梨杷止咳合劑藥效學(xué)研究

符 冰，劉銳鋒△，唐 蕾，趙偉國，王術(shù)玲，巫柳岑

（1.廣東省中山市人民醫(yī)院，廣東 中山528404；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

梨杷止咳合劑為中山市人民醫(yī)院的多年經(jīng)驗(yàn)方，由梨干、菊花、苦杏仁、枇杷葉、桑白皮、北沙參、桔梗、甘草8味中藥組方，具有化痰止咳、清熱去燥、潤肺生津的功效[1]，臨床用于治療肺燥咳嗽、喉癢干咳、急慢性支氣管炎、喘息性支氣管炎、久咳不止。本研究中分別進(jìn)行了小鼠25%氨水噴霧引咳試驗(yàn)、小鼠酚紅排泌祛痰試驗(yàn)、0.1%磷酸組胺和2%氯化乙酰膽堿誘發(fā)小鼠哮喘試驗(yàn)，擬觀察梨杷止咳合劑的止咳、祛痰、平喘作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：SPF級健康昆明種小鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號為SCXK（粵）2018-0002。試驗(yàn)動物飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院SPF級動物房，恒溫環(huán)境（23±1）℃，12 h晝夜更替，自由飲食飲水，定時更換小鼠墊料。試驗(yàn)獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動物倫理審查委員會批準(zhǔn)。

試藥：梨杷止咳合劑（中山市人民醫(yī)院，批號分別為20181216，20190415，20190521，規(guī)格為每瓶300 mL）；氫溴酸右美沙芬片（廣州白云山華光制藥股份有限公司，批號為190009，規(guī)格為每片15 mg）；氯化鈉注射液（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號為2008050727，規(guī)格為每支500 mL∶4.5 g）；氨茶堿（山西太原藥業(yè)有限公司，批號為190211，規(guī)格為每片0.3 g）；25%氨水（廣東光華化學(xué)藥廠有限公司，分析純，批號為20081020）；磷酸組胺（批號為C10548538），氯化乙酰膽堿（批號為C10531451），均購自上海麥克林生化科技有限公司；酚紅（分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠，批號為920924）；氯化銨（批 號 為20151107-2），氫 氧 化 鈉（批 號 為20170210-1），均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

儀器：L5S型紫外-可見分光光度計(jì)（上海雙旭電子有限公司）；BP211D型準(zhǔn)微量電子分析天平（珠海天創(chuàng)儀器有限公司，精度為十萬分之一）；ZH-E11型醫(yī)用超聲霧化器（中國航空工業(yè)集團(tuán)公司）。

1.2 方法

25%氨水噴霧引咳小鼠試驗(yàn)[2]1363，[3-4]：將18只健康昆明種小鼠隨機(jī)分為空白對照組、供試品組、陽性藥對照組，每組6只?？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉溶液0.02 mL/g灌胃，陽性藥對照組給予氫溴酸右美沙芬片0.03 mg/g灌胃，供試品組給予梨杷止咳合劑0.04 mL/g灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。試驗(yàn)開始前12 h內(nèi)禁食不禁飲，末次給藥1 h后，將各組小鼠放入1 000 mL鐘形玻璃罩中，用25%氨水噴霧15 s，觀察小鼠的咳嗽動作（張大嘴，腹肌收縮，有時會有咳嗽聲），記錄小鼠的咳嗽潛伏期（小鼠放入鐘形玻璃罩中至出現(xiàn)咳嗽的時間）及3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

小鼠酚紅排泌祛痰試驗(yàn)[5-8]：先進(jìn)行酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，取酚紅適量，精密稱定，用適量1 mol/L氫氧化鈉溶解，配成質(zhì)量濃度為50μg/mL的酚紅溶液，分別取0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL置10 mL容量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液定容，稀釋得2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0μg/mL系列質(zhì)量濃度的酚紅溶液。依法測定吸光度值，以酚紅排泌量（X）為橫坐標(biāo)、吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=25.846X+0.034 3（r=0.999 2）。小鼠分組同25%氨水噴霧引咳小鼠試驗(yàn)方法。空白對照組給予0.9%氯化鈉溶液0.02 mL/g灌胃，陽性藥對照組給予氯化銨1.0 mg/g灌胃，供試品組給予梨杷止咳合劑0.04 mL/g灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。試驗(yàn)開始前12 h內(nèi)禁食不禁飲，末次給藥0.5 h后，各組小鼠分別按體質(zhì)量（0.1 mL/10 g）腹腔注射0.05%酚紅溶液，注射酚紅0.5 h后，處死小鼠，剪開頸部皮膚，小心分離氣管（操作過程中避免出血），剝離氣管周圍組織，剪取自甲狀軟骨氣管至氣管分支處的一段氣管放入試管，注入0.1 mL 1 mol/L氫氧化鈉及2 mL 0.9%氯化鈉溶液充分振蕩，混勻，取上清液，在546 nm波長處測定吸光度（A）。用已知濃度酚紅溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算酚紅排泌量（μg/mL）。

