蕁麻葉綠體基因組密碼子偏好性分析

李魁印, 張海玲, 張 鴻, 從春雷, 宋曉慧,陳薇薇, 龐 麗, 常向彩, 田山君

(1.安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院， 貴州 安順 561000； 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025；3.清鎮(zhèn)市第一中學(xué)， 貴州 清鎮(zhèn) 551400)

密碼子是DNA或mRNA上的三聯(lián)體核苷酸殘基序列，每一個(gè)三聯(lián)體密碼子對(duì)應(yīng)一個(gè)氨基酸。在DNA翻譯為蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程中，同義密碼子的使用存在不均衡的現(xiàn)象。同一物種編碼相同氨基酸的不同密碼子也有著不同的使用頻率，即密碼子的使用具有偏好性[1]。葉綠體是具有一套完整復(fù)制和翻譯系統(tǒng)的細(xì)胞器，具有遺傳信息保守，表達(dá)效率高等特點(diǎn)[2-3]。與植物葉綠體基因組相關(guān)的研究已在分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域[4-5]廣泛應(yīng)用。研究表明，DNA復(fù)制位點(diǎn)[6]、自然選擇、突變、基因序列的長(zhǎng)度[7]等均會(huì)影響葉綠體基因組密碼子的偏好性。針對(duì)植物葉綠體基因組密碼子偏好性的相關(guān)研究已經(jīng)在金蓮花、苦蕎、巨桉葉等多種植物[8-10]中展開。本研究通過對(duì)蕁麻葉綠體基因組進(jìn)行中性繪圖分析(neutral plot analysis)、ENC繪圖分析(ENC analysis)及PR 2繪圖分析(PR 2-bias analysis)，表明自然選擇是影響蕁麻葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素。這可為蕁麻葉綠體外源基因的改良優(yōu)化，以及提高其基因表達(dá)水平等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列的獲得與處理

根據(jù)登錄號(hào)(GenBank登陸編號(hào)：MZ 313540)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.gov)下載得到蕁麻科蕁麻屬蕁麻(UrticafissaL.)的基因組及其注釋信息，其序列全長(zhǎng)為146 829 bp，其中含有86條CDS(Coding DNA Sequence)序列。

使用Python 3.8.0將文件從Genbank格式中獲取86條DNA序列，并處理成fasta格式文件，在Codon W 1.4.1[11]中運(yùn)行，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及分析。

1.2 密碼子組成分析

用Python 3.8.0分別統(tǒng)計(jì)密碼子3個(gè)位置的GC含量，GC1，GC2，GC3分別表示密碼子第1、2、3位的GC比，GC表示全部序列的GC比。在EMBOSS(https://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer)[12]中分析各基因的有效密碼子數(shù)(Effective Number of Codon,ENC)，利用軟件SPSS 26.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3 密碼子偏好性分析

相對(duì)同義密碼子使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU)。RSCU表示該密碼子實(shí)際使用值與理論使用值之間的比值[13]。用Python 3.8.0去除30條長(zhǎng)度小于300 bp的CDS[14]，剩余56條符合條件的CDS在軟件Codon W 1.4.1中進(jìn)行RSCU統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 中性繪圖分析

以各基因的GC12(GC1和GC2的平均值)為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)作散點(diǎn)圖(擬合得到GC3-GC12的方程)(圖3)。分析密碼子第1、2位和第3位堿基組成的相關(guān)性，可以得到影響密碼子偏好性的有效因素[15]。若GC12與GC3顯著相關(guān)，表明3個(gè)位置上的堿基組成差異較小，即密碼子的使用偏好性更多地受突變影響；若GC12與GC3之間相關(guān)性不顯著，表明3個(gè)位置上的堿基組成存在差異，蕁麻葉綠體基因組GC含量高度保守，密碼子的使用偏好性更多地受自然選擇影響[16]。

