黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的流變學(xué)性質(zhì)

陳發(fā)河，周彥強(qiáng)，吳光斌

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentusL. Moench），也稱秋葵、羊角菜，起源于非洲，目前在我國(guó)南北方廣泛種植[1-2]。黃秋葵嫩莢中含有大量的黏性多糖物質(zhì)，其主要成分包括果膠多糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖及少量糖蛋白[3]，黃秋葵莢果中含有的黏性多糖物質(zhì)具有抗疲勞[4-5]、增強(qiáng)免疫力[6]、降低血脂[7]等功能。

果膠作為一種親水性植物膠，常存在于高等植物的根、莖、葉和果實(shí)中。果膠具有良好的增稠性、凝膠性、穩(wěn)定性、乳化性等，常作為天然食品添加劑應(yīng)用于果汁飲料、果凍、果醬、乳酸等食品的加工中。研究表明，黃秋葵嫩果中含蛋白質(zhì)約2.5%，含果膠多糖約24.8%[8]，可用作食品乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑[9-10]以及用作藥片緩釋膜[11]。黃秋葵果實(shí)的利用方式主要是嫩莢用作烹飪，有學(xué)者研究了黃秋葵酒的發(fā)酵工藝[12]，亦有企業(yè)研發(fā)出黃秋葵酒投放市場(chǎng)，但黃秋葵酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量酒渣尚未得到充分利用。國(guó)內(nèi)關(guān)于黃秋葵的研究主要集中在果膠多糖、黃酮等活性成分的提取工藝及理化性質(zhì)方面[2,13]，對(duì)黃秋葵發(fā)酵酒渣制備的果膠多糖的流變學(xué)特性鮮有報(bào)道。黃秋葵果膠多糖的溶液是一種非牛頓流體，具有很明顯的剪切稀化現(xiàn)象，黃秋葵果膠多糖的這種特殊性質(zhì)可能具有進(jìn)一步利用的潛力。本實(shí)驗(yàn)研究了黃秋葵果膠多糖和黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的流變學(xué)性質(zhì)，以期為黃秋葵發(fā)酵酒渣的綜合利用和黃秋葵果膠的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃秋葵果莢、黃秋葵發(fā)酵酒渣 廈門市如意情有限公司。將發(fā)酵后的酒渣曬干，然后粉碎過40 目篩后冰箱保存?zhèn)溆谩⑿迈r黃秋葵果莢烘干，然后粉碎過40 目篩后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、纖維素酶、聚二甲基硅氧烷、咔唑（均為分析純） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)；鼠李糖、葡萄糖醛酸（均為色譜純） 北京索萊寶科技有限公司；半乳糖醛酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP，純度≥99.9%）、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配2489紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；Discover HD2流變儀 美國(guó)TA公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Cary50紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；WM1烏氏黏度儀上海玻璃儀器公司；RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；PE20K型pH計(jì)、LE204E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；WB-14恒溫水浴鍋 德國(guó)Memmert公司；ULT1386 －80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher公司；MA35快速水分測(cè)定儀 德國(guó)賽多利斯公司；FD-1D-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵黃秋葵發(fā)酵酒渣和黃秋葵果膠多糖提取

分別稱取一定量的黃秋葵發(fā)酵酒渣和黃秋葵粉，用20 倍70%的乙醇溶液浸提2 次（室溫，1 h），然后使用5 倍氯仿和甲醇的混合溶劑（1∶1，V/V）提取1 h除去色素等雜質(zhì)，最后使用丙酮洗滌后烘干，得到醇不溶固形物（alcohol-insoluble solid，AIS）備用。精確稱取2.00 g AIS，加入一定量的超純水和纖維素酶，使用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值；在一定溫度下水浴振蕩提取一定時(shí)間后，8 000×g離心10 min收集濾液；濾液于45 ℃旋蒸濃縮；冷卻后加入3 倍體積的95%乙醇，4 ℃放置過夜，4 000×g離心10 min。最后得到的沉淀分別用75%乙醇溶液和無水乙醇溶液洗滌，復(fù)水溶解后冷凍干燥，分別得到黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖，備用。黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖得率分別為（6.85±0.21）%和（7.23±0.66）%。

1.3.2 黃秋葵酒渣果膠多糖的流變學(xué)特性的測(cè)定

1.3.2.1 特性黏度和黏均分子質(zhì)量的測(cè)定

特性黏度反映了高聚物分子與溶劑分子的內(nèi)摩擦。大分子聚物的分子質(zhì)量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦也大，表現(xiàn)出的特性黏度也大。使用烏氏黏度儀（0.010 13 mm2/s2，ID：0.5～0.6 mm）測(cè)定黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的特性黏度。根據(jù)式（1）計(jì)算：