小鼠平喘試驗(yàn)[2]1379，[9-11]：小鼠分組同25%氨水噴霧引咳小鼠試驗(yàn)方法?？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉溶液0.02 mL/g灌胃，陽性藥對照組給予氨茶堿0.025 mg/g灌胃，供試品組給予梨杷止咳合劑0.04 mL/g灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，將小鼠置1 000 mL鐘形玻璃罩中，以0.1%磷酸組胺和2%氯化乙酰膽堿等量的混合溶液，噴霧15 s致喘，觀察小鼠6 min內(nèi)引喘潛伏期（從開始噴霧到哮喘發(fā)作、呼吸困難，直至抽搐跌倒的時間）。超過360 s未發(fā)生抽搐癥狀的小鼠按360 s計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料用表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 止咳作用

與空白對照組比較，供試品組和陽性藥對照組均能顯著延長咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)（P＜0.05）；供試品組與陽性藥對照組比較，無顯著差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1小鼠25%濃氨水噴霧引咳試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

表1小鼠25%濃氨水噴霧引咳試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。表2同。

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2.2 祛痰作用

與空白對照組比較，供試品組和陽性藥對照組均能顯著增加酚紅排泌量（P＜0.05）；供試品組與陽性藥對照組比較，無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2小鼠酚紅排泌祛痰和平喘試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

表2小鼠酚紅排泌祛痰和平喘試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=6）

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2.3 平喘作用

與空白對照組比較，供試品組和陽性藥對照組均能顯著延長0.1%磷酸組胺和2%氯化乙酰膽堿等量的混合液致小鼠哮喘發(fā)作的潛伏期時間（P＜0.05）；供試品組與陽性藥對照組比較，無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2。

3 討論

咳嗽是中醫(yī)臨床常見病癥，單獨(dú)發(fā)病或伴隨其他疾病出現(xiàn)，常反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈。經(jīng)過多年臨床試驗(yàn)與研究，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為外感六淫與內(nèi)傷襲肺均能引起咳嗽。肺燥咳嗽屬中醫(yī)外感咳嗽，由燥邪燒灼津液、肺失清潤引起，表現(xiàn)為咳嗽聲清，干咳無痰，或少痰、稠而咳吐不爽，劇咳時連聲不休，唇干咽燥，舌干、脈浮，病程較長，纏綿難愈，屬中醫(yī)“久咳”范疇。中醫(yī)治療以清燥潤肺、養(yǎng)陰生津?yàn)橹鱗12]。梨杷止咳合劑為該治療理論所得經(jīng)驗(yàn)方，方中梨干清肺化痰、生津止渴，菊花疏散風(fēng)熱、平肝明目、清熱解毒，二者共為君藥，共奏疏風(fēng)清熱、去燥生津之功效；苦杏仁降氣止咳平喘、潤腸通便，枇杷葉清肺止咳、降逆止嘔，桔梗開宣肺氣、利咽、祛痰、排膿，三者共為臣藥，有化痰、止咳、平喘之功效；桑白皮瀉肺平喘、利水消腫，北沙參清肺、潤燥、養(yǎng)陰，二者共為佐藥；甘草補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥，為方中使藥。研究發(fā)現(xiàn)，治療咳嗽使用頻數(shù)較高的中藥有甘草、桔梗、桑白皮、苦杏仁、枇杷葉，常用藥對有甘草-桔梗、甘草-苦杏仁、桑白皮-甘草、桔梗-苦杏仁[13]。甘草-桔梗二者配伍可增強(qiáng)瀉火解毒、利咽消痰之功效；甘草-苦杏仁宣肺平喘；桑白皮-甘草為瀉白散的經(jīng)典組合，用于肺熱、痰多、喘咳；桔梗-苦杏仁為臨床常用止咳、平喘、祛痰常用經(jīng)典藥對，在《景岳全書》《濟(jì)生方》《溫病條辨》中均有記載，苦杏仁辛散苦降，以降為主，擅于宣降肺氣，潤燥下氣，桔梗升清降濁，以升為主，宣通肺氣，一升一降，二者合用，升降調(diào)和，具有極佳的祛痰止咳功效。統(tǒng)觀全方，組方嚴(yán)謹(jǐn)，氣津并調(diào)，升降并用，共奏化痰止咳平喘、清熱去燥、潤肺生津之功效。

