節(jié)律基因CRY在腫瘤中的研究進(jìn)展

杜勝奇,鐘江利,李福青，王 紅

生物鐘由視交叉上核在內(nèi)的中央時鐘和肝臟、胰腺、肌肉、心臟和脂肪組織等外圍時鐘組成[1]。生物鐘代表古老的計時機(jī)制，通過眼睛對光線強(qiáng)度的感知，中央時鐘及外圍時鐘協(xié)同規(guī)范人類的作息、飲食和生殖等生理節(jié)奏，而生物鐘紊亂已被廣泛證明與腫瘤相關(guān)[2-4]。生物鐘的維持還需要節(jié)律基因的調(diào)節(jié)，CRY基因作為核心節(jié)律基因之一，在植物光解酶結(jié)構(gòu)研究中首次被發(fā)現(xiàn)。雖然動物體內(nèi)部分CRY蛋白已經(jīng)失去了感光能力，卻是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)的參與者，這些級聯(lián)反應(yīng)控制著晝夜節(jié)律、新陳代謝和DNA損傷反應(yīng)等，CRY基因異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。本文對節(jié)律基因CRY在腫瘤中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述如下。

1 節(jié)律基因概述

分子水平上，生物鐘的維持依賴于節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄翻譯正負(fù)反饋調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)的節(jié)律基因有CRY1、CRY2、PER1、PER2、PER3、CLOCK、BMAL1，NPAS2、CKIε、Tim、NR1D1、NR1D2、RORα、RORβ及RORγ等。由CLOCK、BMAL1正調(diào)控基因及CRYs、PERs負(fù)調(diào)控基因構(gòu)成了最主要的反饋調(diào)節(jié)回路。 CLOCK/BMAL1二聚體正調(diào)控CRYs和PERs基因表達(dá)，于細(xì)胞質(zhì)中形成CRYs/PERs蛋白復(fù)合物,積累到一定程度后進(jìn)入細(xì)胞核，負(fù)調(diào)控CLOCK/BMAL1二聚體表達(dá)，隨后CRYs/PERs復(fù)合物降解解除了對CLOCK/BMAL1二聚體的抑制，促進(jìn)了新的循環(huán)。這一循環(huán)周期為24 h，構(gòu)成了人體最基本的晝夜節(jié)律[6]。CRYs基因參與的負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)對維持晝夜節(jié)律是至關(guān)重要的，且比PERs基因具有更重要的地位[7]。

2 CRY基因抑癌作用

癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CRY基因在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)[8]，表明CRY基因可能存在腫瘤抑制作用，但作用機(jī)制卻鮮有報道。FBXL3(F-box/leucine-rich repeat protein 3)是SCF (SKP1-CUL1-F-box-protein)E3泛素連接酶復(fù)合物的組成部分，CRY1或CRY2作為SCFFBXL3的輔助因子提供了潛在的底物資源，參與了多種蛋白的泛素化及降解，包括c-MYC蛋白、 TLK2(tousled-like kinase 2)蛋白等，CRY1基因缺陷和(或)CRY2表達(dá)減少提高了TLK2蛋白豐度，CRY2表達(dá)減少使c-MYC蛋白整體水平升高[9-10]。TLK2的擴(kuò)增和過表達(dá)機(jī)械性的損害由CHK1/2參與的DNA損傷檢查點信號，導(dǎo)致G2/M檢查點缺陷，DNA修復(fù)過程延遲，染色體不穩(wěn)定性升高[11]，而c-MYC是最常見的致癌基因之一，調(diào)控包括細(xì)胞生長周期、核糖體生物合成和代謝在內(nèi)的生理過程，c-MYC蛋白表達(dá)增加與多種原發(fā)性癌癥相關(guān)[12]?？梢?，CRY基因在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及組織代謝中起到重要作用，而CRY基因是否還存在其他抑癌機(jī)制需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)。