對(duì)于某一個(gè)指定的黏度計(jì)，省略相關(guān)值，同時(shí)引入比黏度ηr（溶質(zhì)的黏度與溶劑的黏度之比），則上述公式可以轉(zhuǎn)化為：

式中：η0為純?nèi)軇┑酿ざ龋沪菫橥瑴囟认戮酆衔锶芤旱酿ざ?；t為溶液的流出時(shí)間；t0為溶劑的流出時(shí)間。根據(jù)公式，只需測(cè)定果膠多糖溶液和溶劑的流出時(shí)間即可計(jì)算溶液的比黏度ηr。配制果膠多糖的溶液的質(zhì)量濃度為0.01～0.15 g/dL，在30 ℃的條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度做3 次平行并取平均值。

特性黏度的外推通常有2 種方法，分別是使用Huggins方程或是Kraemer方程外推無限稀濃度得到。其公式分別如下：

式中：ηsp為增比黏度，其數(shù)值等于ηr－1；K和β分別為Huggins和Kraemer常數(shù)。特性黏度與分子質(zhì)量之間的經(jīng)驗(yàn)關(guān)系式為：

式中：M為黏均分子質(zhì)量；K為比例常數(shù)；α為與分子形狀有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。K和α值在一定條件下恒定，其數(shù)值可通過其他方法確定。

當(dāng)溶液的黏度在中間呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象而在低、高剪切下則均為幾乎不依賴于剪切速率的常數(shù)，此輪廓特征與Cross model較為符合[14]，其公式如下：

式中：η0和η∞分別為零剪切黏度和無窮大黏度；λcr為Cross松弛時(shí)間；n為Cross指數(shù)。使用TA analysis軟件將數(shù)據(jù)與此模型擬合，可以得到零剪切黏度，無窮大剪切黏度、Cross松弛時(shí)間和Cross指數(shù)。

Cox-Merz作為一個(gè)跨體系的普適性經(jīng)驗(yàn)公式，聯(lián)系著2 類性質(zhì)完全不同的流變測(cè)量[15]。一個(gè)是大形變的穩(wěn)態(tài)剪切實(shí)驗(yàn)測(cè)得到的量高分子材料典型的非線性黏性，或稱“結(jié)構(gòu)黏性”，在微觀尺度上，測(cè)量了分子鏈的滑行、定向，解纏繞或弱相互作用鍵的破壞；另一個(gè)是小幅度振幅動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量了材料的線性黏彈性，在微觀尺度上表示大分子鏈的柔順性。熔體和均一溶液的穩(wěn)態(tài)剪切黏度η（η=τ/γ）和小振幅動(dòng)態(tài)剪切的復(fù)合黏度η*（η*=σ/γω=（G’2＋G’’2）1/2/ω）分別對(duì)角頻率和剪切速率的數(shù)值作圖所得的曲線基本重合，即Cox-Merz關(guān)系式：

1.3.2.2 流變學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用TA Discover DH-2旋轉(zhuǎn)流變儀，實(shí)驗(yàn)溫度由循環(huán)水浴及帕爾貼系統(tǒng)控制，精度為±0.1 ℃。

流動(dòng)階梯實(shí)驗(yàn)：使用TA Discover DH-2旋轉(zhuǎn)流變儀，配合60 mm 2°的錐形鋁板，設(shè)定溫度25 ℃，剪切速率掃描范圍0.001～1 000 s－1進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定的穩(wěn)態(tài)條件為：在3 個(gè)連續(xù)的數(shù)據(jù)采集周期內(nèi)扭矩的變化均小于前一周期的5%，但每一數(shù)據(jù)點(diǎn)的最長(zhǎng)采樣時(shí)間為2 min。探究Flow Sweep模式下剪切速率黏度隨著剪切速率的變化情況。

線性黏彈區(qū)域的確定：使用60 mm 2°的錐形鋁板，固定振蕩頻率1 Hz，應(yīng)力范圍0.1%～100%，設(shè)定溫度25 ℃，使用Oscillation Amplitude模式，探究不同樣品的線性黏彈范圍。