1.5 ENC繪圖分析

以各基因的ENC值為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)構(gòu)建二維散點(diǎn)圖(圖4)。并在ENC-GC3散點(diǎn)圖中繪制ENC值標(biāo)準(zhǔn)曲線以分析堿基組成對(duì)密碼子偏好性的影響[17]。ENC值是反映同義密碼子非均衡使用偏好程度的重要指標(biāo)[18]。若基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，表示自然選擇更多地影響該基因密碼子偏好性，基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近表示突變更多地影響該基因密碼子偏好性。密碼子偏好性的強(qiáng)弱通常以35為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為，當(dāng)ENC<35時(shí)，編碼氨基酸的密碼子使用性較強(qiáng)，反之則弱。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[19]如下：

自然選擇和突變二者對(duì)密碼子偏好性的影響程度并不能通過ENC繪圖分析準(zhǔn)確區(qū)分。因此通過計(jì)算ENC期望值(ENCexp)與ENC觀察值(ENCobs)之間的差異得到ENC比值頻數(shù)，從而更有效地評(píng)估二者對(duì)密碼子偏好性的影響程度。ENC比值頻數(shù)的計(jì)算公式為：

(ENCexp-ENCobs)/ENCexp

通過ENC繪圖分析和ENC比值頻數(shù)這兩種分析結(jié)果對(duì)自然選擇和突變二者之間的差異進(jìn)行量化分析[20]。

1.6 PR 2繪圖分析

PR 2偏倚分析[21]是分析各密碼子第3位堿基A、T和C、G之間突變是否平衡。針對(duì)由同義密碼子編碼的不同氨基酸，統(tǒng)計(jì)分析其所有密碼子第3位上堿基的數(shù)量，分析并計(jì)算得到每個(gè)基因G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)的比值。以G3/(G3+C3)為橫坐標(biāo)，A3/(A3+T3)為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖(圖5)。散點(diǎn)圖中心點(diǎn)的位置表示密碼子第3位的堿基含量為A=T且C=G，其余的點(diǎn)與中心點(diǎn)之間的矢量表示該基因的偏性方向和偏移程度[22]。

1.7 最優(yōu)密碼子分析

對(duì)56條長(zhǎng)度大于300 bp的CDS的ENC值進(jìn)行排序，兩極各選10%的基因構(gòu)建高低偏性庫(kù)[23]，取偏性庫(kù)中ΔRSCU≥0.08(ΔRSCU=RSCU高表達(dá)-RSCU低表達(dá))[24]的密碼子作為高表達(dá)密碼子。蕁麻葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子需同時(shí)滿足高頻率和高表達(dá)這兩個(gè)要求[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組特征

對(duì)比蕁麻(U.fissa)和裂葉蕁麻(U.lobatifolia)的基因組(表1)，發(fā)現(xiàn)二者大單拷貝區(qū)(Large Single Copy,LSC)、小單拷貝區(qū)(Small Single Copy,SSC)、tRNA、rRNA和反向重復(fù)區(qū)(Inverted Repeats,IR)無較大差異，而CDS差異較大。二者的序列長(zhǎng)度和比例分別為：蕁麻(77 772 bp，52.96%)；裂葉蕁麻(68 508 bp，46.66%)，蕁麻的CDS大于裂葉蕁麻，說明蕁麻的注釋可能更完整。

表1 裂葉蕁麻和蕁麻基因組特征

使用葉綠體圈圖在線繪制工具OGDRAW繪制蕁麻葉綠體基因組圈圖[26](Organellar GenomeDRAW,https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)。圈內(nèi)的基因正向轉(zhuǎn)錄，圈外的基因反向轉(zhuǎn)錄[27]。蕁麻葉綠體基因組大小為146 837 bp，共有葉綠體基因115個(gè)，其中CDS共81個(gè)，tRNA共30個(gè)，rRNA共4個(gè)(圖1)。

