彩超聯(lián)合血清血清抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體、B型RAF基因V600E在診斷多灶性甲狀腺乳頭狀癌的應(yīng)用價(jià)值

廖觀生,王曉龍,徐波,吳立旋

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院甲狀腺外科; 2.惠州市中心人民醫(yī)院甲狀腺外科，廣東 廣州 510180)

甲狀腺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤疾病，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占甲狀腺癌比例較高，而多灶性甲狀腺乳頭狀癌(Multifocal papillary thyroid carcinoma，MPTC)是其常見(jiàn)類型，近年患病率呈不斷上升趨勢(shì)[1]。甲狀腺癌早期診治可取得良好的預(yù)后狀況，而晚期甲狀腺癌惡性程度較高，患者預(yù)后狀況較差[2]。因此，對(duì)MPTC等甲狀腺癌盡早進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和鑒別診斷可為其早期干預(yù)以及預(yù)后的改善提供依據(jù)。彩超可應(yīng)用于甲狀腺癌診斷，此外，甲狀腺球蛋白抗體(Antithyroglobulin antibody，TGAb)、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(Anti-thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、B型RAF基因V600E(Type B RAF gene V600E，BRAFV600E)突變等亦與甲狀腺癌密切相關(guān)[3-5]。本研究分析彩超聯(lián)合血清TGAb、TPOAb、BRAFV600E在診斷MPTC的應(yīng)用價(jià)值，旨在為MPTC診斷方案的選擇及其早期診治提供依據(jù)，具體的研究方法以及結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2016年6月至2019年6月惠州市中心人民醫(yī)院收治的甲狀腺癌805例為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者就診時(shí)觸診查體可觸及甲狀腺腺體內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)硬結(jié)節(jié)，表面粗糙，可伴隨吞咽動(dòng)作而上下活動(dòng)，部分可觸及頸部腫大淋巴結(jié)，均初次在惠州市中心人民醫(yī)院就診治療并經(jīng)活檢病理檢查確診甲狀腺癌，知情同意，其中同時(shí)具有≥2個(gè)病灶病例為多灶癌。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除復(fù)發(fā)病例、合并其他系統(tǒng)疾病或肝腎功能障礙患者等。以其中106例MPTC為A組，4例甲狀腺髓樣癌(MTC)患者為B組，剩余695例甲狀腺乳頭狀癌(PTC)為C組。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，且患者均簽署了知情同意書(shū)。三組基線資料比較見(jiàn)表1，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 觀察指標(biāo)以及檢測(cè)方法

1.2.1彩超檢查 對(duì)A組、B組和C組進(jìn)行彩超檢查，檢查采用儀器為美國(guó)GE公司的GE logiq 9 超聲儀，探頭頻率為9.0MHz～14MHz，檢測(cè)采用仰臥位，患者頭部后仰或向左右側(cè)偏以暴露需檢查部位，通過(guò)直接掃描法進(jìn)行檢查。甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)：病灶低回聲，邊界形態(tài)不規(guī)格，伴有彌漫性不規(guī)格微細(xì)鈣化病灶，病灶內(nèi)部血管粗大且走形雜亂，血流豐富，高速流值(Vmax)和阻力指數(shù)(RI)均出現(xiàn)增高，可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)腫大，其中砂粒樣微鈣化、低回聲和病灶內(nèi)部血流豐富是特異性診斷依據(jù)。

