柚皮苷微乳制備工藝研究*

徐坤勇，郭建忠，顏 娟，韻國萍

（1.河北省張家口市第一醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075061；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075061）

柚皮苷又稱柚苷、柑橘苷，來源于蕓香科柑橘屬植物柚、葡萄柚未成熟或近成熟的干燥果皮，是一種天然的黃酮類化合物[1]。柚皮苷具有多種生物學活性，包括抗過敏反應[2]，抗氧化，調(diào)血脂，抑制雜環(huán)胺類物質等致突變性，抗癌，預防與治療胃潰瘍，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希桿菌及某些真菌有抑制作用，抗炎，對某些毒物有拮抗作用，解痙，鎮(zhèn)痛，改善微循環(huán)和軟骨組織細胞功能，降低毛細血管通透性和骨關節(jié)病變率等[3]。微乳劑可緩慢釋放藥物，提高藥物生物利用度，達到協(xié)同增效和減毒的目的[4]。本研究中擬利用柚皮苷的生物學活性，制備柚皮苷微乳，并對其外觀、形態(tài)、粒徑表征和穩(wěn)定性進行觀察，為柚皮苷制劑的進一步開發(fā)奠定基礎。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海智光儀器儀表有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位測定儀（英國Malvern公司）；SKY-2102C型恒溫搖床（常州金壇精達儀器制造有限公司）；LG16-B型高速離心機（北京雷博爾離心機有限公司）；752型紫外可見分光光度計（上海恒平科學儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；AE/240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為萬分之一）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（重慶對照品科技有限公司，批號為110722-201312，純度≥98%）；柚皮苷（實驗室自制，純度≥90%）；丙二醇辛酸酯（法國Gattefosse公司，批號為58748-27）；油酸乙酯（批號為Z16D8Y50961），肉豆蔻酸異丙酯（IPM，批號為Y20J8S40186），均購自上海源葉生物科技有限公司；聚山梨酯80（Tween80，天津市光復精細化工研究所，批號為20171101）；聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35，批號為D1216A），聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40，批號為S0824A），均購自德國BASF公司；聚乙二醇400（PEG400，批號為20121201），無水乙醇（批號為20171103），均購自西隴化工股份有限公司；1，2-丙二醇（南京威爾化工有限公司，批號為20170901）；甘油（天津市恒興化學試劑有限公司，批號為20160522）；甲醇、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 油相選擇

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[5-7]：色譜柱為Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為36%乙酸-甲醇-水（4∶49∶51，V/V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為283 nm；柱溫為室溫；進樣量為10μL。理論板數(shù)按柚皮苷峰計應不低于3 000。

油相中柚皮苷平衡溶解度：將過量的柚皮苷分別加入含有不同油相（IPM，油酸乙酯、丙二醇辛酸酯）的離心管中，漩渦振蕩5 min，混合均勻，超聲處理30 min，置40℃恒溫搖床中水平振搖48 h以達平衡，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用適量甲醇稀釋，用0.45μm微孔濾膜濾過，依法進樣測定。結果顯示，柚皮苷在油酸乙酯中的平衡溶解度最高（4.76 g/L），故選擇油酸乙酯為油相。

2.2 表面活性劑與助表面活性劑配伍試驗

分別以Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，以1，2-丙二醇、PEG400、甘油與無水乙醇為助表面活性劑，固定總質量為1.0 g，將油酸乙酯、表面活性劑與助表面活性劑按質量比1∶3∶1混合，40℃恒溫水浴攪拌均勻，得油相混合物，逐滴滴入4 mL水，形成微乳。取微乳，4 000 r/min離心15 min，靜置1 h，觀察分層現(xiàn)象。按公式物理穩(wěn)定性參數(shù)（KE）=（A0-A）/A0測定微乳的KE。式中，A0和A分別為原微乳和原微乳離心后下層液經(jīng)同倍稀釋后在同一波長下的吸光度。在相同條件下，KE越小，微乳越穩(wěn)定。以283 nm為檢測波長，采用紫外分光光度法考察表面活性劑與助表面活性劑的配伍情況，結果見表1。Tween80和1，2-丙二醇、甘油制備的微乳經(jīng)離心后均已分層，當Tween80，EL-35，RH-40分別為表面活性劑，PEG400、無水乙醇為助表面活性劑時均能形成澄清透明的微乳，KE較小，且4000r/min離心15 min后無分層，常溫避光靜置24 h后乳化穩(wěn)定。通過配伍試驗初步選擇Tween80，EL-35與RH-40為表面活性劑，選擇PEG400、無水乙醇為助表面活性劑。