3 CRY基因表達(dá)與腫瘤相關(guān)性

3.1CRY基因與結(jié)直腸癌 糖酵解對腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲至關(guān)重要，即使存在充足的氧氣，癌細(xì)胞也會表現(xiàn)出高水平的糖酵解。Guo等[13]提出在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-181d通過保護(hù)c-MYC蛋白免受FBXL3和CRY2介導(dǎo)的降解而促進(jìn)有氧糖酵解，證實了CRY基因參與的c-MYC蛋白降解是重要的腫瘤保護(hù)機(jī)制。Mazzoccoli等[14]對50例結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中CRY基因表達(dá)進(jìn)行測定，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)結(jié)果顯示，相比于癌旁正常組織，結(jié)直腸癌組織中CRY1和CRY2mRNA水平均顯著降低，提示CRYs低表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)。在臨床和病理特征上，腫瘤組織中較低的CRY1表達(dá)水平與年齡(62～74 歲)、女性以及腫瘤位置(橫結(jié)腸)存在顯著的相關(guān)性，同樣CRY2低表達(dá)與腫瘤位置(橫結(jié)腸)相關(guān)，根據(jù)其研究結(jié)果，推測結(jié)直腸癌在60～74歲人群及女性中好發(fā)，好發(fā)部位為橫結(jié)腸。與流行病學(xué)研究一致的是老年人中結(jié)直腸癌的發(fā)病率較高，但好發(fā)部位位于遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸，且男性發(fā)病率高于女性[15]。因此，并不能單純使用CRY基因表達(dá)水平來預(yù)估結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險，還需要更深入研究CRY基因在結(jié)直腸癌中的具體作用及機(jī)制。

3.2CRY基因與肝癌 肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)和膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)占原發(fā)性肝癌的絕大多數(shù)，是我國第2大癌癥相關(guān)死亡原因[16]。生物鐘紊亂可引起小鼠肝臟代謝整體性改變，不僅通過加速細(xì)胞質(zhì)糖酵解促進(jìn)脂肪的合成和儲存，而且增加氧化應(yīng)激和支持細(xì)胞快速分裂的前體合成，從而促進(jìn)肝纖維化和原發(fā)性肝癌進(jìn)展[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)CRY1在肝癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平顯著低于正常肝組織，且其表達(dá)水平與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[17]。Mteyrek等[18]實驗證實了CRY基因異常與肝癌相關(guān)，經(jīng)二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)5個月后，與野生型小鼠相比，CRY1-/-CRY2-/-小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝發(fā)育不良，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平數(shù)倍升高；組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)DEN暴露誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌數(shù)量(包括HCC及膽管癌)是野生型小鼠的近5倍，但HCC平均數(shù)量沒有顯著差異，CCA平均數(shù)量增加了近8倍，CRY1及CRY2基因低表達(dá)可能是原發(fā)性肝癌(尤其是CCA)的重要危險因素。另有研究納入489例接受根治性切除術(shù)的HCC，對13種節(jié)律基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)與臨床預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，攜帶CRY1rs3809236變異基因的患者相比野生純合子型，肝癌的總生存率降低且復(fù)發(fā)率增加[19]。CRY1rs3809236位于CRY1基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)，可能導(dǎo)致CRY1基因mRNA表達(dá)異常，結(jié)合上述研究表明，CRY1蛋白表達(dá)水平與肝癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)，而是否存在CRY1rs380923可作為評估預(yù)后的標(biāo)志物。

3.3CRY基因與胃癌 丁海濱和楊勇[20]對106份胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，CRY1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且與浸潤深度、組織學(xué)分化程度以及TNM分期相關(guān)，且經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)CRY1陽性和陰性患者5年總生存率分別為58.33%(28/48)和79.31%(46/58)，表明CRY1陽性表達(dá)降低了胃癌預(yù)后。然而，癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫分析卻顯示CRY2基因在胃癌組織中低表達(dá)，涉及CRY2基因在胃癌中功能研究卻罕有報道[8]。有研究表示DNA損傷后，CRY1和CRY2具有不同的功能，CRY1-/-細(xì)胞對基因毒性應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)增強(qiáng)，而CRY2-/-細(xì)胞則減弱[21]，也許可以解釋CRY1、CRY2在胃癌組織中表達(dá)差異形成原因。