振蕩掃描實(shí)驗(yàn)：頻率掃描實(shí)驗(yàn)使用60 mm 2°的錐形鋁板，設(shè)定應(yīng)力在線性黏彈區(qū)域內(nèi)，溫度25 ℃，頻率范圍0.01～100 rad/s，使用Oscillation Frequency模式，探究不同角頻率下儲(chǔ)能模量（G’）和耗能模量（G’’）的變化。

溫度斜坡的振蕩實(shí)驗(yàn)使用60 mm的平行鋁板，設(shè)定應(yīng)力在線性黏彈區(qū)域內(nèi)，角頻率10 rad/s，斜坡速率5 ℃/min，溫度范圍10～95 ℃，間隙800 μm。為了避免高溫度溶劑的揮發(fā)，采用輕質(zhì)硅油（聚二甲基硅氧烷，25 ℃黏度為10 mPa·s）覆蓋其暴露的邊緣。使用Oscillation Temperature Ramp探究溫度變化對(duì)模量的影響。

1.3.3 黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖及其理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 果膠多糖含量的測(cè)定

對(duì)復(fù)水溶解后的果膠多糖溶液，使用苯酚-硫酸比色法[16]測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法：配制0.01～0.08 mg/mL的8 個(gè)質(zhì)量濃度的半乳糖溶液，各取1 mL加入具塞玻璃試管中，再加入1 mL 6%的苯酚溶液，混勻后加入5 mL濃硫酸，沸水浴20 min。使用蒸餾水作對(duì)照，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.3.2 水分含量的測(cè)定

采用快速水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 pH值的測(cè)定

參照QB 2484—2000《食品添加劑 果膠》中的方法，用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.4 半乳糖醛酸含量的測(cè)定

采用咔唑硫酸法測(cè)定其半乳糖醛酸的含量[17]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取咔唑0.150 g定容至100 mL乙醇溶液中，得到1.5 g/L的咔唑溶液。配制10、20、30、40、50、60、70 μg/mL半乳糖醛酸溶液，各取1 mL于試管中，然后各加入濃硫酸6 mL，混合均勻；沸水浴15 min，冷卻至室溫后加入1.5 g/L咔唑溶液1 mL，混合均勻，室溫下避光放置1 h；以超純水為空白測(cè)定526 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y＝0.005 1X－0.011 0（R2＝0.995 5）。

1.3.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用福林-酚法[18-19]略作修改測(cè)定果膠多糖中的蛋白質(zhì)含量。

溶液的配制：A液：1 g Na2CO3溶于50mL0.1mol/LNaOH溶液中；B液 ：0.5gCuSO4· 5 H2O 溶 于100 mL 1 g/100 mL的酒石酸鉀鈉溶液。甲液：取50 mL A液與1 mL B液混合。乙液：福林-酚溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入甲液5 mL，振蕩均勻后靜置10 min；再加入0.5 mL乙液，振蕩均勻后靜置30 min。以超純水為空白測(cè)定其650 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：配制一定濃度的果膠多糖溶液，取1 mL待測(cè)溶液，按照制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的操作方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.6 酯化度的測(cè)定

參照GB 25533—2010《食品添加劑 果膠》等方法[20]測(cè)定，并稍作修改。

稱取2 g果膠多糖于燒杯中，加入50 mL鹽酸-乙醇溶液（濃鹽酸-75%乙醇（1∶100，V/V）），攪拌10 min；過濾，真空抽吸濾干后用鹽酸-乙醇溶液洗滌6 次，每次用10 mL，再用乙醇溶液沖洗至濾出物不含氯離子，最后用20 mL無水乙醇沖洗濾干，在105 ℃干燥2 h，冷卻后稱質(zhì)量。

稱取0.5 g干燥后的果膠樣品于250 mL具塞錐形瓶，滴加少量無水乙醇潤(rùn)濕。加入100 mL超純水振蕩至完全溶解。以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定，記錄下所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V1。加入20.0 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，振搖后靜置15 min，加入20.0 mL 0.5 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行中和，振搖至粉紅色消失。最后使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定，記錄此步驟所消耗的0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積為V2。酯化度按照式（8）計(jì)算[21-22]：

1.3.3.7 色差分析

黃秋葵酒渣果膠多糖的色差，使用指標(biāo)L*、a*、b*和ΔE表示，在Brookfield SC-80C型自動(dòng)色差儀上進(jìn)行測(cè)定，平行3 份，結(jié)果取平均值。其中L*代表明度；a*代表紅綠色度，a*＞0代表紅色，a*＜0表示綠色；b*代表黃藍(lán)色度，b*＞0表示黃色，b*＜0表示藍(lán)色；ΔE表示色差。