表1表面活性劑與助表面活性劑的配伍試驗結果

2.3 微乳制備及偽三元相圖繪制

按一定比例將表面活性劑與助表面活性劑混勻，作為混合表面活性劑，再將油相加入混合表面活性劑中，混勻，40℃恒溫磁力攪拌器攪拌（轉速為100 r/min），混勻，同時向混合體系中緩慢滴加水，觀察體系由清至濁或由濁至清的現(xiàn)象。以流動性好、外觀均一透明及有丁達爾效應為微乳形成的判斷標準。以混合表面活性劑為1個頂點，以水相和油相為另外2個頂點，根據(jù)形成微乳臨界點時各組分所占比例確定在相圖中的位置，采用Origin8.5軟件繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)的面積[8]。

2.4 微乳處方篩選

空白微乳制備：固定油相為油酸乙酯不變，分別選用Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，選用PEG400、無水乙醇為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）分別為1，2，3，按2.3項下方法制備空白微乳，觀察并記錄在臨界點時各組分所占比例。

表面活性劑選擇：分別以Tween80，EL-35，RH-40為表面活性劑，以無水乙醇為助表面活性劑，Km取3，制備混合表面活性劑，按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區(qū)，結果見圖2?？梢?，當EL-35為表面活性劑時微乳區(qū)面積最大，故選擇EL-35為表面活性劑。

助表面活性劑選擇：固定表面活性劑為EL-35，其Km為3，分別以PEG400、無水乙醇為助表面活性劑，按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區(qū)，結果見圖3?？梢?，當無水乙醇為助表面活性劑時微乳區(qū)面積最大，故選擇無水乙醇為助表面活性劑。

Km值選擇：以表面活性劑為EL-35，以無水乙醇為助表面活性劑，以Km分別為1，2，3制備混合表面活性劑。按2.3項下方法繪制微乳的偽三元相圖，確定微乳區(qū)，結果見圖3?？梢?，當Km=3時微乳區(qū)面積最大，故選擇Km為3∶1。同時，油酸乙酯與混合表面活性劑質量比為1∶4時能形成穩(wěn)定的微乳，故確定油酸乙酯與混合表面活性劑質量比為1∶4。

圖1不同表面活性劑繪制的偽三元相圖

圖2不同助表面活性劑繪制的偽三元相圖

圖3不同Km繪制的偽三元相圖

2.5 微乳制備

乳化溫度選擇：分別稱取油酸乙酯0.2g、EL-350.6g與無水乙醇0.2 g，按2.3項下方法分別于40，50，60℃恒溫磁力攪拌（轉速為100 r/min）下逐滴滴入4 mL水，制備空白微乳。以微乳外觀性狀、透光率為考察指標，觀察乳化溫度對乳化效果的影響，結果見表2。隨著乳化溫度的升高，微乳透光率逐漸降低。40℃乳化時所得微乳澄清透明，常溫靜置24 h仍保持穩(wěn)定，無分層現(xiàn)象。故選擇乳化溫度為40℃。

表2乳化溫度對乳化效果的影響（n=3）

稀釋倍數(shù)（W水∶W油）確定：分別稱取油酸乙酯0.2 g、EL-35 0.6 g與無水乙醇0.2 g，按2.3項下方法分別滴入1，4，8，16 mL水，制備空白微乳。以微乳外觀性狀與透光率為考察指標，觀察不同稀釋倍數(shù)對乳化效果的影響，結果見表3。隨著稀釋倍數(shù)的增大，微乳的透光率逐漸升高。當水≥4 mL（即稀釋倍數(shù)≥20倍）時，均能形成澄清透明的微乳，透光率均＞90%，常溫靜置24 h仍保持穩(wěn)定。故選擇水與油的質量比為20∶1。

表3稀釋倍數(shù)對乳化效果的影響（n=3）

2.6 空白微乳處方確定

由篩選結果可知，油酸乙酯為微乳油相，EL-35為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，Km為3。確定空白微乳處方組成比例為油酸乙酯4%，EL-35 12%，無水乙醇4%，水80%。