本研究中，選用0.9%氯化鈉溶液作空白對照，陽性對照選用氫溴酸右美沙芬片，通過25%氨水噴霧誘發(fā)小鼠咳嗽模型，試驗(yàn)表明梨杷止咳合劑能顯著延長咳嗽潛伏期時間，且比氫溴酸右美沙芬片時間長；與空白對照組比較，咳嗽次數(shù)明顯減少（P＜0.05），與陽性藥對照組作用接近（P＞0.05），表明具有良好的止咳效果。梨杷止咳合劑通過抑制咳嗽中樞來達(dá)到鎮(zhèn)咳作用，這可能與苦杏仁降氣止咳，枇杷葉清肺止咳，甘草化痰止咳的功效有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，苦杏仁具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[14]，苦杏仁苷分解產(chǎn)生微量的氫氰酸，氫氰酸可對呼吸中樞產(chǎn)生抑制作用從而止咳平喘；枇杷葉水煎液具有止咳、化痰、平喘之功效，常用于治療急慢性呼吸道疾病[15]；甘草覆蓋在發(fā)炎的咽部黏膜上，可緩和炎性刺激而鎮(zhèn)咳。

小鼠氣管酚紅排泌法是較常用的祛痰試驗(yàn)方法，空白對照選用0.9%氯化鈉溶液，陽性對照選用氯化銨。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，供試品組小鼠的酚紅排泌量顯著增加（P＜0.05），與陽性藥對照組比較，無顯著差異（P＞0.05），表明有良好的祛痰效果。這可能與桔梗宣肺利咽、祛痰排膿，枇杷葉清肺止咳，甘草化痰止咳的功效有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桔梗水提液鎮(zhèn)咳、祛痰療效顯著[16]；張娜等[17]發(fā)現(xiàn)，枇杷葉水提物能顯著增加小鼠的酚紅排泌量；甘草通過促進(jìn)咽部和支氣管黏液的分泌，使痰易于咳出，呈現(xiàn)祛痰鎮(zhèn)咳作用[18]。

平喘作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組比較，供試品組明顯延長哮喘發(fā)作潛伏期時間（P＜0.05），與陽性藥對照組比較，無差異，表明梨杷止咳合劑有較好的平喘作用。這與方中苦杏仁降氣止咳平喘，枇杷葉清肺止咳、平喘，桑白皮瀉肺平喘等的功效有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉有祛痰、止咳、抗炎作用。HUANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉三萜酸影響慢性支氣管炎大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)，枇杷葉三萜酸通過抑制一氧化氮（NO）濃度增加、抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化、抑制iNOS表達(dá)，以達(dá)到治療慢性支氣管炎的作用。譚冰心等[20]研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉粗提物可以抑制與哮喘和慢性阻塞性肺炎等炎性疾病密切相關(guān)的磷酸二酯酶4（PDE4）的活性，表明枇杷葉止咳平喘的藥理作用與PDE4相關(guān)。桑白皮具有止咳、平喘、祛痰、利尿等多種藥理作用，還有免疫調(diào)節(jié)、抗過敏、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[21]。秦向征等[22]研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮水煎液明顯抑制哮喘小鼠模型炎性細(xì)胞，并使之減少，可有效改善肺部炎性癥狀，這可能是桑白皮平喘的主要作用機(jī)制。

中醫(yī)學(xué)講究整體觀與辨證論治，故在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下使用的中藥復(fù)方制劑是一個有機(jī)的整體，不是單純的藥物藥效疊加，一般通過嚴(yán)格的配伍，增強(qiáng)療效，減少毒副作用，以實(shí)現(xiàn)單味藥物所不能起到的藥理作用。總之，梨杷止咳合劑具有良好的止咳、化痰、平喘作用。