1.3.3.8 單糖組成的分析

采用PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定黃秋葵果膠多糖的單糖組成[23]。

Nour[24]和Ferreira[25]等認(rèn)為可以根據(jù)鼠李糖與半乳糖醛酸的比值確定果膠多糖分子中半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）和鼠李半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）I的比例。Houben等[26]也根據(jù)這個(gè)原理，按照式（9）式（10）計(jì)算HG和RG I物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)：

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Adobe Photoshop軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵酒渣果膠多糖的流變學(xué)特性

2.1.1 特性黏度和黏均分子質(zhì)量

分別將圖1和圖2曲線外推可以得到特性黏度。對(duì)黃秋葵酒渣果膠多糖，通過Huggins和Kraemer計(jì)算得到的[η]分別為41.89 dL/g和41.28 dL/g；而對(duì)于黃秋葵酒渣果膠多糖，[η]分別為5.15 dL/g和4.71dL/g。使用烏氏黏度儀測(cè)得的此黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的特性黏度分別為41.12 dL/g和4.66 dL/g。

多糖溶液的流變學(xué)特性很大程度上取決于水和大分子對(duì)水溶液的空間占據(jù)量。特性黏度的數(shù)值用來表示相互分散的單個(gè)大分子聚合物所占有的溶液體積，并非傳統(tǒng)意義上的動(dòng)力黏度[27]。酒渣中提取的黃秋葵果膠多糖的特性黏度明顯低于原始黃秋葵果膠多糖較低的特性黏度可能是由于分子質(zhì)量的降低，亦或是分子內(nèi)相互作用導(dǎo)致的分子收縮或分子鏈的隨機(jī)纏繞使其在水溶液中的空間占有量減小。本實(shí)驗(yàn)中黃秋葵經(jīng)過發(fā)酵后的酒渣果膠多糖特性黏度的降低，可能是由于發(fā)酵過程中果膠多糖分子鏈的破壞導(dǎo)致其分子質(zhì)量的下降，從而導(dǎo)致單個(gè)分子占據(jù)的溶液體積的下降，使得特性黏度下降。

此外，Huggies常數(shù)K還可以提供分子鏈柔性的近似信息。在不同的分子鏈柔性和分子鏈之間不同的相互作用下，導(dǎo)致K值的大小不同。K值在0.2～0.8之間通常表示較為柔性的分子鏈，K值大于2則表示其分子可能為不帶電的球型分子[28-29]。本實(shí)驗(yàn)中黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的Huggies常數(shù)分別為和0.55和0.59，說明2 種分子鏈都具有較好的柔性，同時(shí)也可以說明黃秋葵酒渣果膠多糖分子質(zhì)量的降低并沒有對(duì)分子鏈的柔性造成太大影響。

將Huggies方程和Kramer方程得到的特性黏度取平均值計(jì)算黏均分子質(zhì)量，得到黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的黏均分子質(zhì)量分別為2.47×105g/mol和1.466×106g/mol。

圖1 黃秋葵果膠多糖溶液的uggins和Kraemer曲線Fig. 1 Huggins and Kraemer plots of aqueous pectic polysaccharide solutions from okra

圖2 黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖溶液的uggins和Kraemer曲線Fig. 2 Huggins and Kraemer plots of aqueous pectic polysaccharide solutions from okra wine pomace

2.1.2 流動(dòng)階梯實(shí)驗(yàn)

由圖3、4可知，在0.01～2 000 s－1剪切速率范圍內(nèi)，2 種溶液的黏度都隨溶液質(zhì)量濃度的加大而增大，而對(duì)每種質(zhì)量濃度的溶液，其黏度隨著剪切速率的增加而減小，其變化趨勢(shì)為非牛頓流體中的假塑性流體，具有明顯的剪切稀化現(xiàn)象。剪切稀化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要有[30]：1）各向異性的粒子隨著流體流向的定向排列導(dǎo)致了流體動(dòng)力學(xué)的交聯(lián)程度的減少；2）聚合的分子在剪切力的作用下分解，減少了流體動(dòng)力的干擾；3）以隨機(jī)線圈的形式存在的聚合物分子在流動(dòng)過程中被拉伸；4）乳狀的液滴在流動(dòng)狀態(tài)下變?yōu)榱骶€形狀。果膠多糖是一種大分子聚合物，在水溶液中以隨機(jī)線圈的形式存在，同時(shí)也有團(tuán)聚現(xiàn)象。在高速剪切力下分子在剪切流場(chǎng)中逐漸解纏并取向，這使得其具有明顯的剪切稀化現(xiàn)象。