2.7 柚皮苷微乳處方確定

稱取適量柚皮苷，加入油酸乙酯中，按2.3項下方法制備含柚皮苷0.5%，1%，2%的微乳，于4 000 r/min離心15 min，于離心前后分別測定微乳中柚皮苷的含量。結果離心前后柚皮苷含量無明顯變化，所制備的柚皮苷微乳穩(wěn)定性良好。為了保持更高的載藥量，故選擇含2%柚皮苷的微乳為目標處方，進而確定柚皮苷微乳處方組成比例為柚皮苷2%，油酸乙酯4%，EL-35 12%，無水乙醇4%，水78%。

2.8 柚皮苷微乳表征

性狀：黃棕色透明、流動性好的低黏度液體。

形態(tài)觀察：取柚皮苷微乳適量，用水稀釋20倍，滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min，用濾紙吸走多余的水，用2%磷鎢酸（pH7.4）溶液負染10 min，自然揮干，置透射電子顯微鏡下觀察，結果見圖4。該微乳顆粒呈圓球形，分布相對均勻，基本無粘連現(xiàn)象。

圖4 柚皮苷微乳透射電鏡圖（×80 000）

粒徑分布與Zeta電位測定：取適量柚皮苷微乳，加水稀釋，超聲分散，采用激光粒度測定儀于25℃測定柚皮苷微乳粒徑分布，結果見圖5；Zeta電位分析儀測定電位分布，結果見圖6。柚皮苷微乳的平均粒徑為（32.78±0.30）nm，均在10～100 nm之間；Zeta電位平均值為（-47.86±4.71）mV。

pH測定：稱取柚皮苷微乳0.5 g，加水稀釋100倍，于25℃測定pH，結果為5.37。

圖5柚皮苷微乳的粒徑和Zeta電位分布

2.9 初步穩(wěn)定性考察

高溫試驗：取適量柚皮苷微乳，密封保存于帶塞西林瓶中，60℃恒溫水浴鍋中分別放置5 d和10 d，考察柚皮苷微乳的穩(wěn)定性，結果見表4。放置5 d，微乳已變渾濁，透光率明顯下降，表明柚皮苷微乳在高溫時質量不穩(wěn)定。

表4 60℃穩(wěn)定性試驗結果（n=3）

常溫留樣考察：取適量柚皮苷微乳，密封保存于帶塞西林瓶中，在溫度25℃、相對濕度75%條件下分別放置1，2，3，6個月，定期考察，結果見表5。第6個月柚皮苷微乳仍保持澄明，未見分層，透光率及含量與第0個月比較均無明顯變化。

表5常溫留樣考察結果（n=5）

3 討論

柚皮苷單體具有良好的成藥性[9]。目前，有代表性的柚皮苷制劑為片劑[10]，但存在首過效應，生物利用度不高[11]。微乳為良好的藥物載體，可提高藥物的生物利用度[12]。因此，本研究中制備柚皮苷微乳考察其表征形態(tài)及穩(wěn)定性，為柚皮苷制劑的進一步開發(fā)提供參考。

油相是微乳的重要組成部分，本研究中通過平衡溶解度篩選油相。偽三元相圖是研究微乳體系的基本工具，微乳區(qū)域面積與微乳穩(wěn)定性關系密切[13]。EL-35含聚氧乙烯基團，為非離子型表面活性劑，可降低界面膜的表面張力，有較好的乳化性能，不易受酸堿的影響，毒性小，溶血性低[14]，且形成的微乳區(qū)面積較大，故選擇EL-35為表面活性劑。助表面活性劑可調(diào)節(jié)表面活性劑親水親油平衡值，同表面活性劑降低界面張力有協(xié)同作用，增加微乳的流動性，增強界面間的柔性，且因短鏈醇類能增大藥物的溶解度，減小微乳顆粒，乳化性能好，常作為助表面活性劑使用[15]，故本研究中選擇無水乙醇作為助表面活性劑。

高溫試驗結果表明，柚皮苷微乳在60℃放置5 d后，外觀明顯渾濁，這可能與柚皮苷在熱水中溶解度急劇升高，柚皮苷從油相中轉入水相，破壞微乳結構有關，表明柚皮苷微乳制劑應常溫或低溫貯藏。由常溫留樣考察試驗結果可知，柚皮苷微乳放置6個月后未見分層，透光率和含量未見明顯變化，表明柚皮苷微乳在25℃放置6個月穩(wěn)定性良好。

綜上所述，本方法所制備的柚皮苷微乳可為擴大柚皮苷的應用奠定基礎，但能否滿足臨床需求，提高藥物療效，還需要通過后續(xù)試驗考察和驗證。