表1 三組基線資料比較

1.2.2血清TGAb、TPOAb檢測(cè) 檢測(cè)A組、B組和C組的血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性率，三組入組后均取靜脈血，肝素抗凝管手機(jī)血液樣本，3 500 r/min轉(zhuǎn)速、3 cm半徑離心10 min，分層后去上層血清，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清TGAb、TPOAb水平，檢測(cè)采用儀器為德國(guó)西門(mén)子 ADVIA Centaur XP 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，配套試劑盒均優(yōu)西門(mén)子公司生產(chǎn)提供，嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行檢測(cè)操作。其中高于60 U/mL為血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3BRAFV600E基因突變狀況檢測(cè) 檢測(cè)A組、B組和C組的BRAFV600E基因突變狀況，檢測(cè)試劑提供和引物設(shè)計(jì)均由上海生工生物工程有限公司完成。取活檢樣本制成的厚度為8 μm切片5片，二甲苯處、無(wú)水乙醇處理后在70 ℃環(huán)境中干燥，300 μLTE緩沖液消化并水浴過(guò)夜，DNA純化試劑盒和凝膠回收試劑盒手機(jī)總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)260 nm波長(zhǎng)下比色，標(biāo)化DNA濃度為300 ng/μL。常規(guī)行PCR檢測(cè)，上游引物：5′-GTAACTCAGCAGCATCTC-3′；下游引物：5′-TTCCTTTACTTACTACACCT-3′，共204 bp。25 μL PCR擴(kuò)增體系包括2.5 μL的10×PCR緩沖液、1.0 μL的模板(空白對(duì)照組采用ddH2O)、2.0 μL的25 mmol/LMg2+、1.5 μL的1 mmol/L dTNP、0.2 μL(1U)的Taq酶(Promega公司)、1.0 μL的10 mmol/L 上游引物、1.0 μL的10 mmol/L 下游引物、17.2 μL的ddH2O。OCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性0.5 min、95 ℃變性5 min、52 ℃退火0.5 min、72 ℃延伸0.5 min，循環(huán)40次后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳及Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶后進(jìn)行DNA測(cè)序。DNA純化測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，多組單向測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變或可以突變后再分別進(jìn)行單向測(cè)序，確定突變樣本，行反向測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用方差分析并通過(guò)SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的兩兩比較；采用多因素Logisitic分析血清TGAb陽(yáng)性、TPOAb陽(yáng)性、BRAFV600E基因突變是否為MPTC的高危因素；以活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，診斷試驗(yàn)四格表分析單獨(dú)應(yīng)用彩超檢查、血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變?cè)贛PTC診斷中的應(yīng)用價(jià)值以及四者聯(lián)合診斷MPTC的價(jià)值；當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性率以及BRAFV600E基因突變率比較

A組血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性率以及BRAFV600E基因突變率均高于B組和C組(P<0.05)；B組和C組血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性率以及BRAFV600E基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 MPTC高危因素的多因素Logisitic分析

多因素Logisitic分析結(jié)果顯示，血清TGAb陽(yáng)性、TPOAb陽(yáng)性、BRAFV600E基因突變等均是MPTC的高危因素。見(jiàn)表3。

2.3 彩超檢查、血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用在MPTC診斷中的價(jià)值分析

相對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用于MPTC診斷，彩超聯(lián)合血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變聯(lián)合診斷MPTC的敏感度、特異度和準(zhǔn)確性均提高，漏診率和誤診率則均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 三組血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性率以及BRAFV600E基因突變率比較[例(%)]

表3 MPTC高危因素的多因素Logisitic分析

表4 彩超檢查、血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用在MPTC診斷中的價(jià)值分析

3 討論

甲狀腺癌是常見(jiàn)頭頸部?jī)?nèi)分泌惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，以PTC為最為常見(jiàn)的類型，PTC占甲狀腺癌的60%～80%[6,7]。同時(shí)性具有兩個(gè)或兩個(gè)以上病灶的PTC為MPTC，MPTC是較為常見(jiàn)的PTC類型，占PTC發(fā)病率的18%～87%[8]。而本研究中，801例PTC患者中106例為MPTC，MPTC占PTC發(fā)病率的13.23%(106/801)，略低于報(bào)道比例但差異不大，總體符合MPTC發(fā)病占比。MPTC的臨床特征主要為多發(fā)病灶，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、治療效果、復(fù)發(fā)狀況等均有關(guān)系，亦是影響患者預(yù)后的重要因素[9]。甲狀腺癌的發(fā)生受到性別、年齡、種族、碘攝入等多種因素的影響，其早期及時(shí)診治可獲得較好的預(yù)后狀況[10]。因此，對(duì)甲狀腺癌進(jìn)行及時(shí)有效的診治十分必要。