3.4CRY基因與胰腺癌 Relles等[22]采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤組織(n=65)、鄰近正常胰腺組織(n=34)及胰腺良性病變組織(n=16)中CRY1和CRY2mRNA表達(dá)水平，并按中位數(shù)分為高低表達(dá)組分析其預(yù)后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CRY2低表達(dá)組中位存活時間明顯縮短，且2年生存率約為高表達(dá)組的一半(22.3% vs 43.9%，P=0.0270)。由此可見，CRY2基因表達(dá)下調(diào)與胰腺癌生存預(yù)后相關(guān)，可作為預(yù)測胰腺癌生存結(jié)局的標(biāo)志。而與正常胰腺組織及胰腺良性組織(包括胰腺腺瘤、囊腺瘤、上皮性囊腫或?qū)Ч軆?nèi)乳頭狀黏液腫瘤)相比，腫瘤組織中CRY2基因表達(dá)降低，因此CRY2基因還可能作為胰腺腫瘤標(biāo)志物區(qū)分良惡性病變，但需要更大樣本的研究來證明其臨床意義。

3.5CRY基因與乳腺癌 乳腺癌位居我國女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，且呈緩慢上升趨勢，明確其發(fā)病機(jī)制對其防治有重要意義[16,23]。倒班工作造成的晝夜節(jié)律紊亂已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)分級為可能的人類致癌物2A組，大量流行病學(xué)研究表明夜班工作會增加乳腺癌的發(fā)病率和病死率，基因特異性和全基因組分析顯示，長期倒班工作導(dǎo)致多個節(jié)律基因啟動子甲基化以及癌癥相關(guān)基因的類似變化[4]。Mao等[24]發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，乳腺癌患者CRY2啟動子甲基化程度更高。他們同時探索了CRY2與乳腺癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性及其在DNA甲基化等表觀遺傳過程中的參與。通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與相鄰的正常組織或健康對照組的乳腺組織相比，乳腺癌組織中CRY2表達(dá)下調(diào)；而且CRY2低表達(dá)與雌激素受體陰性、腫瘤高分化及較短總生存時間相關(guān)。全基因組甲基化分析顯示共有1245個CpG位點隨著CRY2基因敲除而改變，包括細(xì)胞增殖(BAG1、CHKA)、凋亡(BCL2、BCL3)、黏附(CD44、CADM1)、侵襲和遷移(GPR54、GCNT2和USP4)以及激素調(diào)節(jié)(NR3C1、MTNR1A和PRLP)等基因。因此，CRY2基因表達(dá)減少在乳腺癌中導(dǎo)致了廣泛地與癌癥相關(guān)的表觀遺傳失控，CRY2基因可能作為乳腺癌易感性、進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.6CRY基因與骨肉瘤 骨肉瘤作為青少年常見惡性腫瘤，化學(xué)治療及手術(shù)治療效果欠佳[25]。為探究節(jié)律基因異常對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展影響，Yu等[26]發(fā)現(xiàn)CRY2基因敲除促進(jìn)了人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CRY2敲除后基質(zhì)金屬蛋白酶2和β-catenin蛋白表達(dá)增加，基質(zhì)金屬蛋白酶2通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)成分促進(jìn)腫瘤侵襲，而β-catenin的異常激活與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)?；谏鲜鲅芯?，初步認(rèn)為CRY2基因在骨肉瘤具有腫瘤抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)CRY2敲除降低了p53的表達(dá)，增加了c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)，并通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞數(shù)量增加，G1期細(xì)胞數(shù)量減少，再次證實了CRY基因調(diào)控細(xì)胞周期參與了骨肉瘤的演變[26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CRY1施加其腫瘤抑制活性是通過活化Akt/p53/p21信號通路，發(fā)揮Cdk2的抑制作用，控制細(xì)胞G1/S期過渡[27]。上述研究表明了CRY基因與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，可能作為治療骨肉瘤的目標(biāo)靶點。

3.7CRY基因與其他腫瘤 除上述腫瘤外，關(guān)于CRY基因的研究還涉及其他腫瘤，包括子宮內(nèi)膜癌、頭頸部鱗癌、皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸膜間皮瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病[28]、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌[29]及醛固酮腺瘤[30]等。CRY基因作為腫瘤抑制基因，在不同腫瘤中具體作用機(jī)制尚不清楚，但現(xiàn)有研究表明其在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、組織代謝及慢性炎癥等方面均起到重要作用，有待進(jìn)一步的研究來佐證[3,5,31-32]。