相比于黃秋葵果膠多糖溶液，黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖溶液的黏度要明顯降低，0.1 g/dL的黃秋葵果膠多糖溶液在低剪切速率的黏度，與質(zhì)量濃度為5 g/dL黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖溶液的黏度大致相等。黃秋葵酒渣經(jīng)過了較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過程，可能會(huì)造成果膠多糖分子鏈的斷裂，使得其分子質(zhì)量變小，從而減少了水溶液中分子間的相互纏繞，具有明顯的剪切稀化。黃秋葵酒渣果膠多糖這種假塑性特性在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的實(shí)際意義，其黏度范圍表明黃秋葵酒渣果膠多糖非常適合用作食品的增稠劑；又因?yàn)槠渚哂械募羟邢』F(xiàn)象和不成凝膠的特性，也可以用作工業(yè)中需要泵送或者攪拌的物料。

圖3 不同質(zhì)量濃度的黃秋葵酒渣果膠多糖的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)掃描曲線Fig. 3 Steady-state flow curves of different concentrations of pectic polysaccharides from okra wine pomace

圖4 不同質(zhì)量濃度的黃秋葵果膠多糖的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)掃描曲線Fig. 4 Steady-state flow curves of different concentrations of pectic polysaccharides from okra

在圖3和圖4的雙對(duì)數(shù)曲線上，溶液的黏度在中間呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象而在低、高剪切速率下則均為幾乎不依賴于剪切速率的常數(shù)。

根據(jù)不同的質(zhì)量濃度下的零剪切黏度，計(jì)算比濃黏度ηsp。特性黏度與溶液的質(zhì)量濃度之積表示大分子占據(jù)的空間大小，將其作為橫坐標(biāo)，再將比濃黏度ηsp為縱坐標(biāo)，繪制雙對(duì)數(shù)曲線。通常可以用來探究隨機(jī)纏繞分子的臨界質(zhì)量濃度c*，其結(jié)果如圖5所示。臨界質(zhì)量濃度c*的數(shù)值可作為增稠劑添加量的參考，當(dāng)其質(zhì)量濃度大于臨界質(zhì)量濃度c*時(shí)，黏度的增加變得更快；而小于臨界質(zhì)量濃度時(shí)，黏度的變化緩慢。

圖5 黃秋葵酒渣果膠多糖溶液增比黏度對(duì)c*[η]做雙對(duì)數(shù)曲線Fig. 5 Zero shear specific viscosity versus reduced concentration c*[η]for pectin from okra wine pomace

從圖5可以看出，黃秋葵果膠多糖并沒有臨界質(zhì)量濃度c*；而黃秋葵發(fā)酵果膠多糖的臨界質(zhì)量濃度c*在4 g/dL附近，此時(shí)的分子空間占據(jù)量在20附近。在果膠多糖質(zhì)量濃度小于c*時(shí)，可以認(rèn)為溶液中的分子還是相互獨(dú)立，彼此的距離較遠(yuǎn)；而當(dāng)質(zhì)量濃度大于c*時(shí)，溶液的體積不足以提供每個(gè)分子需要的占據(jù)的空間，分子間的擠壓、穿插開始出現(xiàn)，使得此時(shí)的圖像斜率明顯上升。通常，無序的大分子鏈的雙對(duì)數(shù)曲線都可以部分疊加。本實(shí)驗(yàn)中黃秋葵酒渣果膠多糖的雙對(duì)數(shù)曲線與Ndjouenkeu等[31]報(bào)道的Dika nut多糖結(jié)果相類似。

2.1.3 線性黏彈區(qū)域的確定

線性黏彈性區(qū)域是指樣品的黏彈性與施加應(yīng)力或應(yīng)變的水平都相互獨(dú)立的應(yīng)變區(qū)域，即改變應(yīng)變的大小不影響G’和G’’的變化。線性黏彈區(qū)域是振蕩實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，所有的振蕩實(shí)驗(yàn)都必須在線性黏彈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖溶液的模量與施加應(yīng)變的關(guān)系如圖6和圖7所示?？梢钥闯觯瑑烧叩木€性黏彈區(qū)域都較寬，并且都隨著溶液質(zhì)量濃度的降低線性范圍收窄。較窄的線性范圍通常意味著溶液體系的不穩(wěn)定型增加或是溶液中有效分子質(zhì)量的減少。可以看出當(dāng)振蕩應(yīng)變大于10%或是小于2%時(shí)，溶液的模量不再是線形的，所以后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇5%作為振蕩實(shí)驗(yàn)的應(yīng)變。

