌流技術(shù)則不受上述的影響，且由于采樣方便，被廣泛應(yīng)用［13］。因此在此部分中我們將主要介紹離體肝灌流法的應(yīng)用。

離體肝灌流法與肝微粒體法、肝細(xì)胞體外溫孵法相比，一方面，保留著完整細(xì)胞的天然屏障和營養(yǎng)液的供給，具有器官水平的優(yōu)勢，因此能在一段時間內(nèi)保持肝臟的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有離體系統(tǒng)的優(yōu)點，能夠排除其它器官組織的干擾，可控制受試物質(zhì)的濃度，定量地觀察受試藥物體外代謝行為和特點［14］，但離體肝灌流法對實驗設(shè)備及技術(shù)有一定的要求，一定程度上限制了此方法的推廣及應(yīng)用。

陳愛瑛等［15］采用反相高效液相色譜法測定檸檬苦素在大鼠肝灌流液中的含量。結(jié)果顯示檸檬苦素在0.060～96.000 μg·mL-1（n=9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.998 8）；定量限為50 ng·mL-1，方法回收率為93.6%～102.1%。本法快速、準(zhǔn)確、簡便，能夠滿足檸檬苦素在大鼠肝臟中藥動學(xué)的研究。

張如洪等［16］在研究異甜菊在大鼠肝臟內(nèi)的代謝情況采取的實驗方法是體外離體肝灌流法，結(jié)果表明，經(jīng)過40～50 min 灌流后，異甜菊醇主要在肝臟中積累，以葡萄苷酸化形式從膽汁排泄，很可能大部分經(jīng)過膽汁排泄慢慢的消除到糞便中。在體內(nèi)和體外藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，異甜菊醇會在肝臟中會發(fā)生葡萄苷酸化。這表明肝臟代謝可能是異甜菊醇消除的主要途徑，而異甜菊醇的腎臟消除幾乎可忽略。

劉海洋等［17］通過測定離體肝灌流液中的黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）及病理組織學(xué)觀察，評價黃藥子、當(dāng)歸及其相配伍后的水提取物對肝臟毒性作用。實驗結(jié)果表明黃藥子水提取物在灌流液低濃度（1.1 mg·mL-1）、短時間（15 min 以后）即可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，并與濃度和時間呈依賴關(guān)系。黃藥子與當(dāng)歸以1∶2 比例合煎液中低濃度未見對肝細(xì)胞有損傷。黃藥子單煎液有明顯肝毒性，配伍當(dāng)歸后有明顯肝保護(hù)作用。

5 肝組織切片法

德國生物化學(xué)家瓦勃在1923 年首次建立了手工肝組織切片技術(shù)，用微刀片所切取的肝組織厚度不一，此類肝切片中的細(xì)胞缺乏再生的能力，容易缺氧死亡［18］。為了克服手工肝組織切片只適合短期實驗研究的缺陷，在20 世紀(jì)80 年初有人利用組織切片機(jī)進(jìn)行切片，使肝組織切片在切割后達(dá)到了厚薄均勻的效果，對肝組織損傷比較小。精確切取的肝組織切片技術(shù)被廣泛用于病理學(xué)、藥理學(xué)等研究中。肝組織切片法是研究藥物代謝及其毒性的有效的體外系統(tǒng)，該方法在不破壞器官的細(xì)胞構(gòu)成和組織結(jié)構(gòu)的情況下，所得結(jié)果與體內(nèi)法相近。肝切片相對于純化的P450 同工酶、P450 混合酶、肝微粒體、游離的肝細(xì)胞來說，不僅完整保留了所有肝藥酶及各種細(xì)胞器的活性，而且保留了細(xì)胞間的聯(lián)系及一定的細(xì)胞間質(zhì)，更能反映藥物在體內(nèi)生理情況下的實際代謝過程，且可在較長的孵育時間內(nèi)保持代謝活性（可達(dá)8～24 h）；其缺點為切片機(jī)的使用受限和精密準(zhǔn)確的切片機(jī)價格昂貴。

6 基因重組P450 酶系

基因重組P450 酶系是指利用基因工程及細(xì)胞工程方法，將人源的CYP450 或UGT 基因轉(zhuǎn)染到大腸埃希菌或昆蟲細(xì)胞中培養(yǎng)成表達(dá)高水平的P450，經(jīng)純化后可獲得較純的單一P450 同工酶的體系。通過該酶系，能夠定性的研究酶系中單個亞型對整個代謝反應(yīng)的相對貢獻(xiàn)和代謝途徑?；蛑亟MCYP450 酶系與肝微粒體實驗關(guān)聯(lián)性好，適合對藥物代謝進(jìn)行微觀化和細(xì)節(jié)化的研究［19］。

Ring 等［20］運(yùn)用基因重組人肝中9 種P450 酶亞型研究了誘導(dǎo)藥物Atomoxetine 4 位羥基化反應(yīng)的P450酶亞型，結(jié)果表明，CYP2D6 誘導(dǎo)速率為其他亞型的475 倍，當(dāng)CYP2D6 濃度較低時，其他P450 酶亞型也可進(jìn)行低效誘導(dǎo)。因而，臨床合并用藥時如有CYP2D6的抑制劑，也不能完全預(yù)測Atomoxetine 體內(nèi)清除被抑制。

Jin SE 等［21］運(yùn)用基因重組P450 酶系法研究了葛根湯、神速湯、小青龍湯、小柴胡湯、人參敗毒湯散、九味羌活湯等6 種中藥配方在治療傳統(tǒng)感冒過程中對4種關(guān)鍵P450 酶亞型的影響。結(jié)果表明，葛根湯能顯著抑制CYP2C19、CYP2D6 和CYP2E1 的活性；九味羌活湯對CYP2D6、CYP2E1 活性的抑制作用要強(qiáng)于其它P450 酶亞型；神速湯與小柴胡湯能改變CYP2C19、CYP2E1 介導(dǎo)的藥物代謝；人參敗毒湯散與小青龍湯對CYP3A4、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 介導(dǎo)的藥物代謝沒有任何抑制作用。

7 總結(jié)與展望

經(jīng)過多年的發(fā)展，傳統(tǒng)的體外模型日益完備，肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、離體肝灌流法及肝組織切片法等肝代謝體外代謝研究方法在分析藥物代謝的研究中不僅發(fā)揮了重要作用，并且廣泛應(yīng)用于藥物的代謝途徑，體內(nèi)代謝清除及藥物間相互作用研究等。對于不同的實驗要求及實驗?zāi)康膽?yīng)選擇合適的體外代謝研究方法。隨著科學(xué)研究技術(shù)的不斷深入，現(xiàn)在的藥物代謝研究已不再單純是化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物的研究，已經(jīng)擴(kuò)展到“組學(xué)”范疇，例如代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)，并且與機(jī)體的癥候/疾病相聯(lián)系誕生了方證代謝組學(xué)，如何建立模擬機(jī)體內(nèi)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的體外代謝模型。體外肝代謝研究可以針對先導(dǎo)化合物代謝過快或生成毒性代謝物的特性進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以期能夠獲得安全、穩(wěn)定的候選物，根據(jù)候選物的代謝特征（如藥酶誘導(dǎo)、抑制、參與代謝的藥酶種類、活性代謝物的生成等）確定藥物的開發(fā)應(yīng)用價值，因而體外肝代謝具有廣闊的應(yīng)用前景。