圖1 蕁麻葉綠體基因組序列圈圖

2.2 密碼子組成分析

統(tǒng)計(jì)蕁麻葉綠體基因組不同位置的GC含量及ENC值(表2)。所有CDS密碼子的平均GC含量為37.40%。密碼子第3位GC的平均含量為27.61%，明顯低于第1位和第2位的45.73%和38.87%。絕大多數(shù)密碼子前兩位的GC含量通常高于第3位密碼子，說明密碼子第3位堿基組成多為A和T。ENC值的大小反映了密碼子偏性的強(qiáng)弱，原則上ENC的取值范圍為20～61。按照慣例，以35作為偏性強(qiáng)弱的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)[28]。蕁麻56個(gè)葉綠體基因組密碼子ENC值在35.68～61之間，平均值為47.41，所以蕁麻葉綠體基因密碼子偏性較弱。

表2 蕁麻葉綠體基因組密碼子不同位置的GC含量及ENC值

蕁麻葉綠體基因組GC1，GC2，GC3，GC、ENC和密碼子數(shù)目(Codon Number)間的相關(guān)性分析詳見圖2。GC分別與GC1，GC2，GC3的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，而GC3與GC1、GC2之間均未達(dá)到顯著水平，說明蕁麻葉綠體基因組密碼子第1，2位的堿基組成與第3位的堿基存在差異。ENC與GC1、GC2相關(guān)性不顯著，但與GC3含量顯著相關(guān)。密碼子數(shù)目與ENC二者間的相關(guān)系數(shù)R2為0.276，說明密碼子偏好性受基因序列長(zhǎng)度影響較大。

圖2 蕁麻葉綠體基因組各基因相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析

2.3 密碼子偏好性分析

各種氨基酸的RSCU值分析見表3。當(dāng)RSCU>1時(shí)，表示該密碼子的使用頻率高于其同義密碼子的使用頻率；當(dāng)RSCU=1時(shí)，表示該密碼子沒有偏好性；當(dāng)RSCU<1時(shí)，表示該密碼子的使用頻率低于其他同義密碼子的使用頻率。從表3可以看出，RSCU值大于1.00的密碼子數(shù)量為33，其中以A結(jié)尾的14個(gè)，T結(jié)尾的16個(gè)，G結(jié)尾的3個(gè)。密碼子以A和T為結(jié)尾的出現(xiàn)頻率比較高，說明A和T是基因組偏好的密碼子。

表3 蕁麻各氨基酸相對(duì)同義密碼子使用度

2.4 中性繪圖分析

蕁麻葉綠體基因組各基因中性繪圖分析及結(jié)果見圖3，根據(jù)中性繪圖分析可以看出回歸系數(shù)R為0.151，GC3與GC12的決定系數(shù)R2=0.041，GC12的取值范圍為0.29～0.53，GC3的取值范圍為0.18～0.39。中性繪圖分析的結(jié)果說明第1，2和第3位堿基組成無較大差異，兩者的相關(guān)性較低。圖中絕大多數(shù)基因落在對(duì)角線(圖3中藍(lán)色直線)下方，說明蕁麻密碼子偏好性形成的主要因素是自然選擇，而不是突變。

圖3 中性繪圖分析

2.5 ENC繪圖分析

ENC與GC3的關(guān)聯(lián)分析及結(jié)果見圖4。由ENC-GC3關(guān)聯(lián)分析可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線下方匯集了大部分基因，這一結(jié)果說明自然選擇對(duì)蕁麻葉綠體基因組密碼子偏好性的影響較大。同時(shí)結(jié)合ENC比值頻數(shù)(表4)統(tǒng)計(jì)不同組段的頻率得到結(jié)果：ENC比值分布在-0.05～0.05這一區(qū)間的基因頻率為0.392 9，比值分布在0.05～0.15這一區(qū)間的基因頻率為0.446 4，大多數(shù)的ENC比值分布在0.05～0.15之間，說明ENCexp與ENCobs差異較大，即離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，因此蕁麻葉綠體基因組密碼子的偏好性更多地受自然選擇的影響。