圖6 黃秋葵酒渣果膠多糖溶液在不同質(zhì)量濃度下G’和G’’與振蕩應(yīng)變之間的關(guān)系Fig. 6 G’ and G’’ versus oscillation strain curves of pectin solutions from okra wine pomace at different concentrations

圖7 黃秋葵果膠多糖溶液在不同質(zhì)量濃度下G’和G’’與振蕩應(yīng)變之間的關(guān)系Fig. 7 G’ and G’’ versus oscillation strain curves of pectin solutions from okra at different concentrations

2.1.4 振蕩掃描實(shí)驗(yàn)

果膠多糖溶液屬于黏彈性物質(zhì)，其同時(shí)表現(xiàn)出固體和液體的特性，因此在線性黏彈區(qū)域內(nèi)，改變振蕩頻率或是改變固定頻率下的溫度，可以得到樣品的G’和G’’的變化，從而推斷其結(jié)構(gòu)性質(zhì)。圖8顯出了10 g/dL的黃秋葵酒渣果膠多糖溶液的黏度與溫度的關(guān)系。在10～90 ℃的溫度變化范圍內(nèi)，溶液的模量隨著溫度的升高而逐漸降低，且沒有明顯的G’和G’’急劇變化。這說明了在較廣的溫度范圍內(nèi)，黃秋葵酒渣果膠多糖沒有明顯凝膠化的性質(zhì)。當(dāng)溶液的溫度升高時(shí)，水分活度上升，果膠多糖分子鏈變得更為柔軟同時(shí)更加延展，這會(huì)增加分子流體力學(xué)體積，而且果膠多糖分子鏈之間相互作用的水平也會(huì)提高。同時(shí)，溫度上升也補(bǔ)償了分子之間摩擦所造成的能量損失。果膠多糖溶液的模量隨溫度增加而呈現(xiàn)出線性地降低，這可能是由于加熱影響了諸如弱范德華力的相互作用維持著的相對(duì)松散的網(wǎng)絡(luò)區(qū)域的剪切變形。

圖8 黃秋葵酒渣果膠多糖溶液G’和G’’隨溫度升高的變化Fig. 8 Effects of temperature on storage model and loss model of pectin from okra wine pomace

圖9 和圖10顯示了G’和G’’隨著角頻率的變化。在本實(shí)驗(yàn)的角頻率范圍內(nèi)，G’和G’’沒有顯示出交點(diǎn)；同時(shí)黃秋葵果膠多糖溶液的G’大于G’’，這說明原始黃秋葵果膠多糖溶液更多的表現(xiàn)出彈性而非黏性。G’和G’’都隨著角頻率的減小而減小。根據(jù)Schorsch等[32]的理論，G’與G’’的比例大于3時(shí)可認(rèn)為此溶液是一種強(qiáng)的凝膠，當(dāng)小于3且大于1時(shí)認(rèn)為此溶液是一種弱凝膠。所以黃秋葵果膠多糖溶液在實(shí)驗(yàn)的角頻率范圍內(nèi)是一種弱凝膠。從圖10可以看出，黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的G’’要略大于G’，表明發(fā)酵酒渣果膠多糖溶液更多表現(xiàn)出黏性而非彈性，這表明可在某些加熱的物料中用作添加劑。

圖9 黃秋葵果膠多糖溶液G’和G’’與頻率之間的關(guān)系Fig. 9 G’ and G’’ as a function of angular frequency for pectin solutions from okra at different concentrations

圖10 黃秋葵酒渣果膠多糖溶液G’和G’’與頻率之間的關(guān)系Fig. 10 G’ and G’’ as a function of angular frequency for pectin solutions from okra wine pomace at different concentrations

黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖3 種質(zhì)量濃度的水溶液的測(cè)定結(jié)果基本符合Cox-Merz公式（圖11）。但是在低剪切速率的時(shí)候出現(xiàn)了偏離，其復(fù)合黏度要大于穩(wěn)態(tài)剪切黏度，而在高剪切速率時(shí)并未出現(xiàn)此現(xiàn)象。所以，在使用Cox-Merz規(guī)則進(jìn)行非線性模型黏度預(yù)測(cè)的時(shí)候，高頻下的溶液可以使用此規(guī)則進(jìn)行預(yù)測(cè)，而低頻下會(huì)出現(xiàn)偏離，不適用此規(guī)則?？赡茉蚴屈S秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖在水溶液中會(huì)形成大分子纏結(jié)或聚集，同時(shí)這些新形成的結(jié)構(gòu)對(duì)穩(wěn)態(tài)剪切作用更為敏感，容易使其發(fā)生解團(tuán)聚或是分子鏈定向從而將其新形成的結(jié)構(gòu)破壞；而這些新形成的結(jié)構(gòu)對(duì)低頻率的小幅度振蕩剪切并不敏感，依然有足夠的時(shí)間可以維持或去重建這類的結(jié)構(gòu)，這就造成了低頻率的振蕩剪切得到的復(fù)合黏度大于穩(wěn)態(tài)剪切黏度的情況。這一結(jié)果與Kontogiorgos等[27]有關(guān)研究報(bào)道一致。

圖11 黃秋葵酒渣果膠多糖的Cox-Merz經(jīng)驗(yàn)關(guān)系式Fig. 11 Cox-Merz relationship of pectin from okra wine pomace

2.2 黃秋葵酒渣果膠多糖主要理化性質(zhì)

表1 黃秋葵酒渣果膠多糖的主要理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of pectic polysaccharide from okra wine pomace

從黃秋葵發(fā)酵酒酒渣中提取的黃秋葵酒渣果膠多糖和從黃秋葵果莢中提取的黃秋葵果膠多糖的主要理化性質(zhì)如表1所示。黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖兩者半乳糖醛酸含量相近，前者的酯化度明顯高于后者，兩者均為高酯果膠且高于QB 2484—2000《食品添加劑果膠》的標(biāo)準(zhǔn)。相比從黃秋葵酒渣中提取得到果膠多糖的半乳糖酸酸含量和蛋白質(zhì)含量較低，灰分較高，具有較高的酯化度。高脂果膠在食品加工中應(yīng)用較廣，相對(duì)于低酯果膠，高脂果膠凝膠速率快，凝膠溫度高，一般用可作為食品的增稠劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等。黃秋葵原料經(jīng)過了發(fā)酵，可能導(dǎo)致酯化度改變、灰分增加等性質(zhì)的變化。

2.3 黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組成

采用PMP柱前衍生HPLC法檢測(cè)黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的單糖組成，7 種單糖組分的含量如表2所示。從其單糖組成可以看出，黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖均含有甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，這表明這兩種果膠多糖均屬于酸性雜多糖，7 種單糖組分分別占這2 種來源的果膠多糖的54.7%和52.3%。

表2 黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組成（n=3）Table 2 Monosaccharides composition of okra pectin and pectin from okra wine pomace (n= 3)

圖12 黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖物質(zhì)的量比例（n=3）Fig. 12 Molar ratios of monosaccharides of okra pectin and pectin from okra wine pomace (n = 3)

由圖12可知，發(fā)酵后黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組分發(fā)生了部分變化。其中變化較為明顯的有鼠李糖的含量由20.0%減少到8.8%，半乳糖由22.3%增加到25.6%，葡萄糖由2.7%增加到30.6%，半乳糖由46.2%減少到20.4%，阿拉伯糖由4.8%增加到8.7%。在果膠多糖的結(jié)構(gòu)中，葡萄糖不常見[33-34]。細(xì)胞壁中的葡萄糖通常以纖維素的形式存在，而纖維素結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定且不溶于水。發(fā)酵后的酒渣果膠多糖中葡萄糖比例的大幅度增加可能與發(fā)酵過程中部分蔗糖添加有關(guān)。鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的變化可能與黃秋葵的成熟度以及不同的品種有關(guān)，植物成熟度的增加會(huì)使得原果膠多糖向水溶性果膠多糖轉(zhuǎn)化。而阿拉伯糖的增加可能與纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞有關(guān)。在Sengkhamparn等[35-36]的研究中，使用水或者螯合劑作為溶劑提取得到的果膠多糖均未發(fā)現(xiàn)大量的阿拉伯糖，而當(dāng)繼續(xù)使用堿溶液和還原劑對(duì)其繼續(xù)處理時(shí)，阿拉伯糖的含量顯著提高。同時(shí)，阿拉伯糖通常存在于RG I和RG II上支鏈的末端，其含量的變化也可以作為果膠多糖分子的分支程度的參考。黃秋葵酒渣果膠多糖中阿拉伯糖含量的增加可能表明其RG I或RG II結(jié)構(gòu)上的支鏈的增加。