甲狀腺彩超檢查是甲狀腺癌術(shù)前常規(guī)檢查，可輔助診斷甲狀腺癌，其高頻探頭應(yīng)用可清晰顯示甲狀腺內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)、血管和血流狀況等，可檢測(cè)出2mm以上的微小病變，可有效提高甲狀腺癌的術(shù)前診斷率[11-12]。本研究中，彩超檢查診斷MPTC的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、漏診率和誤診率分別為80.19%、74.39%、75.16%、19.81%和25.61%，其總體敏感度、特異度、準(zhǔn)確性較好，但漏診率和誤診率都高達(dá)約20%，彩超診斷MPTC價(jià)值有待提高。

TGAb、TPOAb是自身免疫性甲狀腺疾病重要檢測(cè)項(xiàng)目，與甲狀腺組織損傷以及甲狀腺功能異常密切相關(guān)，亦有研究表明其與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13-14]。本研究中，多因素Logisitic分析結(jié)果顯示，血清TGAb陽(yáng)性、TPOAb陽(yáng)性均是MPTC的高危因素，診斷試驗(yàn)四格表分析結(jié)果顯示，血清TGAb陽(yáng)性診斷MPTC的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、漏診率和誤診率分別為80.19%、75.54%、76.15%、19.81%和24.46%，血清TPOAb陽(yáng)性診斷MPTC的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、漏診率和誤診率分別為76.42%、76.39%、76.40%、23.58%和23.61%，兩者用于MPTC輔助診斷具有一定的價(jià)值，但漏診誤診較多，有待進(jìn)一步提高。

BRAFV600E基因突變?cè)赑TC中較為常見(jiàn)，可達(dá)29%～83%，主要出現(xiàn)在散發(fā)型甲狀腺癌體細(xì)胞中，甲狀腺癌其他亞型以及甲狀腺良性腫瘤病變中較少發(fā)生[15]。BRAFV600E基因突變與甲狀腺癌密切相關(guān)，可影響甲狀腺的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、去分化等多個(gè)過(guò)程，因而其在甲狀腺癌診斷、治療、靶向治療等中檢測(cè)應(yīng)用均具有一定的價(jià)值[16]。本研究中，BRAFV600E基因突變?cè)赑TC出現(xiàn)概率為30.94%而在MPTC中出現(xiàn)概率為78.30%，與前人研究報(bào)道一致。本研究中，多因素Logisitic分析結(jié)果顯示，BRAFV600E基因突變等是MPTC的高危因素之一，而診斷試驗(yàn)四格表分析結(jié)果顯示，BRAFV600E基因突變?cè)\斷MPTC的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、漏診率和誤診率分別為78.30%、69.10%、70.31%、21.70%和30.90%，其用于MPTC輔助診斷具有一定的價(jià)值，但亦存在較明顯的漏診和誤診狀況。

本研究亦分析彩超檢查、血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變聯(lián)合檢測(cè)在MPTC診斷中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果顯示，超聯(lián)合血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變聯(lián)合診斷MPTC的敏感度、特異度、準(zhǔn)確性、漏診率和誤診率分別為95.28%、97.42%、97.14%、4.72%和2.58%。相對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用于MPTC診斷，彩超聯(lián)合血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變聯(lián)合診斷MPTC的價(jià)值更佳，且漏診和誤診少，更適用于MPTC的診斷和鑒別診斷。

綜上所述，彩超、血清TGAb、TPOAb陽(yáng)性以及BRAFV600E基因突變聯(lián)合診斷MPTC的價(jià)值良好且漏診誤診少，可用于MPTC早期診斷和鑒別診斷，為其早期治療干預(yù)和獲得良好的預(yù)后狀況提供基礎(chǔ)。