4 CRY基因與腫瘤化學(xué)治療

4.1CRY基因與結(jié)直腸癌化學(xué)治療 隨機(jī)選擇16例Ⅲ期原發(fā)性結(jié)直腸癌接受新輔助化學(xué)治療前腫瘤組織標(biāo)本，分為完全緩解和部分緩解組，腫瘤穩(wěn)定和腫瘤進(jìn)展組各8例，發(fā)現(xiàn)腫瘤穩(wěn)定和腫瘤進(jìn)展組具有更高的CRY2表達(dá)，表明CRY2高表達(dá)可能對新輔助化學(xué)治療存在不利影響[33]。Fang等[33]對289例結(jié)直腸癌Kaplan Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)CRY2高表達(dá)與較低的生存率相關(guān)，在接受輔助化學(xué)治療的患者中其相關(guān)性更明顯。為了進(jìn)一步研究CRY對結(jié)直腸癌化學(xué)治療的影響，使用特異性siRNA下調(diào)CRY2在DLD-1、SW480 細(xì)胞系中表達(dá)，結(jié)果加速了奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明CRY2低表達(dá)增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞對化學(xué)治療的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)過表達(dá)提高了結(jié)直腸癌細(xì)胞株對奧沙利鉑的敏感性，而CRY2以劑量依賴性方式隨著FBXW7增加而降低,FBXW7通過提高CRY2泛素化水平負(fù)向調(diào)控CRY2的穩(wěn)定性，因此FBXW7-CRY2軸在化學(xué)治療敏感性中至關(guān)重要，同時在289例人結(jié)直腸癌腫瘤組織中觀察到FBXW7-CRY2軸的失調(diào)[33]。以上證實CRY2表達(dá)水平可能用于預(yù)測結(jié)直腸癌患者對化學(xué)治療的敏感性，而對CRY2蛋白抑制將是一種有效的治療方法用于克服腫瘤耐藥性的形成

4.2CRY基因與胃癌化學(xué)治療 Qu等[34]使用COX回歸模型，對1030例胃腺癌根治性切除術(shù)總生存率和5種節(jié)律基因(CRY1-2、PER1-3)中13個SNPs進(jìn)行相關(guān)性分析，其中包括CRY1rs1056560在內(nèi)的3個SNPs被證明與胃癌總生存率高度相關(guān)，并且在CRY1rs1056560等位基因突變型(TG/GG)胃癌患者中，鉑類輔助化學(xué)治療對患者生存預(yù)后具有更顯著保護(hù)作用，表明CRY1rs1056560可能作為胃癌對鉑類藥物敏感性的預(yù)測性標(biāo)志物。SNPs在調(diào)控基因表達(dá)、mRNA降解和翻譯及影響蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，相比于野生純合子基因型(TT)患者，基因突變型(TG/GG)CRY1基因mRNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)，表明rs1056560這一可遺傳的變異降低了CRY1合成，結(jié)合上述研究，證實胃癌化學(xué)治療預(yù)后與CRY1基因低表達(dá)呈正相關(guān)。

5 小結(jié)

由于消化和內(nèi)分泌功能具有明顯節(jié)律性與我們進(jìn)食、作息相關(guān)，如上述，晝夜節(jié)律紊亂更多地增加了相關(guān)癌癥易感性[29,35]。可以看到，節(jié)律基因CRY作為腫瘤抑制基因，參與了細(xì)胞周期、DNA損傷及組織代謝過程，其異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，同時也影響了化學(xué)治療的敏感性和預(yù)后。未來臨床對于CRY基因的檢測，可能作為預(yù)測相關(guān)腫瘤風(fēng)險以及化學(xué)治療敏感性的重要指標(biāo)；如能進(jìn)一步人為調(diào)控CRY基因在腫瘤組織中表達(dá)，抑制腫瘤發(fā)展，將為腫瘤的治療提供新方向。