果膠多糖中含量較高的結(jié)構(gòu)是HG、RG I和RG II。其中RG II的分子鏈較小，并且通常連接于HG的末端，所以在果膠多糖中的含量也較少。

表3 黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖物質(zhì)的量比例Table 3 Molar ratios between selected monosaccharide components in okra pectin and pectin from wine pomace

如表3所示，單糖的物質(zhì)的量比例可以反映果膠多糖分子結(jié)構(gòu)包括支鏈上的差異,黃秋葵果膠多糖具有很高比例的RG I組分，這可以從HG、RG I的比例或是Rha/GalA的比值（0.90）得出結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)中黃秋葵果膠多糖的RG I比例為91%，這與Sengkhamparn等[36]的研究結(jié)果（85%）基本一致。不同來源的果膠多糖其HG和RG I的比例不相同。黃秋葵果膠多糖的RG I比例要比其他植物的果膠多糖高很多，例如甜菜漿果膠多糖中RG I為22%[37]，蘋果為31.9%，大豆為43%[38]。黃秋葵酒渣果膠多糖的RG I組分為46.74%，低于黃秋葵果膠多糖的90%；其HG組分為16.76%，高于黃秋葵果膠多糖的2.21%。（Ara＋Gal）/Rha的比例可以反映RGI組分側(cè)鏈上的多糖數(shù)量，兩者的比值分別為2.54和3.29，這表明黃秋葵酒渣果膠多糖RG I的側(cè)鏈長(zhǎng)度或側(cè)鏈數(shù)量要大于黃秋葵果膠多糖RG I的側(cè)鏈。

3 結(jié) 論

黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的流變學(xué)性質(zhì)研究表明，黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的特性黏度分別為41.12 dL/g和4.66 dL/g，黏均分子質(zhì)量分別為1.466×106g/mol和2.470×105g/mol，黃秋葵經(jīng)過發(fā)酵后的酒渣果膠多糖特性黏度的降低，但兩者的Huggies常數(shù)相差不大，分別為0.59和0.55，說明2 種分子鏈都具有較好的柔性，同時(shí)也可以說明黃秋葵酒渣果膠多糖分子質(zhì)量的降低并沒有對(duì)分子鏈的柔性造成太大影響。流動(dòng)階梯實(shí)驗(yàn)顯示，黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖屬于非牛頓流體中的假塑性流體，具有剪切稀化現(xiàn)象，但沒有黃秋葵果膠多糖的剪切稀化現(xiàn)象明顯，黃秋葵酒渣果膠多糖這一特性使其非常適合用作食品的增稠劑。將流動(dòng)曲線擬合Cross模型，結(jié)合雙對(duì)數(shù)曲線得到黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的臨界質(zhì)量濃度c*約為4 g/dL，此時(shí)的分子空間占據(jù)量約為20，而黃秋葵果膠多糖并沒有臨界質(zhì)量濃度c*。振蕩實(shí)驗(yàn)顯示其線性黏彈區(qū)域在2%～10%內(nèi)均為線性。在振蕩實(shí)驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖是一種弱凝膠，沒有明顯的凝膠點(diǎn)。頻率掃描實(shí)驗(yàn)表明黃秋葵果膠多糖溶液的G’大于G’’，說明其更多的表現(xiàn)出彈性而非黏性；黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的G’’大于G’，其更多的表現(xiàn)出液體的黏性特征。Cox-Merz公式的擬合表明，黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖在低剪切速率下的復(fù)合黏度要大于穩(wěn)態(tài)剪切黏度，表明其分子之間可能有新的結(jié)構(gòu)生成，同時(shí)此結(jié)構(gòu)對(duì)穩(wěn)態(tài)剪切更為敏感。

黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的主要理化性質(zhì)研究表明：黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖酯化度分別為74.45%和55.817%，兩者均為高酯果膠，前者的酯化度明顯高于后者；從單糖組成可以看出，黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖均含有甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，這表明這2 種果膠多糖均屬于酸性雜多糖，7 種單糖組分分別占這兩種來源的果膠多糖的52.3%和54.7%。根據(jù)單糖組分計(jì)算得到黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的RG I組分分別為46.74%和90.00%，HG組分分別為16.76%和2.21%；兩者的（Ara+Gal）/Rha比值分別為3.29和2.54，表明黃秋葵酒渣果膠多糖RG I的側(cè)鏈長(zhǎng)度或側(cè)鏈數(shù)量要大于黃秋葵果膠多糖RG I的側(cè)鏈。本研究結(jié)果可為黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。