表4 蕁麻葉綠體基因組ENC比值頻數(shù)分布

圖4 ENC繪圖分析

2.6 PR 2繪圖分析

PR 2繪圖分析是分析蕁麻葉綠體基因組中氨基酸嘌呤(A和G)與嘧啶(T和C)之間的關(guān)系。由PR 2繪圖分析可以得到結(jié)論：大部分基因位于第四象限，這說明嘧啶T的使用頻率高于嘌呤A的使用頻率，嘌呤G的使用頻率高于嘧啶C的使用頻率。若蕁麻葉綠體基因組密碼子的偏好性完全受突變的影響，那A和T以及G和C的使用頻率應(yīng)當(dāng)相等。因此可以得出結(jié)論：不僅自然突變對(duì)蕁麻葉綠體基因組密碼子的使用有一定的影響，自然選擇也影響了其密碼子的使用偏好。

2.7 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)56條CDS的ENC值對(duì)各基因進(jìn)行排序，根據(jù)其數(shù)值大小在兩極各選取6個(gè)基因構(gòu)建高、低表達(dá)基因庫(kù)，并計(jì)算高低表達(dá)基因庫(kù)中密碼子的ΔRSCU值(表5)。高表達(dá)基因?yàn)閜sbA、ndhC、rpl 16、rps 18、petB和ndhJ；低表達(dá)基因?yàn)閥cf 1、rps 4、petA、ycf 3、rps 2和cemA。在表3中選出共計(jì)33個(gè)相對(duì)同義密碼子使用度值大于1密碼子為高頻密碼子。進(jìn)一步根據(jù)ΔRSCU值篩選出ΔRSCU大于等于0.08的高表達(dá)密碼子，共計(jì)22個(gè)。其中以T結(jié)尾的密碼子有10個(gè)，以A結(jié)尾的密碼子有4個(gè)，以G結(jié)尾的密碼子有3個(gè)，以C結(jié)尾的密碼子有5個(gè)。最終確定15個(gè)密碼子為蕁麻葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，分別為CAA、AGT、GCT、CGT、CGA、GAT、TGT、GGT、ATT、CCT、TCT、ACT、GTA、TTA、TTG。

表5 蕁麻葉綠體基因組氨基酸的RSCU值

3 討 論

葉綠體是植物中遺傳信息保守的細(xì)胞器，其基因組的結(jié)構(gòu)也較為穩(wěn)定。在葉綠體基因中，同義密碼子的使用也同核基因一樣存在不均等的現(xiàn)象，即密碼子存在偏好性?？偨Y(jié)前人的研究發(fā)現(xiàn)，除自然選擇和突變這兩個(gè)因素對(duì)密碼子使用偏性有一定的影響外[29]，葉綠體基因組密碼子的偏好性還與堿基組成差異[30]、tRNA豐度[31]等因素有關(guān)。其中，最普遍的影響因素為密碼子的堿基組成。密碼子第3位的改變對(duì)氨基酸的影響較小，即密碼子的改變通常不會(huì)引起氨基酸的變化，且密碼子第3位的堿基突變受到的選擇壓力比較小。綜合考慮以上兩種因素發(fā)現(xiàn)，研究密碼子第3位堿基的組成對(duì)探究密碼子偏好性有重要意義。本文計(jì)算了蕁麻葉綠體基因組第3位密碼子的組成，發(fā)現(xiàn)其中T>A，G>C。結(jié)合中性繪圖分析、ENC繪圖分析及PR 2繪圖分析后得出結(jié)論：自然選擇是影響蕁麻葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素。結(jié)合蕁麻葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分析，最終確定了CAA、AGT、GCT、CGT、CGA、GAT、TGT、GGT、ATT、CCT、TCT、ACT、GTA、TTA、TTG共15個(gè)密碼子為蕁麻葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

植物葉綠體密碼子偏好性是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，密碼子的偏好性是物種對(duì)其生存環(huán)境及自然進(jìn)化的適應(yīng)性選擇的結(jié)果。從進(jìn)化角度上看，這種適應(yīng)性選擇的不同可能與物種對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)有關(guān)。密碼子使用的偏好性及使用模式能夠反映物種間的進(jìn)化關(guān)系，因此更深層次的研究在探究密碼子偏好性對(duì)物種系統(tǒng)發(fā)育方面具有積極意義。